Immunofluoreszenz ermöglicht Höchstauflösung Bildgebung des FtsZ Ring in Cyanobacterium Prochlorococcus

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Immunofluoreszenz-Methode, um die Autofluoreszenz der Cyanobakterien zu reduzieren. Nach Immunofluoreszenz wird stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie verwendet, um dreidimensionale Höchstauflösung Bilder der Cyanobakterien FtsZ Ring zu erhalten.

Zusammenfassung

Höchstauflösung Mikroskopie hat am meisten benutzt, um Protein-Interaktionen und subzelluläre Strukturen in vielen Organismen zu studieren. In photosynthetischen Organismen ist die laterale Auflösung des Super-Auflösung jedoch nur ~ 100 nm. Die geringe Auflösung ist vor allem aufgrund des hohen Autofluoreszenz Hintergrundes der photosynthetischen Zellen verursacht durch hochintensive Laser, die für die Super-Resolution Imaging, wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm) erforderlich sind. Hier beschreiben wir eine Immunofluoreszenz-gestützte Sturm Methode, die entwickelt wurde vor kurzem für die marine Picocyanobacterium Prochlorococcusimaging. Nach Immunofluoreszenz, die Autofluoreszenz Prochlorococcus wird effektiv reduziert, sodass dieser Sturm mit einer lateralen Auflösung von ~ 10 erfolgen kann nm. Mit dieser Methode wir die Organisation in Vivo dreidimensionale (3D), der das Protein FtsZ erwerben und vier verschiedene FtsZ Ring Morphologien während des Zellzyklus Prochlorococcuscharakterisieren. Die Methode, die wir hier beschreiben könnte für die Super-Resolution Imaging anderer photosynthetischen Organismen verabschiedet werden.

Einleitung

Super-Resolution Microscopies können brechen die Beugungsgrenze des Lichts und Bilder innerhalb Sub Beugung Auflösungen (< 200 nm). Sie haben in vielen Organismen verbreitet, um Protein-Lokalisierung und subzelluläre Strukturen zu studieren. Großen Höchstauflösung Mikroskopieverfahren umfassen strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM), stimulierte Emission Depletion Mikroskopie (STED), Sturm und photoaktiviert Lokalisierung Mikroskopie (PALM). Die Mechanismen und Anwendungen diese Super-Resolution Mikroskope wurden überprüft an anderer Stelle^1,2.

Sturm erreichen eine Auflösung bis zu 10 nm durch räumliche Trennung^3,4. Für Sturm nur ein Molekül in einer Beugung begrenzte Region ("on") aktiviert ist und der Rest der Moleküle sind inaktivierte ("off") gehalten. Durch eine Anhäufung der schnellen ein- und - Ausschalten einzelner Moleküle kann ein "Beugung-unlimited" Bild generierten³sein. Inzwischen sind viele Arten von organischen Farbstoffen und fluoreszierende Proteine anwendbar im Sturm, so dass ein einfaches Upgrade von regelmäßigen Fluoreszenzmikroskopie hochauflösender Mikroskopie^5,6.

Sturm ist nicht weit in den photosynthetischen Zellen, wie z. B. Cyanobakterien, Algen, angewendet und pflanzlichen Zellen mit Chloroplasten^7,8, die aufgrund der Tatsache, dass Sturm ist erfordert hohe Laserintensität auf Laufwerk Photoswitching. Hochintensive Laser ungünstig reizt stark Autofluoreszenz Hintergrund in photosynthetischen Zellen und stört die Einzelmolekül-Lokalisierung in der Sturm-Bildgebung. Um mit Sturm der subzellulären Strukturen oder Protein-Interaktionen in photosynthetischen Zellen untersuchen, entwickelten wir ein Immunofluoreszenz-Protokoll, um den Hintergrund Autofluoreszenz Signale⁹zu stillen. In eine Routine immunofluorescent Färbeverfahren sind Exemplare weißes Licht von hoher Intensität während der Blockierungsschritt ausgesetzt, die die Autofluoreszenz des photosynthetischen Zellen zu den Anforderungen für Sturm senkt. So, dieses Protokoll macht es möglich, pigmentierte Organismen mit Sturm zu untersuchen.

