Fotobranqueamento permite Super-resolução imagem do anel FtsZ a associação ficobilinas

Resumo

Aqui nós descrevemos um método fotobranqueamento para reduzir a autofluorescência de cianobactérias. Depois fotobranqueamento, microscopia de reconstrução óptica estocástico é usada para obter imagens tridimensionais de super-resolução do anel FtsZ cianobactérias.

Resumo

Microscopia de super-resolução tem sido amplamente utilizada para o estudo das interações da proteína e estruturas subcelulares em muitos organismos. Em organismos fotossintéticos, no entanto, a resolução lateral da imagem latente de super-resolução é apenas ~ 100 nm. A baixa resolução é principalmente devido à alta autofluorescência fundo das células fotossintéticas causada por lasers de alta intensidade que são necessários para a imagem latente de super-resolução, tais como a microscopia de reconstrução óptica estocástico (Tempestade). Aqui, descrevemos um assistida fotobranqueamento tempestade método que foi desenvolvido recentemente para o picocyanobacterium marinho ficobilinasde imagem. Após fotobranqueamento, a autofluorescência de ficobilinas efetivamente é reduzida assim que a tempestade pode ser realizada com uma resolução lateral de ~ 10 nm. Usando este método, podemos adquirir a organização na vivo tridimensional (3D) da proteína FtsZ e caracterizar quatro diferentes morfologias de anel FtsZ durante o ciclo celular de ficobilinas. O método que descrevemos aqui pode ser adotado para o tratamento de imagens de super-resolução de outros organismos fotossintéticos.

Introdução

Microscopies de super-resolução podem quebrar o limite de difração de luz e fornecer imagens dentro de resoluções de difração sub (< 200 nm). Eles têm sido amplamente utilizados em muitos organismos para estudar a localização da proteína e estruturas subcelulares. Major Super-resolução microscopia métodos incluem iluminação estruturada microscopia (SIM), estimulou a microscopia de depleção de emissão (STED), tempestade e microscopia de localização fotoativados (PALM). Os mecanismos e aplicações destes super-resolução microscópios foram revisaram em outro lugar^1,2.

TEMPESTADE pode alcançar uma resolução tão alta quanto 10 nm por separação espacial^3,4. Para tempestade, somente uma molécula dentro de uma região de difração limitada é ativada ("on") e o resto das moléculas são mantidas inactivada ("off"). Pelo acúmulo de ligar rápido e - fora de moléculas simples, uma imagem "difração-ilimitado" pode ser gerado³. Entretanto, muitos tipos de corantes orgânicos e proteínas fluorescentes são aplicáveis na tempestade, permitindo uma atualização fácil de microscopia de fluorescência regular para microscopia de alta resolução^5,6.

TEMPESTADE não tem sido amplamente aplicada em células fotossintéticas, como cianobactérias, algas, e células vegetais com cloroplastos^7,8, que é devido ao fato de que a tempestade requer intensidade elevada do laser para unidade photoswitching. O laser de alta intensidade desfavoravelmente excita autofluorescência forte fundo nas células fotossintéticas e interfere com a localização do único-molécula em imagem de tempestade. Para usar a tempestade para investigar as estruturas subcelulares ou interações da proteína nas células fotossintéticas, desenvolvemos um protocolo de fotobranqueamento para saciar o fundo autofluorescência sinais⁹. Em um procedimento de coloração imunofluorescente rotina, amostras são expostas a luz branca de alta intensidade durante a etapa de bloqueio, o que reduz a autofluorescência de células fotossintéticas para cumprir as exigências para a tempestade. Assim, este protocolo torna viável para investigar organismos pigmentados com tempestade.

Aqui, descrevemos o protocolo para usar a tempestade a imagem da organização de anel FtsZ no picocyanobacterium unicelular ficobilinas. FtsZ é uma proteína do citoesqueleto altamente conservada de tubulina, como que se polimeriza para formar uma estrutura em anel (o anel Z) em torno da circunferência de uma célula¹⁰ e é essencial para a divisão celular¹¹. Preservado ficobilinas células são primeira foto para reduzir a autofluorescent fundo e immunostained com um anticorpo primário anti-FtsZ, e em seguida um anticorpo de IgG (H + L) de antisecundário coelho é conjugado com um fluoróforo (por exemplo, , Alexa Fluor 750). Eventualmente, a tempestade é usado para observar as organizações de anel FtsZ detalhadas em ficobilinas durante fases do ciclo celular diferente.

