Photobleaching은 Cyanobacterium Prochlorococcus 에서 FtsZ 반지의 슈퍼 해상도 이미징 가능

요약

여기 우리는 박테리아의 autofluorescence를 줄이기 위해 photobleaching 메서드를 설명 합니다. Photobleaching, 후 확률적 광학 재건 현미경 cyanobacterial FtsZ 반지의 3 차원 슈퍼 해상도 이미지를 얻을 하는 데 사용 됩니다.

초록

슈퍼 해상도 현미경은 단백질 상호 작용 및 많은 유기 체에서 subcellular 구조 연구에 널리 사용 되었습니다. 그러나 광합성 유기 체,, 슈퍼 해상도 영상의 가로 해상도만 ~ 100 nm. 낮은 해상도 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍) 등 슈퍼 해상도 영상에 필요한 고 강도 레이저에 의해 발생 하는 광합성 세포의 높은 autofluorescence 배경 때문 이다. 여기, 우리는 photobleaching 기반 폭풍 방법을 개발 된 최근 해양 picocyanobacterium Prochlorococcus이미징 기술. Photobleaching, 후 Prochlorococcus 의 autofluorescence는 효과적으로 감소 그 폭풍 ~ 10의 측면 분해능으로 수행할 수 있도록 nm. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 FtsZ 단백질의 조직에 vivo에서 3 차원 (3 차원)을 취득 하 고 Prochlorococcus의 세포 주기 동안 4 개의 다른 FtsZ 반지 형태학 특성. 우리는 여기에 설명 하는 방법 다른 광합성 유기 체의 슈퍼 해상도 이미징에 대 한 채택 될 수도 있습니다.

서문

슈퍼 해상도 microscopies 빛의 회절 한계를 휴식 하 고 하위 회절 해상도 (< 200 nm) 내에서 이미지를 제공할 수 있습니다. 그들은 널리 사용 되었습니다 많은 유기 체에서 단백질 지 방화 및 subcellular 구조 공부 하. 슈퍼 해상도 현미경 방법 등 구조화 조명 현미경 (SIM)를 주요 자극 방출 소모 현미경 (호텔 위치), 폭풍, 그리고 photoactivated 지역화 현미경 검사 법 (종 려). 메커니즘 및 응용 프로그램의 이러한 슈퍼 해상도 현미경 되었습니다 다른^1,2검토.

폭풍 10 높은 해상도 달성할 수 있다 공간 분리^3,4nm. 폭풍, 회절 제한 된 지역 내에서 하나의 분자 ("에") 활성화 되 고 분자의 나머지 ("off") 사 유지 됩니다. 단일 분자의-와 급속 한 스위치에의 축적, "회절 무제한" 이미지 생성된³수 있습니다. 한편, 많은 종류의 유기 염료 및 형광 단백질 고해상도 현미경^5,6일반 형광 현미경 검사 법에서 쉽게 업그레이드할 수 있도록 폭풍에 적용 됩니다.

폭풍은 널리 적용 되지 광합성 세포, 박테리아, 조류, 등에서 하며 식물 세포 엽록체^7,8, 사실 그 폭풍은 드라이브 photoswitching 높은 레이저 강도. 고 강도 레이저 형편이 나쁘게 광합성 세포에 강한 autofluorescence 배경 흥분 하며 폭풍 영상에서 단일 분자 지역화 방해 합니다. 폭풍우를 사용 하 여 subcellular 구조 또는 광합성 세포에 있는 단백질 상호 작용을 조사 하려면, 우리는 배경 autofluorescence 신호⁹를 풀기 위해 photobleaching 프로토콜을 개발 했다. 일상적인 immunofluorescent 얼룩 절차에서는 표본 단계에서 차단, 폭풍에 대 한 요구 사항에 맞게 광합성 세포의 autofluorescence를 절감 하 고 강도의 하얀 빛에 노출 됩니다. 따라서,이 프로토콜은 폭풍 안료 생물 조사 가능 합니다.

여기, 우리는 폭풍 FtsZ 반지 조직 단 세포 picocyanobacterium Prochlorococcus에서 이미지를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. FtsZ 반지 구조 (Z 반지) 셀¹⁰ 의 둘레를 polymerizes 이며¹¹세포 분열 필수적인 매우 보존된 tubulin 같은 cytoskeletal 단백질 이다. Prochlorococcus 유지은 autofluorescent 배경 및 기본 안티-FtsZ 항 체와 immunostained을 줄이기 위해 첫 번째 photobleached와 보조 반대로 토끼 (H + L) IgG 항 체는 fluorophore와 활용은 다음 (예: , 알 렉 사 Fluor 750). 결국, 폭풍우는 다른 세포 주기 단계 동안 Prochlorococcus 에서 자세한 FtsZ 반지 단체를 관찰 하는 데 사용 됩니다.