Hier beschreiben wir das Protokoll Sturm zu verwenden, um die FtsZ Ring-Organisation in der einzelligen Picocyanobacterium ProchlorococcusBild. FtsZ ist ein hoch konservierte Tubulin-ähnliche Zellskelett Protein die polymerisiert um eine Ringstruktur (Z-Ring) um den Umfang einer Zelle¹⁰ zu bilden und ist wichtig für die Zellteilung¹¹. Erhalten Prochlorococcus Zellen sind die ersten Photobleached zur Verringerung der Autofluorescent Hintergrund und Immunostained mit einem primären Anti-FtsZ Antikörper, und dann eine Sekundärantikörper Anti-Kaninchen-IgG (H + L) ist mit einem Fluorophor konjugiert (z.B. , Alexa Fluor 750). Schließlich wird Sturm verwendet, um die detaillierte FtsZ Ring Organisationen in Prochlorococcus in verschiedenen Zellzyklus Phasen zu beobachten.

Protokoll

1. Probieren Sie Vorbereitung und Fixierung

1. 1 mL axenic Prochlorococcus MED4 bis 5 mL des Meerwasser-basierte Pro99 mittlere¹²zu impfen. Wachsen Sie Prochlorococcus Kulturen bei 23 ° C unter dem Licht mit einer Intensität von 35 µmol Photonen/m²s. fünf Tage später, sammeln Sie 1 mL der Kultur in einer 1,5-mL-Tube.
   Hinweis: Fünf Tage nach der Inokulation, Prochlorococcus MED4 erreichen die späten Log-Phase mit etwa 10⁸ Zellen/mL, die eignet sich für Sturm Bildgebung.
2. Fügen Sie 100 µL frisch zubereitet aus 25 % Paraformaldehyd (PFA) (w/V) Formaldehyd und 2 µL 50 % Glutaraldehyd in der 1,5-mL-Tube, die Kultur zu beheben. Inkubieren Sie die Probe im Dunkeln bei Raumtemperatur für 20 min.
   Hinweis: Die Probe war im Dunkeln zur Fixierung gehalten weil Glutaraldehyd Licht empfindlich.
3. Spin-down der Probe bei 13.500 X g für 1 min; dann entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der Zellen in 100 µL der Pro99 mittlere¹². Speichern Sie das Sample bei 4 ° C bis Immunostaining.

(2) Anschwemmung des Deckglases mit Polystyrol-Kügelchen

Hinweis: Polystyrol Perlen gelten als die treuhändische Marker für Drift-Korrektur.

1. Wirbel der Original Fläschchen von Polystyrol-Kügelchen und bereiten eine Verdünnung von 1: 20.000 mit 50 % Ethanol als Gülle arbeiten.
2. Schalten Sie die Herdplatte, stellen Sie die Temperatur auf 120 ° C und legen Sie Deckgläsern auf die heiße Platte.
3. Laden Sie 100 µL arbeiten Gülle auf jeder Deckglas. Inkubieren Sie das Deckglas auf der Heizplatte für 10 min, und übertragen Sie dann sorgfältig die Deckgläsern, Petri-Schalen für die Lagerung bei Raumtemperatur.
   Hinweis: Sollte die Seite mit den Perlen befestigt, um es nach oben, und die Zellen sollten auf der gleichen Seite angebracht werden. Die Perlen sind auf den Deckgläsern immobilisiert und verwendet für die Korrektur der Probe-treiben in Echtzeit während der Sturm Bildgebung. Nach Immobilisierung der Perlen, können nicht die Deckgläsern geflammt.

3. Beschichtung von Poly-L-Lysin auf der Wulst-beschichtete Deckglas

Hinweis: Dies geschieht für die Immobilisierung von Cyanobakterien Zellen.

