Фотообесцвечивание позволяет супер резолюции изображений FtsZ кольца в цианобактерии Prochlorococcus

Резюме

Здесь мы описываем метод Фотообесцвечивание для снижения аутофлюоресценция цианобактерий. После Фотообесцвечивание стохастический оптических реконструкции микроскопии используется для получения изображений трехмерных суперразрешением цианобактерий кольца FtsZ.

Аннотация

Супер-резолюции микроскопии широко использовался для изучения взаимодействия протеина и внутриклеточных структур многих организмов. В фотосинтетических организмов, однако, латеральное разрешение суперразрешением изображений является только ~ 100 Нм. Низкое разрешение обусловлено главным образом высоким аутофлюоресценция фон фотосинтезирующих клеток, вызванные лазеров высокой интенсивности, которые необходимы для супер-резолюции изображений, таких как стохастические оптических реконструкции микроскопии (шторм). Здесь мы описываем при содействии Фотообесцвечивание шторм метод который была разработана недавно для изображений морской picocyanobacterium Prochlorococcus. После Фотообесцвечивание, Аутофлюоресценция Prochlorococcus эффективно снижается так что шторм может быть выполнена с латеральное разрешение ~ 10 Нм. С помощью этого метода, мы приобретаем в vivo трехмерной (3-D) Организации FtsZ белка и характеризуют четыре различных FtsZ кольцо морфологии во время цикла клетки Prochlorococcus. Метод, который мы описываем здесь могут быть приняты для супер-резолюции изображений других фотосинтетических организмов.

Введение

Суперразрешением microscopies может нарушить дифракционный предел света и предоставляют изображения в рамках резолюций Подкомиссии дифракции (< 200 Нм). Они широко используются во многих организмах для изучения белков локализации и внутриклеточных структур. Основные суперразрешением микроскопии методы включают структурированного освещения микроскопии (SIM), стимулировали выбросов истощения микроскопии (интереса), шторм и photoactivated локализации микроскопии (PALM). ^1,2обзор других механизмов и применения этих супер-резолюции, которые были микроскопы.

ШТОРМ может достичь резолюции аж 10 Нм, пространственное разделение^3,4. Для ШТОРМА только одна молекула в регион дифракционный активируется («по») и остальная часть молекулы хранятся инактивированных («выключено»). Накоплением быстрого переключения на и - офф одной молекулы «дифракционный Безлимитный» изображение может быть сгенерированный³. Между тем многие виды органических красителей и флуоресцентные белки применимы в шторм, что позволяет легко модернизировать от регулярных флуоресцентной микроскопии высокого разрешения микроскопии^5,6.

ШТОРМ не применяется широко в фотосинтезирующих клеток, таких как синезеленых водорослей, морских водорослей, и растительных клеток с хлоропластов^7,8, которая обусловлена тем, что шторм требует высокой лазерной интенсивности для привода photoswitching. Высокой интенсивности лазерного неблагоприятно возбуждает аутофлюоресценция сильный фон в фотосинтезирующих клеток и препятствует сингл молекула локализации в шторм изображений. Чтобы использовать шторм расследовать внутриклеточных структур или белковых взаимодействий в фотосинтезирующих клеток, мы разработали протокол Фотообесцвечивание чтобы утолить фон аутофлюоресценция сигналы⁹. В процедуре обычной immunofluorescent окрашивания образцов подвергаются белый свет высокой интенсивности во время блокировки шага, который понижает аутофлюоресценция фотосинтезирующих клеток для удовлетворения требований для ШТОРМА. Таким образом этот протокол делает возможным расследовать пигментированной организмов с ШТОРМОМ.

Здесь мы описываем протокол использовать ШТОРМА для изображений FtsZ кольцо Организации одноклеточных picocyanobacterium Prochlorococcus. FtsZ является весьма сохранены тубулин как цитоскелета белком, который polymerizes сформировать структуру кольцо (кольцо Z) по окружности ячейки¹⁰ и имеет важное значение для деления клеток¹¹. Сохранились Prochlorococcus клетки первого photobleached уменьшить фон autofluorescent и immunostained с основных анти FtsZ антитела, и затем вторичные антитела IgG (H + L) анти кролик проспряганное с Флюорофор (например , Alexa Fluor 750). В конце концов шторм используется для наблюдать подробную FtsZ кольцо организаций в Prochlorococcus стадии различных клеточного цикла.

