Photobleaching מאפשר הדמיה ברזולוציה-העל של הטבעת FtsZ Cyanobacterium Prochlorococcus

Summary

כאן נתאר שיטת photobleaching כדי להפחית את autofluorescence של כחוליות. לאחר photobleaching, שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ משמשת כדי לקבל תמונות סופר-ברזולוציה תלת מימדי של הטבעת FtsZ cyanobacterial.

Abstract

מיקרוסקופ ברזולוציה סופר כבר בשימוש נרחב ללמוד אינטראקציות חלבון ומבנים subcellular אורגניזמים רבים. אורגניזמים פוטוסינתטיים, עם זאת, הרזולוציה לרוחב של הדמיה סופר-ברזולוציה הוא רק 100 ~ ננומטר. הרזולוציה הנמוכה נובעת בעיקר רקע autofluorescence גבוהה של תאים פוטוסינתטיים הנגרמת על ידי לייזר בעוצמה גבוהה הנדרשים עבור הדמיה ברזולוציה סופר, כגון שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ (סערה). כאן, אנו מתארים בסיוע photobleaching סערה שיטה אשר פותחה לאחרונה הדמיה של picocyanobacterium ימי Prochlorococcus. לאחר photobleaching, autofluorescence של Prochlorococcus ביעילות פוחת כך הסערה יכול להתבצע עם רזולוציה לרוחב של ~ 10 ננומטר. באמצעות שיטה זו, אנו רוכשים הארגון ויוו תלת-ממדיים (3-D) של החלבון FtsZ, לאפיין את ארבעת מורפולוגיות טבעת FtsZ שונים במהלך מחזור התא של Prochlorococcus. השיטה שנתאר כאן עשוי להיות מאומץ על ההדמיה סופר רזולוציה של אורגניזמים פוטוסינתטיים אחרים.

Introduction

Microscopies סופר רזולוציה ניתן לשבור את מגבלת עקיפה של אור, לספק תמונות תוך עקיפה משנה החלטות (< 200 ננומטר). הם היה בשימוש נרחב אורגניזמים רבים ללמוד חלבון לוקליזציה ומבנים subcellular. רס ן סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה כוללים תאורה מובנית מיקרוסקופ (SIM), גירוי פליטה דלדול מיקרוסקופ (STED), סופה ו photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופ (דקל). מנגנוני והיישומים של אלה רזולוציה סופר מיקרוסקופים כבר בדקתי במקומות אחרים^1,2.

סופה ניתן להשיג רזולוציה גבוהה כמו 10 ננומטר על ידי הפרדה מרחבית^3,4. . סטורם, מולקולה אחת בלבד בתוך אזור מוגבל עקיפה מופעל ("על"), השאר של המולקולות נשמרים מוחלש ("off"). על ידי הצטברות של מתג מהיר- לסירוגין - מולקולות יחיד, תמונת "עקיפה-בלתי מוגבל" יכול להיות שנוצר³. בינתיים, סוגים רבים של צבעי אורגניות וחלבונים פלורסנט ישימות בסערה, המאפשרת שדרוג קל של קרינה פלואורסצנטית רגילה מיקרוסקופ מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה^5,6.

