Photobleaching permette l'Imaging a Super-risoluzione dell'anello FtsZ nel cianobatterio Prochlorococcus

Riepilogo

Qui descriviamo un metodo photobleaching per ridurre l'autofluorescenza di cianobatteri. Dopo photobleaching, microscopia stocastico ricostruzione ottico viene utilizzata per ottenere immagini tridimensionali ad alta super-risoluzione dell'anello FtsZ cianobatterica.

Abstract

Microscopia di Super-risoluzione è stato ampiamente utilizzata per studiare le interazioni della proteina e strutture subcellulari in molti organismi. Negli organismi fotosintetici, tuttavia, la risoluzione laterale dell'imaging di Super-risoluzione è solo ~ 100 nm. La bassa risoluzione è dovuto principalmente sullo sfondo di alta autofluorescenza delle cellule fotosintetiche causato da laser ad alta intensità che sono necessari per l'imaging di Super-risoluzione, come il microscopio stocastico ricostruzione ottico (tempesta). Qui, descriviamo un assistita photobleaching tempesta metodo che è stato sviluppato recentemente per formazione immagine il picocyanobacterium marino Acinetobacter. Dopo photobleaching, l'autofluorescenza di Acinetobacter è efficacemente ridotto così quella tempesta può essere eseguita con una risoluzione laterale di ~ 10 nm. Utilizzando questo metodo, acquisiamo l'organizzazione in vivo tridimensionale (3D) della proteina FtsZ e caratterizzano le quattro diverse morfologie di anello di FtsZ durante il ciclo cellulare di Acinetobacter. Il metodo che qui descritto potrebbe essere adottato per l'imaging di Super-risoluzione di altri organismi fotosintetici.

Introduzione

Microscopie di Super-risoluzione possono rompere il limite di diffrazione di luce e di fornire immagini all'interno di risoluzioni Sub-diffrazione (< 200 nm). Essi sono stati ampiamente utilizzati in molti organismi per studiare la localizzazione della proteina e strutture subcellulari. Maggiore super-risoluzione microscopia metodi includono illuminazione strutturata microscopia (SIM), stimolato microscopia di svuotamento di emissione (STED), tempesta e microscopia di fotoattivazione localizzazione (PALM). I meccanismi e le applicazioni di questi super-risoluzione microscopi sono stati esaminati altrove^1,2.

TEMPESTA può raggiungere una risoluzione alta come 10 nm di separazione spaziale^3,4. Per la tempesta, soltanto una molecola all'interno di una regione di diffrazione limitata è attivo ("on") e il resto delle molecole sono tenute inattivato ("off"). Da un accumulo di accensione rapida e - off di singole molecole, un'immagine "diffrazione-illimitato" può essere generato³. Nel frattempo, molti tipi di coloranti organici e proteine fluorescenti sono applicabili in tempesta, permettendo un facile aggiornamento da microscopia di fluorescenza regolari a microscopia ad alta risoluzione^5,6.

TEMPESTA non è stato ampiamente applicato in cellule fotosintetiche, come cianobatteri, alghe, e cellule vegetali con cloroplasti^7,8, che è dovuto al fatto che la tempesta richiede laser ad alta intensità per unità photoswitching. Il laser ad alta intensità sfavorevole eccita autofluorescence forte background in cellule fotosintetiche e interferisce con la localizzazione di singola molecola nell'imaging di tempesta. Per poter utilizzare tempesta per indagare le strutture subcellulari o interazioni della proteina in cellule fotosintetiche, abbiamo sviluppato un protocollo di photobleaching per placare lo sfondo autofluorescence segnali⁹. In una procedura di macchiatura immunofluorescente routine, gli esemplari sono esposti a luce bianca di alta intensità durante la fase di blocco, che abbassa l'autofluorescenza delle cellule fotosintetiche per soddisfare i requisiti per la tempesta. Così, questo protocollo rende fattibile per studiare gli organismi pigmentati con tempesta.

Qui, descriviamo il protocollo da utilizzare tempesta all'immagine dell'organizzazione di anello FtsZ nella picocyanobacterium unicellulari Acinetobacter. FtsZ è una proteina del citoscheletro altamente conservata di tubulina-come che polimerizza per formare una struttura ad anello (l'anello Z) lungo la circonferenza di una cella¹⁰ ed è essenziale per la divisione cellulare¹¹. Cellule sono conservate Prochlorococcus prima photobleached per ridurre la priorità bassa autofluorescent e immunostained con un anticorpo primario anti-FtsZ, e poi un anticorpo di IgG (H + L) anti-coniglio secondario è coniugato con un fluoroforo (per esempio. , Alexa Fluor 750). Alla fine, tempesta è usato per osservare le organizzazioni di anello di FtsZ dettagliate in Acinetobacter durante le fasi di ciclo cellulare diverso.

