光漂白可实现前列腺素球菌中 ftsz 环的超分辨率成像

摘要

在这里, 我们描述了一种光漂白方法, 以减少蓝藻的自体荧光。光漂白后, 采用随机光学重建显微镜获得蓝藻 ftsz 环的三维超分辨率图像。

摘要

超分辨显微镜已被广泛用于研究许多生物体的蛋白质相互作用和亚细胞结构。然而, 在光合生物中, 超分辨率成像的横向分辨率仅为 ~ 100 纳米。低分辨率的主要原因是光合细胞的高自体荧光背景, 这是由高强度激光引起的, 而超强分辨率成像需要这些激光, 如随机光学重建显微镜 (storm)。在这里, 我们描述了一种光浸辅助 storm 方法, 该方法是最近开发的用于海洋皮亚星杆菌的成像。光漂白后, 有效地降低了红球菌的自体荧光, 使 storm 能够在横向分辨率 ~ 10 纳米的情况下进行。利用该方法, 我们获得了 ftsz 蛋白的体内三维 (三维) 组织, 并在红球菌的细胞周期中表征了四种不同的 ftsz 环形态。我们在这里描述的方法可以用于其他光合生物的超分辨率成像。

引言

超分辨率显微镜可以打破光的衍射极限, 并在亚衍射分辨率 (& lt; 200 nm) 内提供图像。它们已被广泛用于许多生物体的蛋白质定位和亚细胞结构的研究。主要的超分辨率显微镜方法包括结构照明显微镜 (sim)、受刺激的发射耗尽显微镜 (sted)、storm 和光激活定位显微镜 (palm)。这些超分辨率显微镜的机理和应用在^{其他地方已经审查了 1,2}。

storm 可以通过空间分离^3,4实现高达10纳米的分辨率。对于 storm, 只有一个分子在衍射有限的区域内被激活 ("开"), 其余的分子被保持灭活 ("关闭")。通过积累单个分子的快速开关, 可以生成一个 "衍射无限" 的图像 3.同时, storm 中还使用了多种有机染料和荧光蛋白, 使其易于从常规荧光显微镜升级到高分辨率显微镜^5,6。

storm 在光合细胞中没有得到广泛的应用, 如蓝藻、藻类和叶绿体⁷, 8 的植物细胞, 这是因为 storm 需要较高的激光强度来驱动光致敏化。高强度激光在光合细胞中激发强自体荧光背景, 干扰 storm 成像中的单分子定位。为了利用 storm 研究光合细胞中的亚细胞结构或蛋白质相互作用, 我们开发了一种光漂白协议来抑制背景自体荧光信号⁹。在常规的免疫荧光染色过程中, 标本在封堵步骤中暴露在高强度的白光下, 从而降低光合细胞的自体荧光, 以满足 storm 的要求。因此, 该协议使得用 storm 研究色素生物成为可能。

在这里, 我们描述了使用 storm 来成像 ftsz 环组织在单细胞的五氯球菌的协议。ftsz 是一种高度保守的管状细胞骨架蛋白, 它聚合在细胞¹⁰的周长周围形成环状结构 (z 环), 对细胞分裂11至关重要.保鲜的红球菌细胞首先被光导, 以减少自荧光背景和免疫染色与初级抗 ftsz 抗体, 然后继发抗兔 igg (h + l) 抗体与荧光结合 (例如。, 亚历克沙·福鲁尔 750)。最终, storm 被用来观察不同细胞周期阶段的古氯球菌中的详细 ftsz 环组织。

研究方案

1. 样品制备和固定

1. 接种1毫升的轴突性普绿球菌med4 至5毫升的海水原基^原发物12。在23°c 的光下生长红球菌培养, 强度为 35μmol photons/m m 2 s. 五天后, 将1毫升培养物收集成 1.5 ml 管。
   注: 接种五天后,红球菌med4 将达到后期日志阶段, 约 10^{8 细胞}, 这适合 storm 成像。
2. 将25% 的甲醛 (pfa) (wv) 和50% 戊二醛的2μl 加入 1.5 ml 管中, 将新鲜制备的甲醛切成 100μl, 以固定培养。在室温下在黑暗中孵化样品20分钟。
   注: 样品被保存在黑暗中固定, 因为戊二醛是光敏感的。
3. 以 13, 500 x克的速度将样品向下旋转 1分钟;然后, 去除上清液, 在 pro99 培养基¹²的100μl 中重新悬浮细胞。将样品存放在 4°c, 直到免疫染色。