Protocolo

1. preparação e fixação da amostra

1. Inocule 1 mL de axénica MED4 ficobilinas para 5 mL do baseado em água do mar Pro99 médio¹². Cultivar culturas ficobilinas a 23 ° C, sob a luz com uma intensidade de 35 µmol fótons/m²s. cinco dias depois, coletar 1 mL da cultura para um tubo de 1,5 mL.
   Nota: Cinco dias após a inoculação, ficobilinas MED4 atingirá a fase tardia do log, com aproximadamente 10⁸ células/mL, que é apropriado para a imagem latente de tempestade.
2. Adicione 100 µ l de formol recentemente preparada de 25% paraformaldeído (PFA) (p/v) e 2 µ l de 50% de glutaraldeído no tubo de 1,5 mL para corrigir a cultura. Incube a amostra no escuro à temperatura ambiente por 20 min.
   Nota: A amostra foi mantida no escuro para fixação porque o glutaraldeído é luz sensível.
3. Girar a amostra a 13.500 x g por 1 min; em seguida, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 100 µ l do médio Pro99¹². Armazene a amostra a 4 ° C até immunostaining.

2. precoating da lamela com esferas de poliestireno

Nota: Grânulos de poliestireno são considerados como o Marcador fiducial para correção de deriva.

1. Vórtice original frasco de esferas de poliestireno e preparar uma diluição de 1: 20.000 com 50% de etanol como da pasta de trabalho.
2. Vire o prato quente, regule a temperatura de 120 ° C e coloque as lamelas na chapa quente.
3. Carrega 100 µ l de pasta de trabalho no sentido cada lamela. Incubar a lamela na chapa quente por 10 min e, em seguida, transferir com cuidado as lamelas para placas de Petri para armazenamento à temperatura ambiente.
   Nota: O lado com os grânulos anexado a ele deveria enfrentar, e as células devem ser conectadas no mesmo lado. Os grânulos são imobilizados nas lamelas e usados para corrigir a amostra-à deriva em tempo real durante a imagem latente de tempestade. Depois imobilizando as contas, as lamelas não podem ser inflamadas.

3. revestimento de poli-L-lisina no sentido do lamela grânulo-revestido

Nota: Isto é feito para a imobilização de células de cianobactérias.

1. Adicione 100 µ l de poli-L-lisina (1 mg/mL) para o centro da lamela com a grânulo-revestido virados para cima. Deixe descansar por 30 min à temperatura ambiente.
2. Use uma pipeta para cuidadosamente aspire o poli-L-lysine desanexado e transferir para um tubo de 1,5 mL. Salve o poli-L-lisina a 4 ° C para reutilização.
3. Enxágue a lamela com 10 mL de água ultrafiltrada em uma placa de Petri 60mm e seque brevemente a lamela sobre papel absorvente.
4. Armazene a lamela em uma placa de Petri (100 mm) para uso posterior. Para evitar que o acessório da lamela ao prato, linha da placa de Petri com uma camada de parafilme.
   Nota: A lamela, revestida com grânulos e poli-L-lisina, pode ser armazenada em temperatura ambiente pelo menos meio ano. Portanto, preparar um lote de lamelas com antecedência é altamente recomendado.

4. imobilização de células em lamela

1. Transferi uma lamela pré-revestido para uma nova placa de Petri com parafilm na parte inferior, o qual será referido como o prato de coloração de agora em diante. Carregar 100 µ l da amostra fixa na lamela e deixe descansar por 30 min permitir a fixação da célula.
2. Transferi a lamela para um poço de uma placa de 12 poços, que será referido como o prato de lavar daqui em diante. Adicione 1 mL de tampão fosfato salino (PBS) (10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl e 2,7 mM KCl, pH 7,4) ao poço para lavar a lamela. Retire o tampão PBS e adicionar um novo buffer de PBS para lavar a lamela novamente.