הסערה לא הוחל נרחב תאים פוטוסינתטיים, כגון כחוליות, אצות, ודורש תאי צמחים עם מהכלורופלסט^7,8, אשר בשל העובדה הסערה עוצמת הלייזר גבוהה כדי נסיעה photoswitching. הלייזר בעוצמה גבוהה בעלת מרגש רקע חזק autofluorescence תאים פוטוסינתטיים, מפריע לוקליזציה מולקולה בודדת בתחום ההדמיה סערה. על מנת להשתמש סערה לחקור את המבנים subcellular או אינטראקציות חלבון תאים פוטוסינתטיים, פיתחנו פרוטוקול photobleaching כדי להרוות את אותות autofluorescence רקע⁹. במסגרת הליך שגרתי immunofluorescent מוכתמים, דגימות נחשפים אור לבן בעוצמה גבוהה במהלך השלב חסימה, אשר מוריד את autofluorescence של תאים פוטוסינתטיים כדי לעמוד בדרישות סערה. לפיכך, פרוטוקול זה הופך ריאלי לחקור אורגניזמים פיגמנט עם הסערה.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שישמש סערה תמונת הארגון טבעת FtsZ picocyanobacterium חד־תאיות Prochlorococcus. FtsZ הוא מאוד שנשמרת טובולין דמוי cytoskeletal חלבון אשר polymerizes כדי ליצור מבנה הטבעת (הטבעת Z) סביב היקף התא¹⁰ הוא חיוני עבור ה¹¹של חלוקת התא. נשמר Prochlorococcus תאים הן photobleached הראשון כדי להפחית את הרקע autofluorescent ואת immunostained עם נוגדן anti-FtsZ העיקרי, ואז נוגדנים IgG (H + L) משני הארנב אנטי מצומדת עם fluorophore (למשל , אלקסה עבור חיל הים 750). בסופו של דבר, סערה משמשת להתבוננות הארגונים מפורטת של הטבעת FtsZ ב Prochlorococcus בשלבים שונים של מחזור התא.

Protocol

1. לטעום קיבוע והכנה

1. לחסן 1 מ"ל של axenic MED4 Prochlorococcus 5 מ ל מבוסס על מי ים Pro99 בינוני¹². מגדל Prochlorococcus תרבויות ב 23 ° C תחת האור עוצמה של 35 µmol פוטונים/m²ס כעבור חמישה ימים, לאסוף 1 מ"ל של תרבות לתוך צינור 1.5-mL.
   הערה: חמישה ימים לאחר חיסון Prochlorococcus MED4 יגיע שלב כניסה מאוחרת, עם 10⁸ תאים למ"ל, המתאימה עבור הדמיה סערה.
2. להוסיף 100 µL פורמלין שהוכנו זה עתה 25% paraformaldehyde (PFA) (w/v) ו- 2 µL של 50% גלוטראלדהיד לתוך צינור 1.5-mL כדי לתקן את התרבות. דגירה המדגם בחושך בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
   הערה: המדגם הוחזק בחושך קיבעון בגלל גלוטראלדהיד אור רגיש.
3. בדוגמה-13,500 x g עבור 1 דקות; לאחר מכן, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 100 Pro99 בינוני¹². לאחסן את הדגימה ב 4 ° C עד immunostaining.

2. precoating של Coverslip עם חרוזי פוליסטירן

הערה: חרוזי פוליסטירן נחשבים סמן fiducial לתיקון סחיפה.

1. מערבולת המקורי בקבוקון של חרוזי פוליסטירן והכן לדילול 1:20,000 עם 50% אתנול כמו slurry עבודה.
2. להדליק את הכיריים, לקבוע את הטמפרטורה עד 120 ° C, ולמקם על coverslips על צלחת חמה.
3. לטעון µL 100 של slurry לעבוד על כל coverslip. דגירה את coverslip בצלחת חמים 10 דקות ולהעביר, אז בקפידה על coverslips פטרי עבור אחסון בטמפרטורת החדר.
   הערה: הצד עם החרוזים המחוברים זה צריך להתמודד, התאים אמור להיות מחובר באותו הצד. החרוזים ותשמרו על coverslips ומשמש שתיקנת את הדגימה-נסחפת בזמן אמת במהלך סערה הדמיה. לאחר שיתק את החרוזים, coverslips לא יכול להיות האדימו.

3. ציפוי של פולי-L-ליזין על גבי Coverslip מצופים חרוז

הערה: זה נעשה לאימוביליזציה של תאים cyanobacterial.