1. Das Zentrum von dem Deckglas fügen Sie 100 µL der Poly-L-Lysin (1 mg/mL hinzu) mit der Wulst-beschichteten Seite nach oben. Lassen Sie es für 30 min bei Raumtemperatur.
2. Verwenden Sie eine Pipette, um sorgfältig streben die ungebundene Poly-L-Lysin und überträgt es auf eine 1,5-mL-Tube. Speichern Sie Poly-L-Lysin bei 4 ° C zur Wiederverwendung.
3. Spülen Sie das Deckglas mit 10 mL Ultra-gefiltertes Wasser in einer 60 mm Petrischale und dann kurz trocknen Sie das Deckglas auf einem Papiertuch.
4. Speichern Sie das Deckglas in eine Petrischale (100 mm) zur späteren Verwendung. Um die Anlage das Deckglas auf den Teller zu verhindern, säumen Sie die Petrischale mit einer Schicht aus Parafilm.
   Hinweis: Das Deckglas, vorbeschichteten mit Perlen und Poly-L-Lysin, kann für mindestens ein halbes Jahr bei Raumtemperatur gelagert werden. Daher wird dringend empfohlen, einen Stapel von Deckgläsern im Voraus vorbereiten.

(4) Immobilisierung von Zellen auf das Deckglas

1. Übertragen Sie ein vorbeschichteten Deckglas auf eine neue Petrischale mit Parafilm an der Unterseite, die die Färbung Gericht fortan genannt wird. Laden Sie 100 µL der festen Probe auf dem Deckglas zu und lassen Sie es für 30 min um Zelle Anlage ermöglichen.
2. Übertragen Sie das Deckglas zu einem Brunnen eine 12-Well-Platte, die die Wäsche-Schüssel fortan genannt wird. Fügen Sie 1 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl und 2,7 mM KCl, pH 7,4) zum Brunnen, um das Deckglas zu waschen. Entfernen Sie die PBS-Puffer zu und fügen Sie einen neuen PBS-Puffer um das Deckglas wieder waschen.

5. Permeabilisierung der Cyanobakterien Zellen

1. Entfernen Sie die PBS-Puffer mit einer Pipette. Der Brunnen der Schale waschen, die 0,05 % nicht-ionische Waschmittel-100 (V/V), 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8,0) und 0,2 mg/mL Lysozym enthält fügen Sie 1 mL frisch zubereitete Permeabilisierung Puffer hinzu.
2. Inkubieren Sie die Wäsche-Schüssel bei 37 ° C für 20 min. Entfernen Sie dann die Permeabilisierung Puffer.
3. Fügen Sie 1 mL PBS-Puffer und einen Shaker, welcher sanft die Wasch-Schale schüttelt für 5 min. entfernen den PBS-Puffer setzen Sie waschen Schale auf. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 X das Deckglas zu waschen.

6. Immunofluoreszenz des Chlorophylls Pigmente in einem Schritt blockieren

1. Übertragen Sie das Deckglas auf den befleckenden Gericht. Fügen Sie 50 µL blocking-Puffer, enthält 0,2 % (V/V) nichtionische Waschmittel-100 und 3 % (V/V) Ziegenserum, auf der Oberseite des Deckglases.
2. Stelle das ganze Platte auf Eis Färbung und verschieben Sie es unter der Xenon-Lichtquelle für Immunofluoreszenz für mindestens 60 min, mit einer Lichtstärke bei 1.800 µmol Photonen/m²·s.
3. Entfernen Sie nach Immunofluoreszenz und blockieren vorsichtig den blockierenden Puffer von am Rand von einem Papiertuch adsorbierenden.
   Hinweis: Die Intensität des Xenon-Lichts ist so hoch, dass ein paar richtige Sonnenbrille zum Schutz der Augen benötigt wird. Wickeln Sie unterdessen die Lichtquelle und die Platte mit Alu-Folie um zu vermeiden, das Austreten von Licht, die Augenschäden verursachen. Überprüfen Sie das Deckglas alle 15 min um sicherzustellen, dass das Deckglas feucht bleibt. Wenn das Deckglas trocken ist, fügen Sie 50 µL blocking-Puffer.