5. permeabilização de células de cianobactérias

1. Retire o tampão PBS com uma pipeta. Adicione 1 mL de tampão de permeabilização preparadas para o poço do lavar um prato, que contém 0.05% não-iónicos detergente-100 (v/v), 10 mM de EDTA, 10mm Tris (pH 8.0) e lisozima 0,2 mg/mL.
2. Incube o lavar prato a 37 ° C por 20 min. Em seguida, remova o buffer de permeabilização.
3. Adicionar 1 mL de tampão PBS e coloque o prato de lavar um agitador que treme delicadamente o prato de lavagem por 5 min. Retire o tampão PBS. Repita este passo 3 x para lavar a lamela.

6. fotobranqueamento da clorofila pigmentos em uma etapa de bloqueio

1. Transferi a lamela para o prato de coloração. Adicione 50 µ l de tampão de bloqueio, que contém detergente não-iônico de 0,2% (v/v)-100 e 3% (v/v) de soro de cabra, na parte superior da lamela.
2. Coloque toda a mancha placa no gelo e movê-lo sob a fonte de luz de xenônio para fotobranqueamento pelo menos 60 min, com uma intensidade de luz em 1.800 µmol fótons/m²·s.
3. Depois fotobranqueamento e bloquear, remova cuidadosamente o tampão de bloqueio fixando-o com a borda de uma toalha de papel.
   Nota: A intensidade de luz de xenônio é tão alta que um par de óculos adequados é necessário para a proteção de olho. Enquanto isso, enrole a fonte de luz e a placa usando papel alumínio para evitar o vazamento de luz, que pode causar lesões oculares. Verificar a cada 15 min lamela para certificar-se que a lamela permanece úmida. Se a lamela é seca, adicione 50 µ l de tampão de bloqueio.

7. anticorpo ligação

1. Dissolva anti -Anabaena FtsZ anticorpo em 200 µ l de água de acordo com as instruções do fabricante.
2. Dilua 1 µ l de anticorpo anti-FtsZ em 99 µ l de tampão de bloqueio. Adicionar 50 µ l de anticorpo primário diluído na lamela e incube-lo em temperatura ambiente por 30 min.
3. Transferi a lamela ao lavar prato. Adicionar 1 mL de tampão PBS e coloque o prato de lavagem em um milk-shake. Agite suavemente o prato de lavagem 5 min. Repita este passo 3x para lavar a lamela.
4. Transferi a lamela para o prato de coloração. Dilua 1 µ l de um anticorpo secundário em 500 µ l de tampão de bloqueio. Adicionar 50 µ l de anticorpo secundário diluído no sentido do lamela e incube-lo por 30 min no escuro à temperatura ambiente.
5. Transferi a lamela ao lavar prato. Lave-a com 1 mL de tampão PBS um agitador. Agite delicadamente o prato de lavagem 5 min. Wrap o lavar prato com papel de alumínio para torná-lo opaco. Repita este passo 3 x.
6. Adicione 500 µ l de formol recentemente preparada de paraformaldeído 4% (PFA) (p/v) para o poço. Incube a lamela por 15 min no escuro à temperatura ambiente.
7. Remover o formaldeído e repita a etapa de lavagem 3 x.
8. Armazene a lamela em tampão PBS a 4 ° C, no escuro até a imagem.

8. preparação da tempestade Buffer de imagem

1. Prepare-se 1 mL de reserva de acordo com a tabela 1, imediatamente antes da imagem de tempestade de imagem.
   Nota: Como a vida de prateleira do buffer de imagem é cerca de 2 h, prepará-lo fresco, antes do uso. Evite a utilização do Vortex após a adição de glicose oxidase e catalase.
   Cuidado: Metil viologênio é material venenoso. Por favor, manipulá-lo com especial cuidado. Ciclooctatetraeno é classificado como uma substância cancerígena gato. 1 química. Por favor evitar a inalação e contacto com a pele e fazer o buffer de imagem e solução ciclooctatetraeno em uma capa de química.