протокол

1. Образец подготовки и фиксации

1. Прививать 1 мл стерильных Prochlorococcus MED4 до 5 мл на основе морской воды Pro99 средних¹². Расти Prochlorococcus культур при 23 ° C под свет с интенсивностью 35 мкмоль фотоны/m²s. пять дней спустя, собирать 1 мл культуры в 1,5 мл.
   Примечание: Через пять дней после прививки, Prochlorococcus MED4 достигнет этапа конца журнала, с приблизительно 10⁸ клеток/мл, который подходит для ШТОРМА изображений.
2. Добавьте 100 мкл формальдегида, приготовленные из 25% параформальдегида (PFA) (w/v) и 2 мкл глютаральдегид 50% в 1,5 мл пробирку исправить культуры. Инкубируйте образец в темноте при комнатной температуре в течение 20 мин.
   Примечание: Образец хранилась в темноте для фиксации потому что глютаральдегид свет чувствительные.
3. Спин вниз образца на 13500 x g 1 мин; затем удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 100 мкл Pro99 средних¹². Храните образца при температуре 4 ° C до иммуноокрашивания.

2. намывного Coverslip с шарики полистироля

Примечание: Бисер полистирола считаются фидуциальный маркер для коррекции дрейф.

1. Вихревой оригинальный флакон из шарики полистироля и подготовить топографической разрежения с 50% этанола как рабочей суспензии.
2. Поверните на горячей плите, установите температуру до 120 ° C и место coverslips на горячей пластине.
3. Загрузите 100 мкл рабочего раствора на каждом coverslip. Инкубировать coverslip на горячей плите за 10 мин и, затем, тщательно передать coverslips Петри для хранения при комнатной температуре.
   Примечание: На стороне с бисером, прилагается к нему следует лицом вверх, и клетки должны быть прикреплены на одной стороне. Бусины иммобилизованных на coverslips и используется для коррекции дрейфующих образец в режиме реального времени во время ШТОРМА изображений. После иммобилизации бусы, coverslips не пылали.

3. покрытие поли L-лизин на Coverslip шарик покрытием

Примечание: Это делается для иммобилизации цианобактерий клеток.

1. Мкл 100 поли L-лизин (1 мг/мл) в центр coverslip с покрытием из бисера, стороной вверх. Пусть это сидеть в течение 30 мин при комнатной температуре.
2. Использование пипетки тщательно aspire неприсоединенной поли L-лизин и его передать 1,5 мл. Сохраните поли L-лизин при 4 ° C для повторного использования.
3. Промыть coverslip с 10 мл ультра фильтрации воды в чашку Петри 60-мм и затем кратко сухой coverslip на бумажное полотенце.
4. Магазин coverslip в чашке Петри (100 мм) для последующего использования. Чтобы предотвратить вложения coverslip блюдо, линия Петри слоем парафина.
   Примечание: Coverslip, ветротурбин с бисером и поли L-лизин, может храниться при комнатной температуре по крайней мере полгода. Поэтому настоятельно рекомендуется заранее подготовить пакет coverslips.

4. Иммобилизация клеток на Coverslip

1. Передать новые Петри с парафина в нижней части, которая будет именоваться окрашивание блюдо отныне precoated coverslip. Загрузить 100 мкл фиксированной образца на coverslip и дайте ему сидеть в течение 30 минут, чтобы позволить ячейке вложение.
2. Передачи coverslip колодец 12-ну плиты, которая будет именоваться Стиральная блюдо отныне. Добавьте 1 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS) (10 мм Na₂HPO₄, 1.8 мм х₂PO₄, 137 мм NaCl и 2,7 мм KCl, рН 7,4) хорошо мыть coverslip. Удалить в буфер PBS и добавьте новый буфер PBS мыть coverslip снова.