7. die Antikörperbindung

1. Anti -Anabaena FtsZ Antikörper in 200 µL des Wassers entsprechend den Anweisungen des Herstellers zu lösen.
2. Verdünnen Sie 1 µL Anti-FtsZ Antikörper in 99 µL blocking-Puffer. Fügen Sie 50 µL verdünnter Primärantikörper auf das Deckglas und bei Zimmertemperatur 30 min inkubieren.
3. Übertragen Sie das Deckglas auf den Teller waschen. Fügen Sie 1 mL PBS-Puffer und legen Sie die Wäsche-Schüssel auf einen Shake. Schütteln Sie vorsichtig waschen Schale für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 X das Deckglas zu waschen.
4. Übertragen Sie das Deckglas auf den befleckenden Gericht. Verdünnen Sie 1 µL eines sekundären Antikörpers in 500 µL blocking-Puffer. Fügen Sie 50 µL verdünnter Sekundärantikörper auf das Deckglas und 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Übertragen Sie das Deckglas auf den Teller waschen. Waschen Sie es mit 1 mL PBS-Puffer in einen Shaker geben. Schütteln Sie vorsichtig waschen Schale für 5 min. wickeln die Wasch-Schale mit Aluminium Papier zu machen, lichtdicht. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 X.
6. Die gut fügen Sie 500 µL von Formaldehyd, frisch zubereitet aus 4 % Paraformaldehyd (PFA) (w/V hinzu). Inkubieren Sie das Deckglas für 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.
7. Entfernen Sie das Formaldehyd und wiederholen Sie Waschschritt 3 X.
8. Lagern Sie das Deckglas bis zur Bildgebung in PBS-Puffer bei 4 ° C im Dunkeln.

8. Vorbereitung des Sturms Imaging-Puffer

1. Bereiten Sie 1 mL Puffer nach Tabelle 1, unmittelbar vor dem Sturm-Bildgebung imaging vor.
   Hinweis: Da die Haltbarkeit des Puffers bildgebenden ca. 2 h ist, bereiten Sie es frisch, direkt vor der Verwendung. Vermeiden Sie aufschütteln nach Zugabe von Glukose-Oxidase und Katalase.
   Achtung: Methyl-Viologen ist giftiges Material. Bitte gehen sie mit besonderer Sorgfalt. Cyclooctatetraene ist als Karzinogen der Katze eingestuft. 1 chemische. Bitte nicht einatmen und Hautkontakt und machen das Cyclooctatetraene Stammlösung und bildgebenden Puffer in einer chemischen Kapuze.

9. Bild Erfassung von Sturm

1. Laden Sie das Deckglas in den Füllraum (Abbildung 1). Laden Sie die frisch zubereiteten bildgebenden Puffer sanft in die Kammer zu vermeiden, waschen Sie die Cyanobakterien Zellen. Legen Sie ein rechteckiges Deckglas auf der Oberseite der bildgebenden Puffer, seine Reaktion mit Sauerstoff in der Luft zu verhindern. Vermeiden Sie Trapping Luftblasen unter dem Deckglas.
2. Schalten Sie die Kamera, das LED-Licht und Laser. Open-Sturm-Software für die Bildaufnahme, Schwerpunkt Positionsbestimmung und Probe driften Korrektur¹³.
3. Tropfen Sie halb einen Immersionsöl auf der Linse. Die Kammer zu laden und darauf achten, dass die Linse des Objektivs nimmt Kontakt mit dem Deckglas.
4. Untersuchen Sie das Signal mit einem 750-nm-Laser.
   Hinweis: Immer auch eine zweite Antikörper-Minus-Färbung Negativkontrolle um sicherzustellen, dass die Autofluoreszenz verringert wird.
5. Identifizieren Sie einen Probe-Bereich, der Zellen und Kugelmarker enthält. Starten Sie die Software für Beispiel driften Korrektur.
   Hinweis: im allgemeinen Bereich ideale Beispiel 10-30 Zellen enthält. Unterdessen sollten die Zellen getrennt werden, auch um keine überlappenden Zellen zu vermeiden.
6. Ein Weitfeld-Bild als Referenz zu erwerben, mit der Kamera Elektron Multiplikation (EM) gewinnen bei 300 und einer Belichtungszeit von 30 ms (Abbildung 2A).
7. Erhöhen Sie die Laserstärke 750 nm Anregung zu einer höheren Macht, etwa 4,5 kW/cm². Sobald die Fluorophore in ein spärlich blinkende Muster umgestellt wurden, erwerben Sie ein super-Auflösung durch das Sammeln von 10.000 Frames bei 33 Hz (Abb. 2 b).
   Hinweis: Wenn die Fluorophore nicht isoliert sind, warten Sie ein paar Minuten, bis weitere Fluorophore zu den dunklen Zustand geschaltet werden und die isolierte einzelne Moleküle sequenziell flackern. Die Anzahl der Frames, die hier beschriebenen eignet sich für unser Beispiel und für andere gezielte Strukturen optimiert werden muss.