9. imagem aquisição de dados de tempestade

1. Carrega a lamela na câmara de carga (Figura 1). Carrega o buffer de imagem recentemente preparado suavemente na câmara para evitar lavar as células de cianobactérias. Coloque uma lamela retangular na parte superior o buffer de imagem para evitar que sua reação com o oxigênio do ar. Evite as bolhas de ar de armadilhagem debaixo da lamela.
2. Ligue a câmera, a luz de LED e o laser. Software aberto de tempestade para aquisição de imagens, determinação de posição do centroide e amostra deriva de correção¹³.
3. Adicione meia gota de óleo de imersão sobre a lente. Carregar a câmara e verifique se a lente do objectivo entra em contato com a lamela.
4. Examine o sinal com um laser de 750 nm.
   Nota: Sempre incluem um segundo controle negativo-negativo-mancha do anticorpo para garantir que a autofluorescência é diminuída.
5. Identifica uma área de amostra que contém células e marcadores fiduciais. Inicie o software por exemplo correção de deriva.
   Nota: em geral, a área de amostra ideal contém células de 10-30. Entretanto, as células devem ser separadas para evitar quaisquer células sobrepostas.
6. Adquirir uma imagem de campo amplo, como referência, com a multiplicação de elétron de câmera (EM) ganho em 300 e um tempo de exposição de 30 ms (Figura 2A).
7. Aumente a intensidade do laser de 750 nm de excitação a um poder superior, aproximadamente 4,5 kW/cm². Uma vez que o fluorophores ter transferida em um padrão piscante esparso, adquira uma super resolução de imagem através da recolha de 10.000 quadros a 33 Hz (Figura 2B).
   Nota: Se o fluorophores não são isolados, espere alguns minutos até mais fluorophores são comutados ao estado escuro e as moléculas isoladas de única piscam sequencialmente. O número de quadros descrito aqui é apropriado para nossa amostra e precisa ser otimizado para outras estruturas alvo.

10. reconstrução de imagens de super-resolução de dados brutos

1. Use um plugin chamado QuickPALM (Tabela de materiais)¹⁴ no ImageJ para reconstruir uma imagem de super-resolução cor 3-d.
   Nota: Uma preliminar cromática imagem (Figura 2) junto com uma barra de código de cores de escala (Figura 2) aparecerá. A cor representa a profundidade sobre o eixo z.
2. Para demonstrar o 3-d estrutura em uma construção de vídeo, uma pilha de super-resolução imagens com eixo z seccionado cada 10 nm, utilizando QuickPALM¹⁴. Ajustar o brilho das pilhas e duplicar a pilha de célula de um alvo. Use um plugin chamado visualizador 3D (Tabela de materiais)¹⁵ no ImageJ para gerar a imagem em 3D da célula. Recorde a rotação da estrutura 3-d para fins de demonstração.

Resultados

TEMPESTADE atinge imagem super-resolução ativando photoswitchable individuais fluorophores estocàstica. A localização de cada fluoróforo é registrada e uma imagem de super-resolução então é construída com base nestes locais⁴. Portanto, a precisão da localização fluoróforo é importante para a reconstrução de imagem super resolução. Os espectros de absorção de ficobilinas um pico de 447 nm e 680 nme ficobilinas tem uma absorç...

Discussão

Neste protocolo, descrevemos um procedimento para reduzir significativamente a autofluorescência da Associação ficobilinas (Figura 3) e, em seguida, delgados das proteínas nas células, que nos permitiram utilizar tempestade para estudar a FtsZ 3D morfologias anel em ficobilinas (Figura 4). Este protocolo pode ser adotado para a imagem latente de super-resolução em outros organismos fotossintéticos.

Estudos an...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polystyrene particles	Spherotech	PP-20-10	2.0-2.4 µm
Coverslip	Marienfeld	0111580	18 mm ∅, Thickness No. 1
Ethanol	Scharlau	ET00021000
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P9155	mol wt 70,000-150,000
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Glutaraldehyde solution, 50%	Sigma-Aldrich	340855
PBS	Sigma	P3813
Triton X-100	Sigma	T8787
EDTA Disodium Salt, 2-hydrate	Gold biotechnology	E-210-500
Trizma base	Sigma	T1503
Lysozyme	Sigma	L6876
Goat serum	Sigma	G9023
anti-Anabaena FtsZ antibody	Agrisera	AS07217
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Life Technologies	A-21039	conjugated with Alexa Fluor 750
D-Glucose Anhydrous	Fisher Scientific	D16-1
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960
Methyl Viologen	Sigma-Aldrich	856177
Cyclooctatetraene	Sigma-Aldrich	138924
tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	646547
Glucose Oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
XD-300 Xenon light source			250 W
STORM microscope	NBI	SRiS microscope
Rohdea	NBI	SRiS 3.0	software for imaging acquisition
Luna	NBI	SRiS 3.0	software for drifting correction
QuickPALM			https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis
3D Viewer			http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home