5. permeabilization цианобактерий клеток

1. Удалите в буфер PBS с помощью пипетки. Добавьте 1 мл свежеприготовленный permeabilization буфера также стиральная блюдо, которое содержит 0,05% неионные моющего средства-100 (v/v), 10 мм ЭДТА, 10 трис (рН 8.0) и 0,2 мг/мл лизоцима.
2. Инкубируйте блюдо стирки при 37 ° C в течение 20 мин. Затем удалите буфера permeabilization.
3. Добавьте 1 mL PBS буфера и поместите блюдо стирки на шейкер, который мягко качает Стиральная блюдо для 5 минут удалить буфер PBS. Повторите этот шаг 3 x мыть coverslip.

6. Фотообесцвечивание хлорофилл пигменты в блокировки шаг

1. Передача coverslip окрашивание блюдо. Добавьте 50 мкл блокирующий буфер, который содержит 0,2% (v/v) неионных моющего средства-100 и 3% (v/v) козьего сыворотки, на вершине coverslip.
2. Поместите весь пятнать пластины на льду и переместить его под ксенон источник света для Фотообесцвечивание по крайней мере 60 мин, с интенсивностью освещения на 1800 мкмоль фотоны/m²·s.
3. После Фотообесцвечивание и блокирование осторожно удалите блокирующий буфер путем поглощения с краем бумажным полотенцем.
   Примечание: Интенсивность света ксенон настолько высока, что необходима пару надлежащего очки для защиты глаз. Тем временем оберните источника света и пластине с помощью алюминиевой фольгой, чтобы избежать утечки света, который может привести к повреждению глаз. Проверьте coverslip каждые 15 минут, чтобы убедиться, что coverslip остается влажным. Если coverslip сухой, добавьте 50 мкл блокировки буфера.

7. антитела связывая

1. Растворите анти -Анабена FtsZ антител в 200 мкл воды согласно инструкциям производителя.
2. Разбавьте 1 мкл антител анти FtsZ в 99 мкл блокировки буфера. Добавьте 50 мкл разбавленного основное антитело на coverslip и проинкубируйте его при комнатной температуре за 30 мин.
3. Передача coverslip стирки блюдо. Добавьте 1 mL PBS буфера и поместите блюдо стирки на встряхнуть. Осторожно встряхните Стиральная блюдо для 5 минут повторите этот шаг 3 x мыть coverslip.
4. Передача coverslip окрашивание блюдо. Разбавьте 1 мкл вторичное антитело в 500 мкл блокировки буфера. Добавьте 50 мкл разбавленного вторичное антитело на coverslip и Инкубируйте 30 мин в темноте при комнатной температуре.
5. Передача coverslip стирки блюдо. Промойте его с 1 мл буфера PBS на шейкер. Осторожно встряхните Стиральная блюдо для 5 минут обернуть Стиральная блюдо с алюминиевой бумаги, чтобы сделать его свет доказательство. Повторите этот шаг 3 x.
6. 500 мкл формальдегида, приготовленные из параформальдегида 4% (PFA) (w/v), колодец. Инкубируйте coverslip 15 мин в темноте при комнатной температуре.
7. Удалите формальдегида и повторите шаг 3 x стиральная.
8. Магазин coverslip в буфере PBS на 4 ° C в темноте до изображений.

8. Подготовка шторм визуализации буфера

1. Готовим 1 мл визуализации буфера согласно таблице 1, непосредственно перед ШТОРМОМ изображения.
   Примечание: Как срок хранения изображений буфера составляет около 2 ч, подготовьте его свежие, прямо перед использованием. Избегайте vortexing после добавления глюкозооксидазы и каталазы.
   Предупреждение: Метил viologen-ядовитые материал. Пожалуйста, обрабатывать ее с особой осторожностью. Cyclooctatetraene классифицирован как канцероген Cat. 1 химического. Просьба избегать вдыхания и контакт с кожей и сделать Стоковый раствор cyclooctatetraene и визуализации буфера в химические вытяжки.