Protocollo

1. preparazione e la fissazione del campione

1. Inoculare 1 mL di axeniche Prochlorococcus MED4 a 5 mL della base di acqua di mare Pro99 medio¹². Crescere Prochlorococcus culture a 23 ° C sotto la luce con un'intensità di 35 µmol fotoni/m²s. cinque giorni più tardi, raccogliere 1 mL di coltura in una provetta da 1,5 mL.
   Nota: Cinque giorni dopo l'inoculazione, Acinetobacter MED4 raggiungerà la fase tarda del registro, con circa 10⁸ cellule/mL, che è appropriato per l'imaging di tempesta.
2. Aggiungere 100 µ l di formaldeide preparati al momento da 25% paraformaldeide (PFA) (w/v) e 2 µ l di 50% glutaraldeide nella provetta da 1,5 mL per fissare la cultura. Incubare il campione al buio a temperatura ambiente per 20 min.
   Nota: Il campione è stato tenuto all'oscuro per fissazione perché glutaraldeide è luce sensibile.
3. Rotazione verso il basso il campione a 13.500 x g per 1 min; quindi, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 100 µ l del medio Pro99¹². Conservare il campione a 4 ° C fino a che immunostaining.

2. spre-spalmatura del coprivetrino con perle di polistirolo

Nota: Perle di polistirolo sono considerati come il marcatore fiduciale per la correzione di deriva.

1. Vortex originale flacone di perle di polistirolo e preparare una diluizione di 1: 20,000 con etanolo al 50% come lavoro liquami.
2. Accendere la piastra riscaldante, impostare la temperatura a 120 ° C e posizionare i vetrini coprioggetto sulla piastra calda.
3. Caricare 100 µ l di liquami di lavoro su ogni vetrino coprioggetti. Incubare il vetrino coprioggetto sulla piastra calda per 10 minuti e, quindi, attentamente trasferire i coprioggetti Petri per stoccaggio a temperatura ambiente.
   Nota: Il lato con le perline collegato ad esso dovrebbe affrontare, e le cellule devono essere attaccate sullo stesso lato. Le perle sono immobilizzate su lamelle e utilizzate per correggere l'esempio alla deriva in tempo reale durante la formazione immagine di tempesta. Dopo immobilizzazione le perline, non possono essere fiammati i coprioggetti.

3. rivestimento di poli-L-lisina sul coprioggetto rivestite con perlina

Nota: Questo viene fatto per l'immobilizzazione delle cellule cianobatterica.

1. Aggiungere 100 µ l di poli-L-lisina (1 mg/mL) al centro del coprivetrino con lato rivestite con perlina rivolto verso l'alto. Lasciate riposare per 30 min a temperatura ambiente.
2. Utilizzare una pipetta per attentamente aspire unattached poli-L-lisina e trasferirlo in una provetta da 1,5 mL. Salvare il poli-L-lisina a 4 ° C per il riutilizzo.
3. Risciacquare il coprioggetto con 10 mL di acqua ultra-filtrate in una capsula di Petri 60mm ed asciugare brevemente il coprivetrino su un tovagliolo di carta.
4. Conservare il vetrino coprioggetto in una capsula Petri (100 mm) per un successivo utilizzo. Per evitare l'attacco del coprivetrino al piatto, linea di Petri con uno strato di parafilm.
   Nota: Il vetrino coprioggetto, sensibilizzato con perline e poli-L-lisina, può essere conservato a temperatura ambiente per almeno un semestre. Di conseguenza, preparando una serie di lamelle in anticipo è altamente raccomandato.

4. immobilizzazione delle cellule il coprivetrino

1. Trasferire un coprioggetto ricoperto prima una nuova capsula Petri con parafilm nella parte inferiore, che deve essere indicato come il piatto di macchiatura d'ora in poi. Caricare 100 µ l del campione fisso il coprivetrino e lasciate riposare per 30 minuti consentire il collegamento delle cellule.
2. Trasferire il coprioggetto in un pozzetto di una piastra 12-pozzetti, che deve essere indicato come il piatto di lavaggio d'ora in poi. Aggiungere 1 mL di tampone fosfato salino (PBS) (10mm Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl e 2.7 mM KCl, pH 7.4) al pozzo a lavare il vetrino coprioggetti. Rimuovere il tampone PBS e aggiungere un nuovo tampone PBS per lavare nuovamente il vetrino coprioggetti.