1. להוסיף 100 µL של פולי-L-ליזין (1 מ"ג/מ"ל) מרכז coverslip עם הצד מצופים חרוז פונה כלפי מעלה. . תן לזה לנוח למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
2. השתמש פיפטה בזהירות מתאווים כעיגולים בצבע פולי-L-ליזין ולהעביר אותו ל צינור 1.5-mL. שמור את פולי-L-ליזין ב 4 ° C לשימוש חוזר.
3. שוטפים את coverslip עם 10 מ"ל מים אולטרה-מסוננים בצלוחית 60 מ מ ומייבשים אז בקצרה את coverslip על מגבת נייר.
4. אחסן את coverslip בצלחת פטרי (100 מ מ) לשימוש מאוחר יותר. כדי למנוע את הקובץ המצורף של coverslip המנה, קו על צלחת פטרי עם שכבה של מצלמות-מיקרוסקופים.
   הערה: coverslip, precoated עם חרוזים, פולי-L-ליזין, ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך לפחות חצי שנה. לכן, הכנת אוסף של coverslips מראש מומלץ מאוד.

4. בטקטיקות של תאים ב- Coverslip

1. העברה של coverslip precoated צלחת פטרי חדש עם מצלמות-מיקרוסקופים בתחתית, אשר יכונו כמו המנה מכתימים מעתה ואילך. לטעון µL 100 המדגם קבוע על coverslip ולתת לו לשבת במשך 30 דקות לאפשר התא מצורף.
2. להעביר את coverslip טוב של צלחת 12-ובכן, אשר יכונו כמו המנה כביסה מעתה ואילך. להוסיף 1 מ"ל של תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS) (10 מ מ נה₂HPO₄, מ מ 1.8 ח'₂PO₄, מ מ 137 NaCl, ו 2.7 מ"מ אשלגן כלורי, pH 7.4) לבאר, כדי לשטוף את coverslip. להסיר את המאגר PBS ולהוסיף מאגר PBS חדש לשטוף את coverslip שוב.

5. permeabilization של תאים Cyanobacterial

1. הסר את המאגר הציבורי באמצעות פיפטה. להוסיף 1 מ"ל של מאגר permeabilization הטרי הטוב של המנה כביסה, המכילה 0.05% ללא יונית דטרגנט-100 (v/v), 10 מ מ EDTA, 10 מ מ טריס (pH 8.0), ו ליזוזים 0.2 מ"ג/מ"ל.
2. דגירה המנה כביסה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן, להסיר את מאגר permeabilization.
3. להוסיף 1 מ"ל PBS מאגר ומניחים את צלחת כביסה על מטרף אשר מנענע בעדינות המנה כביסה עבור 5 דק. להסיר את המאגר PBS. חזור על שלב 3 x לשטוף את coverslip.

6. Photobleaching של כלורופיל פיגמנטים של שלב חוסם

1. להעביר coverslip את המנה מוכתמים. הוסף µL 50 מאגר חסימה, אשר מכיל 0.2% (v/v) ללא יונית דטרגנט-100 ו- 3% (v/v) עז סרום, בחלק העליון coverslip.
2. למקם את כל מכתימה את הצלחת על הקרח ולהעביר אותה תחת מקור האור קסנון עבור photobleaching לפחות 60 דקות, עם עוצמת האור-1,800 µmol פוטונים/m²·s.
3. לאחר photobleaching, חסימת, הסר בזהירות את המאגר חסימה על ידי adsorbing אותו עם הקצה של מגבת נייר.
   הערה: עוצמת האור קסנון הוא כל כך גבוה כי זוג משקפי שמש תקין נדרשת עבור הגנה העין. בינתיים, לעטוף את מקור האור, את הצלחת בעזרת רדיד אלומיניום כדי למנוע את הדליפה של אור, אשר עלול לגרום נזק לעין. בדוק את coverslip כל 15 דקות כדי לוודא כי coverslip נשאר לח. אם coverslip הוא יבש, להוסיף 50 µL מאגר חסימה.