프로토콜

1. 샘플 준비 및 고정

1. 해 수 기반 Pro99 중간¹²의 5 mL을 axenic Prochlorococcus MED4의 1 mL 접종 5 일 후 35 µmol 광자/m²s의 진도 빛 아래 23 ° C에서 Prochlorococcus 문화 성장, 1.5 mL 튜브에 문화의 1 mL를 수집 합니다.
   참고:는 접종 후 5 일 Prochlorococcus MED4 도달 한다 늦은 로그 단계, 약 10⁸ 셀/mL, 폭풍 이미징에 대 한 적절 한입니다.
2. 문화를 해결 하기 위해 1.5 mL 튜브에 갓 25 %paraformaldehyde (PFA) (w/v)에서 준비 하는 포름알데히드의 100 µ L, 50% 글의 2 µ L를 추가 합니다. 20 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 샘플을 품 어.
   참고: 샘플은 유지 고정을 위한 어둠 속에도 빛 때문에 민감한.
3. 스핀 1 분; 13500 x g 에서 샘플 다운 그리고는 상쾌한 제거 resuspend Pro99 중간¹²의 100 µ L에 셀. Immunostaining까지 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.

2. 폴리스 티 렌 구슬 Coverslip precoating

참고: 폴리스 티 렌 구슬 드리프트 보정을 위한 표준 표식으로 간주 됩니다.

1. 소용돌이 원래 폴리스 티 렌 구슬의 유리병 및 준비 작업 슬러리로 50% 에탄올 1:20,000 희석.
2. 핫 플레이트, 온도 120 ° C를 설정 켜고 coverslips 뜨거운 접시에 놓습니다.
3. 각 coverslip에 작업 슬러리의 100 µ L를 로드 합니다. 10 분 동안 뜨거운 접시에 coverslip 품 어 하 고, 실내 온도에 저장에 대 한 접시에는 coverslips를 신중 하 게 전송.
   참고: 그것에 붙어 있던 구슬 가진 측, 직면 한다 그리고 셀 같은 쪽에 붙어 있어야 한다. 구슬은 coverslips에 움직일 수 있으며 샘플에 떠도는 수정 사용 폭풍 이미징 동안 실시간. 구슬 immobilizing, 후에 coverslips는 불 수 없습니다.

3. 폴 리-L-리 신 구슬 코팅 Coverslip에의 코팅

참고:이 cyanobacterial 셀의 동원 정지에 대 한 이루어집니다.

1. 비드 코팅 면이는 coverslip의 중심으로 폴 리-L-리 신 (1 mg/mL)의 100 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 30 분 동안 앉아 보자.
2. 한 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 첨부 되지 않은 폴 리-L-lysine을 열망 하 고 1.5 mL 튜브에 그것을 전송. 폴 리-L-리 신 다시 4 ° C에서 저장 합니다.
3. 60 mm 페 트리 접시에 coverslip 울트라 필터링 물 10 mL로 씻어 고 간단히 종이 타월에 coverslip 건조.
4. coverslip 나중 사용을 위해 페 트리 접시 (100 mm)에 저장 합니다. 요리 하는 coverslip의 첨부 파일을 방지 하기 위해 라인 parafilm의 레이어와 페 트리 접시.
   참고: 구슬와 폴 리-L-리 신, 도장된 coverslip 저장할 수 있습니다 실내 온도에 적어도 절반 년. 따라서, 사전에 coverslips의 배치를 준비 하 고 좋습니다.

4입니다.는 Coverslip 셀의 동원 정지

1. 도장된 coverslip parafilm 참조 됩니다 얼룩 접시로 이제부터 아래쪽으로 새로운 배양 접시에 전송. 하는 coverslip에 고정된 샘플의 100 µ L 로드 셀 첨부 파일을 허용 하도록 30 분 동안 앉아 보자.
2. 것입니다 라고를 세척 접시 이제부터 12-잘 접시의 우물에는 coverslip 전송. coverslip 씻어 잘에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (10 m m 나₂HPO₄, 1.8 m m KH₂포₄, 137 m m NaCl, 그리고 2.7 m m KCl, pH 7.4)의 1 mL를 추가 합니다. PBS 버퍼를 제거 하 고 다시는 coverslip 씻어 새로운 PBS 버퍼를 추가 합니다.

5입니다. permeabilization Cyanobacterial 셀의

1. 피 펫을 사용 하 여 PBS 버퍼를 제거 합니다. 0.05% 비 이온 세제-100 (v/v), 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8.0), 및 0.2 mg/mL lysozyme 세척 접시의 우물에 갓된 permeabilization 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.
2. 20 분 동안 37 ° C에 세척 접시를 품 어. 그런 다음 permeabilization 버퍼를 제거 합니다.
3. 1 mL의 PBS 버퍼를 추가 하 고 5 분 제거 PBS 버퍼에 대 한 부드럽게 세척 접시를 쉐이크 통에 세척 접시를 놓습니다. 이 단계는 coverslip 씻어 3 배를 반복 합니다.