5. permeabilizzazione delle cellule cianobatterica

1. Rimuovere il tampone PBS utilizzando una pipetta. Aggiungere 1 mL di tampone di permeabilizzazione preparata al momento del lavaggio piatto, che contiene 0,05% detergente non ionico-100 (v/v), 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8.0) e lisozima di 0,2 mg/mL.
2. Incubare il piatto di lavaggio a 37 ° C per 20 min. Quindi, rimuovere il buffer di permeabilizzazione.
3. Aggiungere 1 mL di tampone PBS e posizionare il piatto di lavaggio su un agitatore che scuote dolcemente il piatto di lavaggio per 5 minuti, rimuovere il tampone PBS. Ripetere questo passaggio 3x per lavare il vetrino coprioggetti.

6. Photobleaching della clorofilla pigmenti in un passaggio di blocco

1. Trasferire il coprioggetto al piatto colorazione. Aggiungere 50 µ l di tampone bloccante, che contiene 0.2% (v/v) non ionici detergente-100 e siero di capra del 3% (v/v), nella parte superiore il vetrino coprioggetti.
2. Posizionare l'intera piastra sul ghiaccio di colorazione e spostarlo sotto la sorgente luminosa del xeno per photobleaching per almeno 60 min, con un'intensità di luce a 1.800 µmol fotoni/m²p.
3. Dopo photobleaching e di blocco, rimuovere con cautela il tampone bloccante di adsorbimento e con il bordo di un tovagliolo di carta.
   Nota: L'intensità della luce allo xeno è così alto che un paio di occhiali da sole adeguate è necessaria per la protezione degli occhi. Nel frattempo, avvolgere la sorgente luminosa e la piastra utilizzando carta stagnola per evitare la fuoriuscita di luce, che può danneggiare gli occhi. Controllare il coprioggetto ogni 15 min per assicurarsi che il vetrino coprioggetto rimane umido. Se il vetrino coprioggetto è asciutto, aggiungere 50 µ l di tampone bloccante.

7. anticorpi

1. Sciogliere anti - anticorpo diAnabaena FtsZ in 200 µ l di acqua secondo le istruzioni del produttore.
2. Diluire 1 µ l di anticorpo anti-FtsZ in 99 µ l di tampone bloccante. Aggiungere 50 µ l di anticorpo primario diluito il coprivetrino e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
3. Trasferire il coprioggetto per il piatto di lavaggio. Aggiungere 1 mL di tampone PBS e posizionare il piatto di lavaggio su una scossa. Agitare delicatamente il piatto di lavaggio per 5 min, ripetere questo passaggio 3x per lavare il vetrino coprioggetti.
4. Trasferire il coprioggetto al piatto colorazione. Diluire 1 µ l di anticorpo secondario in 500 µ l di tampone bloccante. Aggiungere 50 µ l di anticorpo secondario diluito sul vetrino coprioggetto e Incubare 30 min al buio a temperatura ambiente.
5. Trasferire il coprioggetto per il piatto di lavaggio. Lavare con 1 mL di tampone PBS su un agitatore. Agitare delicatamente il piatto di lavaggio per 5 min, avvolgere il piatto di lavaggio con carta alluminio per renderlo a prova di luce. Ripetere questo passaggio x 3.
6. Aggiungere 500 µ l di formaldeide preparati al momento da paraformaldeide al 4% (PFA) (w/v). Incubare il vetrino coprioggetto per 15 min al buio a temperatura ambiente.
7. Rimuovere la formaldeide e ripetere la fase di lavaggio 3 x.
8. Conservare il vetrino coprioggetto in tampone PBS a 4 ° C al buio fino a formazione immagine.

8. preparazione della tempesta Buffer di Imaging

1. Preparare 1 mL di tampone secondo la tabella 1, immediatamente prima dell'imaging di tempesta di imaging.
   Nota: Come la shelf life del buffer imaging è di circa 2 h, prepararlo fresco, proprio prima dell'uso. Evitare l'uso del Vortex dopo l'aggiunta di glucosio ossidasi e catalasi.
   Attenzione: Metil viologeno è materiale velenoso. Si prega di trattare con particolare cura. Cicloottatetraene è classificata come cancerogena Cat. 1 chimica. Si prega di evitare l'inalazione e contatto con la pelle e rendere la soluzione di riserva cicloottatetraene e buffer di imaging in una cappa chimica.