2. 用聚苯乙烯珠预涂覆盖图

注: 聚苯乙烯微珠被认为是漂移校正的基准标记。

1. 涡流原来的小瓶聚苯乙烯珠, 并准备1:20000 稀释与50% 乙醇作为工作浆料。
2. 打开热板, 将温度设置为 120°c, 并将盖板放置在热板上。
3. 将100μl 的工作浆料加载到每个盖板上。将盖板在热盘上加加作用 10分钟, 然后小心地将盖板转移到 petri 培养皿中, 以便在室温下存放。
   注: 带有珠子的一侧应朝上, 细胞应连接在同一侧。这些珠子被固定在盖板上, 并用于在 storm 成像过程中实时校正样品漂移。固定珠子后, 盖板不能燃烧。

3. 聚 l-赖氨酸涂覆在珠子涂层覆盖片上

注: 这是为蓝藻细胞的固定化。

1. 在盖板的中心添加100μl 的聚 l-赖氨酸 (1 mg/ml), 并将镀珠的一侧朝上。让它在室温下坐30分钟。
2. 使用移液器仔细渴望未连接的聚 l-赖氨酸, 并将其转移到 1.5 ml 管。将多 l-赖氨酸保存在4°c 中, 以便重复使用。
3. 用10毫升的超滤水在60毫米的 petri 培养皿中冲洗盖板, 然后用纸巾将盖板短暂擦干。
4. 将盖板存放在培养皿 (100 毫米) 中, 供以后使用。为了防止盖板附着在盘子上, 用一层副虫将培养皿排成一行。
   注: 预先涂上珠子和聚 l-赖氨酸的盖板可在室温下储存至少半年。因此, 强烈建议提前准备一批盖板。

4. 在覆盖上固定细胞

1. 将预涂后的盖板转移到底部有副体的新培养皿中, 从今以后将被称为染色盘。将固定样品的100μl 加载在盖板上, 让它坐 30分钟, 以允许细胞附着。
2. 把盖板转移到一个12井盘子的井里, 从今以后, 这将被称为洗碗。在井中加入1毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) (10 mL_{na 2}hpo₄、1.8 mm kh 2 po 4、137 mmncl 和 2.7 mm kcl, ph 7.4) 来清洗盖板。取出 pbs 缓冲区, 并添加一个新的 pbs 缓冲区, 以再次清洗盖板。

5. 蓝藻细胞的渗透性

1. 使用移液器卸下 pbs 缓冲区。在洗涤盘的井中加入1毫升新鲜制备的渗透缓冲液, 其中含有0.05% 的非离子洗涤剂-100 (v/v)、10mm edta、10 mm tris (ph 8.0) 和 0.2 mgml lysozyme。
2. 在37°c 下将洗涤盘加氢20分钟。然后, 删除渗透缓冲。
3. 加入1毫升的 pbs 缓冲液, 并将洗碗放在振动台上, 将洗碗轻轻摇摇 5分钟. 取出 pbs 缓冲液。重复此步骤3x 来清洗盖板。

6. 叶绿素颜料在阻塞步骤中的光漂白

1. 将盖板转移到染色盘。在盖板顶部加入50μl 的阻滞剂, 其中含有 0.2% (v/v) 非离子洗涤剂-100 和 3% (v/v) 山羊血清。
2. 将整个染色板放在冰上, 并将其移动到氙气光源下进行至少60分钟的光漂白, 其光强为 1, 800μmol photons/m 2·s.
3. 光漂白和阻塞后, 用纸巾边缘吸附, 小心地去除封堵缓冲液。
   注: 光的强度非常高, 需要一副合适的太阳镜来保护眼睛。同时, 用铝箔包裹光源和板材, 避免光线泄漏, 以免造成眼睛损伤。每15分钟检查一次盖板, 以确保盖板保持湿润。如果盖液干燥, 请添加50μl 的阻滞剂。

7. 抗体结合

1. 根据制造商的说明, 在200μl的水中溶解抗 anabaena ftsz 抗体。
2. 将1μl 抗 ftsz 抗体稀释为99μl 的阻滞剂。在盖板上加入50μl 稀释的初级抗体, 在室温下孵育30分钟。
3. 把被单转移到洗碗上。加入1毫升的 pbs 缓冲液, 并将洗碗放在摇匀上。轻轻摇洗洗盘 5分钟. 重复此步骤3x 清洗盖板。
4. 将盖板转移到染色盘。将二级抗体的1μl 稀释为500μl 的阻滞剂。在盖板上加入50μl 稀释的二级抗体, 在室温下在黑暗中孵育30分钟。
5. 把被单转移到洗碗上。用1毫升的 pbs 缓冲液清洗振动台。轻轻摇摇洗碗 5分钟, 用铝纸将洗碗包起来, 使其防光。重复此步骤3x。
6. 将4% 的甲醛 (pfa) (w v) 新鲜制备的甲醛加入井中500μl。在室温下在黑暗中孵化盖板15分钟。
7. 取出甲醛并重复清洗步骤3x。
8. 将盖板存放在4°c 的 pbs 缓冲液中, 直到成像。