6. 엽록소의 Photobleaching 차단 단계에서 안료

1. 얼룩 요리 하는 coverslip 전송. 0.2% (v/v) 비 이온 세제-100과는 coverslip 상단 3% (v/v) 염소 혈 청 블로킹 버퍼의 50 µ L를 추가 합니다.
2. 얼음에 플레이트를 얼룩 전체 놓고 1800 µmol 광자/m²·s에 광도와 크 세 논 빛 소스 적어도 60 분 동안 photobleaching에 대 한 이동 합니다.
3. Photobleaching 후에 차단, 조심 스럽게 종이 타월의 가장자리와 adsorbing 여 블로킹 버퍼를 제거.
   참고: 크 세 논 빛의 강도 너무 높은 적절 한 선글라스의 쌍 눈 보호를 위해 필요 하다. 한편, 광원 및 알루미늄 호 일을 사용 하 여 눈 손상 될 수 있는 빛의 누수를 방지 하려면 접시 포장. coverslip 촉촉한 유지 되도록 coverslip 매 15 분을 확인 합니다. 건조는 coverslip 이면 차단 버퍼의 50 µ L를 추가 합니다.

7. 항 체 바인딩

1. 안티-Anabaena FtsZ 항 체 제조업체의 지침에 따라 물 200 µ L에 녹.
2. 블로킹 버퍼의 99 µ L로 안티 FtsZ 항 체의 1 µ L를 희석. coverslip에 희석된 주 항 체의 50 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 실내 온도에 그것을 품 어.
3. 세척 접시는 coverslip 전송. 1 mL의 PBS 버퍼를 추가 하 고 쉐이크에 세척 접시를 놓습니다. 부드럽게 흔들어 세척 접시 5 분 반복에 대 한이 단계는 coverslip 씻어 3 배.
4. 얼룩 요리 하는 coverslip 전송. 블로킹 버퍼의 500 µ L로 이차 항 체의 1 µ L를 희석. coverslip에 희석된 이차 항 체의 50 µ L을 추가 하 고 실 온에서 어둠 속에서 30 분 동안 품 어.
5. 세척 접시는 coverslip 전송. 통에 PBS 버퍼의 1 mL와 함께 그것을 씻어. 부드럽게 흔들 5 분 랩에 대 한 세척 접시 광선이 있도록 알루미늄 종이로 세척 접시. 3 x이이 단계를 반복 합니다.
6. 우물에 갓 4 %paraformaldehyde (PFA) (w/v)에서 준비 하는 포름알데히드의 500 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 어둠 속에서 15 분 동안 coverslip 품 어.
7. 포름알데히드를 제거 하 고 세척 단계 3를 반복.
8. 영상까지는 coverslip 어둠 속에서 4 ° C에서 PBS 버퍼에 저장 합니다.

8입니다. 버퍼 이미징 폭풍의 준비

1. 바로 폭풍 영상 앞 표 1에 따라 버퍼 이미징의 1 mL를 준비 합니다.
   참고: 이미지 버퍼의 수명 약 2 시간으로, 준비 신선한 사용 하기 바로 전에. 포도 당 산화 효소 및 catalase의 추가 후에 vortexing를 하지 마십시오.
   주의: 메 틸 비올로겐은 유독한 물자 이다. 특히 신경을 처리 하시기 바랍니다. Cyclooctatetraene는 고양이 발암 물질로 분류 된다. 1 화학입니다. 제발 흡입을 방지 하 고 피부 접촉 화학 후드에서 cyclooctatetraene 재고 솔루션 및 이미징 버퍼를 만들.