9. immagine acquisizione dei dati di tempesta

1. Caricare il coprioggetto nel vano di carico (Figura 1). Caricare il buffer imaging preparato delicatamente nell'alloggiamento per evitare di lavare fuori le cellule cianobatterica. Posto un coprioggetto rettangolare nella parte superiore il buffer di imaging per impedire la sua reazione con l'ossigeno nell'aria. Evitare le bolle d'aria di intrappolamento sotto il vetrino coprioggetti.
2. Accendere la fotocamera, la luce del LED e laser. Aprire il software STORM per acquisizione di immagini, determinazione della posizione di baricentro e campione di drifting correzione¹³.
3. Aggiungere mezza una goccia di olio per immersione in cima la lente. Caricare la camera e assicurarsi che la lente dell'obiettivo fa contatto con il vetrino coprioggetti.
4. Esaminare il segnale con un laser di 750 nm.
   Nota: Sempre includere un secondo controllo anticorpo-meno-macchiatura negativo per garantire che l'autofluorescenza è diminuita.
5. Identificare un'area campione che contiene entrambe le cellule e marker fiduciali. Avviare il software per esempio alla deriva di correzione.
   Nota: In generale, l'area campione ideale contiene cellule di 10-30. Nel frattempo, le cellule devono essere separate bene per evitare eventuali celle sovrapposte.
6. Acquisire un'immagine di grande campo come riferimento, con il moltiplicarsi di elettrone di fotocamera (EM) guadagno a 300 e un tempo di esposizione di 30 ms (Figura 2A).
7. Aumentare l'intensità del laser di eccitazione di 750 nm a una forza superiore, circa 4,5 kW/cm². Una volta i fluorofori hanno la transizione in un modello di rado lampeggio, è possibile acquisire una sola immagine di Super-risoluzione raccogliendo 10.000 fotogrammi a 33 Hz (Figura 2B).
   Nota: Se i fluorofori non sono isolate, attendere un paio di minuti fino a quando altri fluorofori sono commutati allo stato scuro e le singole molecole isolate verificarsi uno sfarfallio in sequenza. Il numero di fotogrammi qui descritto è adatto per il nostro campione e deve essere ottimizzato per altre strutture mirate.

10. ricostruzione di Super-risoluzione immagini dai dati grezzi

1. Utilizzare un plugin chiamato QuickPALM (Tabella materiali)¹⁴ in ImageJ per ricostruire un'immagine di Super-risoluzione di colore 3D.
   Nota: Una preliminare cromatica immagine (Figura 2) insieme a una barra di scala con codifica a colori (Figura 2) apparirà. Il colore rappresenta la profondità sull'asse z.
2. Per dimostrare il 3-d della struttura in un costrutto di video, una pila di Super-risoluzione immagini con asse z sezionato ogni 10 nm utilizzando QuickPALM¹⁴. Regolare la luminosità delle pile e duplicare la pila di cella uno obiettivo. Utilizzare un plugin denominato Visualizzatore 3D (Tabella materiali)¹⁵ in ImageJ per generare l'immagine 3D della cella. Registrare la rotazione della struttura 3-d per scopi dimostrativi.

Risultati

TEMPESTA realizza formazione immagine super-risoluzione attivando fotomodulabili singoli fluorophores casualmente. La posizione di ogni fluoroforo è registrata e un'immagine di Super-risoluzione è quindi costruita basata su queste posizioni⁴. Pertanto, la precisione della posizione fluoroforo è importante per la ricostruzione di immagine di Super-risoluzione. Gli spettri di assorbimento di Acinetobacter picco a 447 nm e 680 nme Acinetobacter ha...

Discussione

In questo protocollo, abbiamo descritto una procedura per ridurre significativamente l'autofluorescenza del cianobatterio Prochlorococcus (Figura 3) e, quindi, immunostain le proteine nelle cellule, che ci ha permesso di utilizzare tempesta per studiare il FtsZ 3D morfologie di anello in Acinetobacter (Figura 4). Questo protocollo potrebbe essere adottato per l'imaging di Super-risoluzione in altri organismi fotosintetici.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polystyrene particles	Spherotech	PP-20-10	2.0-2.4 µm
Coverslip	Marienfeld	0111580	18 mm ∅, Thickness No. 1
Ethanol	Scharlau	ET00021000
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P9155	mol wt 70,000-150,000
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Glutaraldehyde solution, 50%	Sigma-Aldrich	340855
PBS	Sigma	P3813
Triton X-100	Sigma	T8787
EDTA Disodium Salt, 2-hydrate	Gold biotechnology	E-210-500
Trizma base	Sigma	T1503
Lysozyme	Sigma	L6876
Goat serum	Sigma	G9023
anti-Anabaena FtsZ antibody	Agrisera	AS07217
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Life Technologies	A-21039	conjugated with Alexa Fluor 750
D-Glucose Anhydrous	Fisher Scientific	D16-1
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960
Methyl Viologen	Sigma-Aldrich	856177
Cyclooctatetraene	Sigma-Aldrich	138924
tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	646547
Glucose Oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
XD-300 Xenon light source			250 W
STORM microscope	NBI	SRiS microscope
Rohdea	NBI	SRiS 3.0	software for imaging acquisition
Luna	NBI	SRiS 3.0	software for drifting correction
QuickPALM			https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis
3D Viewer			http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home