8. storm 成像缓冲器的制备

1. 根据表 1准备1毫升的成像缓冲区, 紧接 storm 成像之前。
   注: 由于成像缓冲器的保质期约为 2小时, 请在使用前准备好新鲜的。在添加葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶后, 避免涡旋。
   注意: 甲基维柴油是有毒物质。请特别小心地处理这件事。环孢克泰酯被列为致癌物质猫。1种化学物质。请避免吸入和皮肤接触, 并在化学罩中制作环甲酸盐的库存溶液和成像缓冲液。

9. storm 数据的图像采集

1. 在装载室中加载盖板 (图 1)。将新鲜制备的成像缓冲液轻轻装入室内, 以避免洗掉蓝藻细胞。将矩形盖板放置在成像缓冲器的顶部, 以防止其与空气中的氧气发生反应。避免在盖板下捕获气泡。
2. 打开相机、led 灯和激光。打开 storm 软件, 用于图像采集、质心位置确定和样品漂移校正¹³。
3. 在镜头顶部加入半滴浸入式油。加载腔内, 并确保目标的镜头与盖板接触。
4. 用750纳米激光检查信号。
   注: 始终包括第二个抗体-微小染色阴性控制, 以确保自身荧光减少。
5. 确定同时包含单元格和基准标记的示例区域。启动软件, 进行漂移校正示例。
   注: 一般情况下, 理想的样品区域包含10-30 细胞。同时, 细胞应很好地分离, 以避免任何重叠的细胞。
6. 获取一个广域图像作为参考, 相机电子乘法 (em) 增益为 300, 曝光时间为30毫秒 (图 2 a)。
7. 将750纳米激发激光强度提高到更高的功率, 约 4.5 kwcm²。一旦荧光体过渡到稀疏闪烁模式, 通过以 33 hz 收集 10, 000 帧来获取一个超分辨率图像 (图 2b)。
   注: 如果荧光体不是孤立的, 请等待几分钟, 直到更多的荧光体切换到暗态, 分离的单个分子依次闪烁。此处描述的帧数适用于我们的示例, 需要针对其他目标结构进行优化。

10. 重建原始数据中的超分辨率图像

1. 在 imagej 中使用一个名为"快速 palm ( 材料表")¹⁴的插件来重建三维颜色超分辨率图像。
   注: 将出现一个初步的彩色图像 (图 2c) 以及彩色编码的刻度条 (图 2c)。颜色表示 z 轴上的深度。
2. 为了演示视频中的三维结构, 请使用快速 palm14 每10纳米构造一叠带有 z 轴分割的超分辨率图像。调整堆栈的亮度并复制一个目标单元格的堆栈。在 imagej 中使用名为3d 查看器(材料表)¹⁵的插件生成单元格的三维图像。记录三维结构的旋转, 以便进行演示。

结果

storm 通过随机激活单个可光敏荧光体来实现超分辨率成像。记录每个荧光体的位置, 然后根据这些位置构建一个超分辨率图像⁴。因此, 荧光体定位的精度对于超分辨率图像重建具有重要意义。在447 纳米和680纳米的峰值和在波长大于700纳米16时, 普罗氯球菌的吸收光谱具有最低吸收.然而, 当暴露在750纳米激光的极高强度 (

讨论

在该协议中, 我们描述了一个程序, 以显著减少原蓝菌的自体荧光 (图 3c), 然后, 免疫抑制细胞中的蛋白质, 使我们能够利用 storm 来研究三维 ftsz在古氯球菌环形态(图 4)。该协议可用于其他光合生物的超分辨率成像。

以往对光合生物的研究主要是使用 sim 卡实现超分辨率成像, 因为 sim 不需要高强度的激光。然而, sim 的空...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polystyrene particles	Spherotech	PP-20-10	2.0-2.4 µm
Coverslip	Marienfeld	0111580	18 mm ∅, Thickness No. 1
Ethanol	Scharlau	ET00021000
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P9155	mol wt 70,000-150,000
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Glutaraldehyde solution, 50%	Sigma-Aldrich	340855
PBS	Sigma	P3813
Triton X-100	Sigma	T8787
EDTA Disodium Salt, 2-hydrate	Gold biotechnology	E-210-500
Trizma base	Sigma	T1503
Lysozyme	Sigma	L6876
Goat serum	Sigma	G9023
anti-Anabaena FtsZ antibody	Agrisera	AS07217
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Life Technologies	A-21039	conjugated with Alexa Fluor 750
D-Glucose Anhydrous	Fisher Scientific	D16-1
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960
Methyl Viologen	Sigma-Aldrich	856177
Cyclooctatetraene	Sigma-Aldrich	138924
tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	646547
Glucose Oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
XD-300 Xenon light source			250 W
STORM microscope	NBI	SRiS microscope
Rohdea	NBI	SRiS 3.0	software for imaging acquisition
Luna	NBI	SRiS 3.0	software for drifting correction
QuickPALM			https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis
3D Viewer			http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home