9. 이미지 수집 스톰 데이터

1. 로드 로드 챔버 (그림 1)에 coverslip. 부드럽게 cyanobacterial 세포 세척 피하려고 챔버로 갓된 이미징 버퍼를 로드 합니다. 공기에 있는 산소와의 반응을 방지 하기 위해 이미징 버퍼 상단 직사각형 coverslip 장소. 아래는 coverslip 트랩 공기 방울을 피하십시오.
2. 카메라, LED 조명과 레이저를 켭니다. 이미지 수집, 중심 위치 결정 및 보정¹³표류 하는 샘플에 대 한 오픈 폭풍 소프트웨어.
3. 렌즈 위에 침수 기름 반 방울을 추가 합니다. 챔버를 로드 하 고 있는지 확인 하십시오 목표의 렌즈는 coverslip와 접촉 하는 게.
4. 750 nm 레이저로 신호를 검사 합니다.
   참고: 항상는 autofluorescence 감소 되도록 두 번째 항 체 마이너스 얼룩 네거티브 컨트롤을 포함 합니다.
5. 셀 및 표준 마커를 포함 하는 샘플 영역을 식별 합니다. 보정을 표류 하는 샘플에 대 한 소프트웨어를 시작 합니다.
   참고: 일반적으로, 이상적인 샘플 영역 10-30 셀을 포함합니다. 한편, 셀 겹치는 셀을 피하기 위해를 잘 분리 되어야 한다.
6. 기준으로 한 넓은 필드 이미지 획득, 카메라 전자 곱셈 (EM)와 300와 30 ms (그림 2A)의 노출 시간에 얻을.
7. 높은 전력, 약 4.5 kW/c m²을 750 nm 여기 레이저 강도 증가. fluorophores 스파스 점멸 패턴으로 전환 했습니다, 일단 33 Hz (그림 2B)에서 10000 프레임을 수집 하 여 하나의 슈퍼 해상도 이미지를 얻을.
   참고:는 fluorophores 절연 하지 않으면, 몇 분 더 fluorophores 어두운 상태로 전환 되 고 고립 된 단일 분자 순서 대로 깜박일 때까지 기다립니다. 여기에 설명 된 프레임 수 샘플에 적합 하 고 다른 대상된 구조에 대 한 최적화가 필요 합니다.

10. 원시 데이터에서 슈퍼 해상도 이미지의 재구성

1. ImageJ QuickPALM (테이블의 재료)¹⁴ 라는 플러그인을 사용 하 여 3 차원 컬러 슈퍼 해상도 이미지를 재구성 하.
   참고:는 예비 색채 이미지 (그림 2C) 색된 스케일 바 (그림 2C) 나타납니다. 색에는 z 축 깊이 나타냅니다.
2. 3 차원 비디오, 구문에서 슈퍼 해상도의 스택 구조를 설명 하기 위해 z 축 이미지 구분 마다 10 nm QuickPALM¹⁴를 사용 하 여. 스택의 밝기를 조정 하 고 복제 한 대상 셀의 스택. ImageJ 3D 뷰어 (자료 테이블)¹⁵ 라는 플러그인을 사용 하 여 셀의 3 차원 이미지를 생성. 데모에 대 한 3 차원 구조의 회전을 기록 합니다.

결과

폭풍 확률론 개별 photoswitchable fluorophores를 활성화 하 여 슈퍼 해상도 이미지를 달성 한다. 각 fluorophore의 위치를 기록 하 고 슈퍼 해상도 이미지 다음이 위치⁴에 따라 만들어집니다. 따라서, fluorophore 위치 정밀도 슈퍼 해상도 이미지 재건을 위해 중요 하다. 447 Prochlorococcus 의 흡수 스펙트럼 피크 및 680 nm,그리고 Prochlorococcus는 최소 흡수 700 nm

토론

이 프로토콜에서 설명 하는 cyanobacterium Prochlorococcus (그림 3C)의 autofluorescence를 크게 감소 하는 절차와, 다음, immunostain 공부 3 차원 FtsZ 폭풍을 활용 수 있게 세포에 있는 단백질 반지 Prochlorococcus (그림 4)에서 형태학. 이 프로토콜은 슈퍼 해상도 영상 다른 광합성 유기 체에 대 한 채택 될 수도 있습니다.

광합성 유기 체에...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polystyrene particles	Spherotech	PP-20-10	2.0-2.4 µm
Coverslip	Marienfeld	0111580	18 mm ∅, Thickness No. 1
Ethanol	Scharlau	ET00021000
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P9155	mol wt 70,000-150,000
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Glutaraldehyde solution, 50%	Sigma-Aldrich	340855
PBS	Sigma	P3813
Triton X-100	Sigma	T8787
EDTA Disodium Salt, 2-hydrate	Gold biotechnology	E-210-500
Trizma base	Sigma	T1503
Lysozyme	Sigma	L6876
Goat serum	Sigma	G9023
anti-Anabaena FtsZ antibody	Agrisera	AS07217
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Life Technologies	A-21039	conjugated with Alexa Fluor 750
D-Glucose Anhydrous	Fisher Scientific	D16-1
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960
Methyl Viologen	Sigma-Aldrich	856177
Cyclooctatetraene	Sigma-Aldrich	138924
tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	646547
Glucose Oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
XD-300 Xenon light source			250 W
STORM microscope	NBI	SRiS microscope
Rohdea	NBI	SRiS 3.0	software for imaging acquisition
Luna	NBI	SRiS 3.0	software for drifting correction
QuickPALM			https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis
3D Viewer			http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home