7. הנוגדן מחייב

1. להמיס אנטי -Anabaena FtsZ נוגדנים ב 200 µL מים לפי הוראות היצרן.
2. למהול 1 µL של נוגדן anti-FtsZ לתוך µL 99 מאגר חסימה. תוסיפי coverslip 50 µL של נוגדן ראשוני מדולל, דגירה זה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
3. להעביר coverslip את המנה כביסה. להוסיף 1 מ"ל PBS מאגר ומניחים את צלחת כביסה על שייק. בעדינות לנער המנה כביסה עבור 5 דק. חזור על שלב 3 x לשטוף את coverslip.
4. להעביר coverslip את המנה מוכתמים. למהול 1 µL של נוגדנים משניים לתוך µL 500 מאגר חסימה. הוסף µL 50 של נוגדנים משניים מדולל על גבי coverslip, דגירה זה במשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
5. להעביר coverslip את המנה כביסה. לשטוף את זה עם 1 מ"ל PBS מאגר על מטרף. בעדינות לנער צלחת כביסה עבור 5 דק גלישת המנה כביסה בנייר אלומיניום כדי שיהיה אור-הוכחה. חזור על שלב זה, 3 x.
6. להוסיף 500 µL פורמלין שהוכנו זה עתה 4% paraformaldehyde (PFA) (w/v) הבאר. דגירה את coverslip למשך 15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
7. הסר את הפורמלדהיד, חזור על השלב כביסה 3 x.
8. לאחסן את coverslip במאגר PBS ב 4 ° C בחושך עד הדמיה.

8. הכנת הסערה הדמיה מאגר

1. להכין 1 מ"ל של הדמיה מאגר לפי טבלה 1, מיד לפני הסערה ההדמיה.
   הערה: כמו חיי המדף של המאגר הדמיה הוא בערך 2 h, להכינו טרי, לפני השימוש. להימנע vortexing לאחר התוספת של גלוקוז אוקסידאז, קטלאז.
   התראה: מתיל viologen הוא חומר רעיל. אנא טפל בו מסוים. Cyclooctatetraene מסווג כ קרצינוגן החתול. 1 כימי. בבקשה להימנע משאיפת ואת העור קשר ולעשות את הפתרון מניות cyclooctatetraene ואת מאגר הדמיה בשכונה כימי.

9. תמונות רכישת נתונים סערה

1. טען את coverslip בבית הבליעה טעינה (איור 1). לטעון למאגר הדמיה הטרי בעדינות לתוך החדר כדי להימנע לשטוף את התאים cyanobacterial. המקום coverslip מלבנית על המאגר הדמיה כדי למנוע שלה תגובה עם חמצן באוויר. למנוע השמנה בועות אוויר מתחת coverslip.
2. הפעל את המצלמה, נורית ה-LED ו הלייזר. תוכנת סופה פתוח עבור ייבוא תמונות, קביעת מיקום centroid מדגם נסחף תיקון¹³.
3. להוסיף חצי טיפה של שמן טבילה על גבי העדשה. לטעון התא ולוודא את העדשה של המטרה יוצר קשר עם coverslip.
4. לבחון את האות עם לייזר-750 ננומטר.
   הערה: תמיד כוללים השני נוגדן-מינוס-צביעת שלילי פקד כדי להבטיח autofluorescence פוחתת.
5. זיהוי אזור הדגימה המכילה תאים סמנים fiducial. הפעל את התוכנה עבור מדגם נסחף תיקון.
   הערה: באופן כללי, אזור הדגימה אידיאלי מכיל תאים 10-30. בינתיים, התאים להפרידם גם כדי למנוע כל בתאים החופפים.
6. רוכשים תמונה אחת שדה רחב כהפניה, עם מצלמה אלקטרון הכפלה (EM) לזכות ב 300 וזמן חשיפה של 30 ms (איור 2 א).
7. להגביר את עוצמת הלייזר-750 ננומטר עירור לכוח עליון, כ 4.5 קילוואט/ס מ². ברגע fluorophores יש מעבר מיגדרי לתוך תבנית מהבהב דליל, רוכשים תמונה ברזולוציה סופר אחד על ידי איסוף מסגרות 10,000 ב- 33 הרץ (איור 2B).
   הערה: אם fluorophores אינן מבודדות, המתן מספר דקות עד fluorophores יותר מוחלפות המדינה כהה מולקולות יחידה מבודדת להבהב ברצף. מספר המסגרות המתוארים כאן מתאים הדגימה וצריך להיות אופטימיזציה עבור מבנים יישוב אחרים.