10. Umbau des Super-Resolution-Bilder aus den Rohdaten

1. Verwenden Sie eine Plugin namens QuickPALM (Table of Materials)¹⁴ in ImageJ, um ein 3-d-Höchstauflösung Farbbild zu rekonstruieren.
   Hinweis: Eine vorläufige chromatische Bild (Abbildung 2) zusammen mit einer farbcodierten Maßstabsleiste (Abbildung 2) erscheint. Die Farbe entspricht die Tiefe auf der z-Achse.
2. Bilder mit z-Achse geschnitten um zu demonstrieren, die 3-d-Struktur in einem video, Konstrukt einen Stapel von Höchstauflösung alle 10 nm mit QuickPALM¹⁴. Stellen Sie die Helligkeit der Stapel und duplizieren Sie die Stapel von einer Zielzelle zu. Verwenden Sie eine Plugin namens 3D Viewer (Table of Materials)¹⁵ in ImageJ, um 3-d-Bild der Zelle zu erzeugen. Notieren Sie die Drehung der 3-d-Struktur zu Demonstrationszwecken.

Ergebnisse

Sturm erreicht Höchstauflösung Bildgebung durch Aktivierung einzelner photoschaltbare Fluorophore stochastisch. Die Position des jeden Fluorophor aufgezeichnet und ein super-Resolution-Bild wird dann basierend auf diesen Standorten⁴konstruiert. Daher ist die Genauigkeit des Standortes Fluorophor wichtig für die Höchstauflösung Bildrekonstruktion. Die Absorptionsspektren von Prochlorococcus peak bei 447 nm und 680 nm,und Prochlorococcus hat ei...

Diskussion

In diesem Protokoll beschrieben wir ein Verfahren um die Autofluoreszenz des Cyanobacterium Prochlorococcus (Abbildung 3) deutlich zu reduzieren und dann Immunostain der Proteine in den Zellen, die ermöglicht, Sturm um die 3-d-FtsZ studieren nutzen Ring-Morphologien in Prochlorococcus (Abbildung 4). Dieses Protokoll könnte für Super-Resolution Imaging in anderen photosynthetischen Organismen verabschiedet werden.

...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polystyrene particles	Spherotech	PP-20-10	2.0-2.4 µm
Coverslip	Marienfeld	0111580	18 mm ∅, Thickness No. 1
Ethanol	Scharlau	ET00021000
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P9155	mol wt 70,000-150,000
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Glutaraldehyde solution, 50%	Sigma-Aldrich	340855
PBS	Sigma	P3813
Triton X-100	Sigma	T8787
EDTA Disodium Salt, 2-hydrate	Gold biotechnology	E-210-500
Trizma base	Sigma	T1503
Lysozyme	Sigma	L6876
Goat serum	Sigma	G9023
anti-Anabaena FtsZ antibody	Agrisera	AS07217
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Life Technologies	A-21039	conjugated with Alexa Fluor 750
D-Glucose Anhydrous	Fisher Scientific	D16-1
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960
Methyl Viologen	Sigma-Aldrich	856177
Cyclooctatetraene	Sigma-Aldrich	138924
tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	646547
Glucose Oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
XD-300 Xenon light source			250 W
STORM microscope	NBI	SRiS microscope
Rohdea	NBI	SRiS 3.0	software for imaging acquisition
Luna	NBI	SRiS 3.0	software for drifting correction
QuickPALM			https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis
3D Viewer			http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home