9. изображение приобретение данных шторм

1. Загрузите coverslip в камере загрузки (рис. 1). Загрузите свежеприготовленные буфера визуализации мягко в камеру, чтобы избежать смывания цианобактерий клетки. Место прямоугольной coverslip на вершине буфере визуализации для предотвращения его реакции с кислородом в воздухе. Избегайте треппинга пузырьков воздуха под coverslip.
2. Включите камеру, светодиодный свет и лазер. Открытое программное обеспечение ШТОРМА для захвата изображений, определение тяжести положения и образец дрейфующих коррекции¹³.
3. Добавьте половину каплю масла погружения на вершине объектива. Загрузить камеры и убедитесь, что объектив цели делает контакт с coverslip.
4. Проверьте сигнал с 750-Нм лазер.
   Примечание: Всегда включайте второй Пятнать антитела минус отрицательный контроль для обеспечения что аутофлюоресценция уменьшается.
5. Определите область образца, который содержит клетки и фидуциальный маркеров. Запустите программное обеспечение для образца, дрейфующих коррекции.
   Примечание: В общем, идеальный образец содержит 10-30 ячеек. Тем временем клетки должны быть разделены так, чтобы избежать любого дублирования клетки.
6. Приобрести один-поля изображения как ссылка, с камеры электрона умножения (EM) получить на 300 и выдержка 30 мс (рисунок 2A).
7. Увеличьте интенсивность лазерного возбуждения 750-Нм до более высокой мощности, примерно 4,5 кВт/см². После флуорофоров перешли в разреженных мигающий шаблон, приобрести один из супер-разрешение изображения, собирая 10000 кадров на 33 Гц (рис. 2B).
   Примечание: Если флуорофоров, не изолированы, подождите пару минут, пока больше флуорофоров перешли в состояние темно и изолированных молекул одного мерцание последовательно. Количество кадров, описанные здесь подходит для нашего образца и должна быть оптимизирована для других целевых структур.

10. Реконструкция суперразрешением изображений из необработанных данных

1. Используйте плагин называется QuickPALM (Таблица материалов)¹⁴ в ImageJ реконструировать суперразрешением 3-D цветного изображения.
   Примечание: Предварительные хроматической изображения (рис. 2 c) наряду с цветом линейки (рис. 2 c) будет отображаться. Глубина на оси z представляет цвет.
2. Чтобы продемонстрировать 3-D структуры в конструкцию видео, стек суперразрешением изображения с z-axis секционного каждые 10 Нм, используя QuickPALM¹⁴. Отрегулируйте яркость стеков и дублировать стек одной целевой ячейки. Используйте плагин называется трехмерного просмотра (Таблица материалов)¹⁵ в ImageJ для создания 3-D изображение клетки. Запись вращение 3-D структуры для демонстрационных целей.

Результаты

Шторм достигает суперразрешением изображений путем активации отдельных фотопереключаемых флуорофоров ковшах. Расположение каждого Флюорофор записывается и супер-разрешение изображения затем строится на основе этих мест⁴. Таким образом точность место?...

Обсуждение

В этом протоколе, мы описали процедура значительно сократить аутофлюоресценция цианобактерии Prochlorococcus (рис. 3 c) и, затем, имунноконтраст белков в клетках, которые позволили нам использовать шторм для того чтобы изучить 3-D FtsZ кольцо морфологии в Prochlorococcus (

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polystyrene particles	Spherotech	PP-20-10	2.0-2.4 µm
Coverslip	Marienfeld	0111580	18 mm ∅, Thickness No. 1
Ethanol	Scharlau	ET00021000
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P9155	mol wt 70,000-150,000
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Glutaraldehyde solution, 50%	Sigma-Aldrich	340855
PBS	Sigma	P3813
Triton X-100	Sigma	T8787
EDTA Disodium Salt, 2-hydrate	Gold biotechnology	E-210-500
Trizma base	Sigma	T1503
Lysozyme	Sigma	L6876
Goat serum	Sigma	G9023
anti-Anabaena FtsZ antibody	Agrisera	AS07217
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Life Technologies	A-21039	conjugated with Alexa Fluor 750
D-Glucose Anhydrous	Fisher Scientific	D16-1
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960
Methyl Viologen	Sigma-Aldrich	856177
Cyclooctatetraene	Sigma-Aldrich	138924
tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	646547
Glucose Oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
XD-300 Xenon light source			250 W
STORM microscope	NBI	SRiS microscope
Rohdea	NBI	SRiS 3.0	software for imaging acquisition
Luna	NBI	SRiS 3.0	software for drifting correction
QuickPALM			https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis
3D Viewer			http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home