10. שחזור של תמונות סופר-ברזולוציה מן הנתונים הגולמיים

1. להשתמש תוסף בשם QuickPALM (טבלה של חומרים)¹⁴ ImageJ לבנייה מחדש של תמונה ברזולוציה סופר צבע תלת-ממדי.
   הערה: ראשוני כרומטית תמונה (איור 2C) יחד עם בר סולם מקודדות לפי צבעים (איור 2C) יופיעו. הצבע מייצג את העומק על ציר z.
2. כדי להדגים תלת-ממד מבנה בתוך מבנה וידאו, ערימה של הסופר-רזולוציה תמונות עם ציר z למחלקה כל 10 ננומטר באמצעות QuickPALM¹⁴. כוונן את הבהירות של המחסן ולשכפל את ערימת תא מטרה אחת. להשתמש תוסף הנקרא תלת-ממד ' מציג ' (טבלה של חומרים)¹⁵ ImageJ להפיק תמונה תלת-ממדית של התא. להקליט את הסיבוב של מבנה תלת-ממדי למטרות הדגמה.

תוצאות

הסערה משיגה הדמיה ברזולוציה סופר על ידי הפעלת photoswitchable בודדים fluorophores stochastically. המיקום של כל fluorophore נרשם, תמונה סופר-ברזולוציה ואז נבנה בהתבסס על מיקומים אלה⁴. לכן, מידת הדיוק של המיקום fluorophore חשוב עבור שחזור התמונה ברזולוציה-העל. ספקטרום הבליעה של Prochlorococcus ...

Discussion

ב פרוטוקול זה, אנו המתואר הליך כדי להפחית באופן משמעותי את autofluorescence של cyanobacterium Prochlorococcus (איור 3C) ו, אז, immunostain החלבונים בתאים, שאיפשר לנו לנצל את סטורם ללמוד את FtsZ תלת-ממדי טבעת מורפולוגיות ב- Prochlorococcus (איור 4). פרוטוקול זה עשוי להיות מאומץ עבור הדמיה ס?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polystyrene particles	Spherotech	PP-20-10	2.0-2.4 µm
Coverslip	Marienfeld	0111580	18 mm ∅, Thickness No. 1
Ethanol	Scharlau	ET00021000
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P9155	mol wt 70,000-150,000
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Glutaraldehyde solution, 50%	Sigma-Aldrich	340855
PBS	Sigma	P3813
Triton X-100	Sigma	T8787
EDTA Disodium Salt, 2-hydrate	Gold biotechnology	E-210-500
Trizma base	Sigma	T1503
Lysozyme	Sigma	L6876
Goat serum	Sigma	G9023
anti-Anabaena FtsZ antibody	Agrisera	AS07217
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Life Technologies	A-21039	conjugated with Alexa Fluor 750
D-Glucose Anhydrous	Fisher Scientific	D16-1
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960
Methyl Viologen	Sigma-Aldrich	856177
Cyclooctatetraene	Sigma-Aldrich	138924
tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	646547
Glucose Oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
XD-300 Xenon light source			250 W
STORM microscope	NBI	SRiS microscope
Rohdea	NBI	SRiS 3.0	software for imaging acquisition
Luna	NBI	SRiS 3.0	software for drifting correction
QuickPALM			https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis
3D Viewer			http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home