Photobleaching Cyanobacterium Prochlorococcus FtsZ ringde Süper çözünürlük görüntüleme sağlar

Özet

Burada Siyanobakteriler autofluorescence azaltmak için photobleaching yöntemi açıklanmaktadır. Photobleaching sonra Stokastik optik imar mikroskobu siyanobakteriyel FtsZ ringin üç boyutlu Süper çözünürlük fotoğraf elde etmek için kullanılır.

Özet

Süper çözünürlük mikroskobu protein etkileşimleri ve çoğu canlıda hücre altı yapıları incelemek için yaygın olarak kullanılmış. Fotosentetik canlılar arasında süper kararlılık düşsel yanal çözünürlük sadece 100 ~ be nm. Düşük çözünürlük çok yüksek autofluorescence hücrelerin arka planını Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına) gibi süper kararlılık düşsel için gerekli olan yüksek yoğunluklu lazerler neden fotosentetik kaynaklanmaktadır. Burada, deniz picocyanobacterium Prochlorococcusgörüntüleme için son zamanlarda geliştirilen bir photobleaching destekli fırtına yöntemi açıklanmaktadır. O fırtına ~ 10 yanal çözünürlük ile yapılabilir böylece photobleaching sonra etkili bir şekilde Prochlorococcus autofluorescence azalır nm. Bu yöntemi kullanarak, biz vivo içinde üç boyutlu (3-D) organizasyon FtsZ protein elde etmek ve Prochlorococcushücre döngüsü sırasında dört farklı FtsZ yüzük türleri morfoloji karakterize. Biz burada tarif yöntemi fotosentetik diğer organizmaların süper kararlılık düşsel için kabul edilebilir.

Giriş

Süper çözünürlük microscopies ışığın kırınım sınırını kırmak ve alt kırınım çözünürlükleri (< 200 nm) içinde görüntüler sunar. Bunlar yaygın birçok organizmalarda protein yerelleştirme ve hücre altı yapıları incelemek için kullanılmıştır. Binbaşı Süper çözünürlük mikroskobu yöntemleri arasında yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM), uyarılmış emisyonu tükenmesi mikroskobu (STED), fırtına ve photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM). Mekanizmaları ve mikroskoplar olmuştur bu süper çözünürlük uygulamaları başka bir yerde^1,2gözden geçirdim.

FIRTINA 10'a kadar yüksek bir çözünürlük elde edebilirsiniz nm uzaysal ayırma^3,4. FIRTINA, bir kırınım-sınırlı bölge içinde tek bir molekül ("on") etkinleştirilir ve molekülleri kalan ("uzak") Inaktif tutulur. Bir birikimi hızlı geçiş on ve - off tek moleküller tarafından oluşturulan³"kırınım-sınırsız" bir görüntü olabilir. Bu arada, birçok türde organik boya ve floresan proteinler yüksek çözünürlüklü mikroskobu^5,6düzenli floresans mikroskobu kolay bir yükseltme izin fırtınada tabidir.

FIRTINA geniş Siyanobakteriler, yosun, gibi fotosentetik hücrelerdeki uygulanmamış ve bitki hücreleri ile kloroplast^7,ki...... fırtına nedeni olan⁸, sürücü photoswitching için yüksek lazer yoğunluğu gerektirir. Yüksek yoğunluktaki lazer olumsuz ve güçlü autofluorescence arka planda fotosentetik hücreleri heyecanlandıran tek molekül yerelleştirme fırtına görüntülemede etkilemektedir. FIRTINA hücre altı yapıları veya protein etkileşimleri fotosentetik hücrelerdeki araştırmak için kullanmak için arka plan autofluorescence sinyalleri⁹gidermek için photobleaching iletişim kuralı geliştirilmiştir. Rutin bir immünfloresan boyama işlem içinde numuneler fotosentetik hücrelerinin fırtına gereksinimlerini autofluorescence düşürür engelleme adım sırasında yüksek yoğunluklu beyaz ışığa maruz kalır. Böylece, bu iletişim kuralını fırtına ile pigmentli organizmalar araştırmak için uygun yapar.

Burada, tek hücreli picocyanobacterium ProchlorococcusFtsZ yüzük kuruluşta görüntüye fırtına kullanılacak protokol açıklayın. FtsZ hücre¹⁰ çevresi halka yapısının (Z halka) oluşturmak için polymerizes ve hücre bölünmesi¹¹için gerekli olan bir son derece korunmuş tübülin benzeri hücre iskeleti proteindir. Prochlorococcus korunmuş hücrelerdir autofluorescent arka plan ve immunostained bir birincil anti-FtsZ antikor ile azaltmak için ilk photobleached ve sonra ikincil bir anti-tavşan (H + L) IgG antikor fluorophore ile Birleşik (Örneğin , Alexa Fluor 750). Sonunda, fırtına Prochlorococcus detaylı FtsZ yüzük kuruluşlarda farklı hücre döngüsü aşamaları sırasında gözlemlemek için kullanılır.

Protokol

1. örnek hazırlama ve fiksasyon

1. Deniz suyu tabanlı Pro99 orta¹²5 ml axenic Prochlorococcus MED4 1 mL aşılamak. Prochlorococcus kültür ışığı altında 23 ° C'de 35 µmol fotonlar/m²s. bir yoğunluk ile beş gün sonra büyümek, kültür 1 mL 1.5 mL tüp içine toplamak.
   Not: Beş gün sonra aşılama ile yaklaşık 10⁸ hücre/mL, geç log fazı olan fırtına görüntüleme için uygun olduğu Prochlorococcus MED4 ulaşacak.
2. 100 µL % 25 paraformaldehyde (PFA) (w/v) taze hazırlanmış formaldehit ve % 50 oxazolidin 2 µL kültür düzeltmek için 1.5 mL tüp içine ekleyin. Örnek 20 dk için oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkaya.
   Not: oxazolidin ışık olduğundan örnek fiksasyon için karanlıkta hassas tutuldu.
3. Spin aşağı 13.500 x g 1 dk. için de örnek; ardından, süpernatant kaldırmak ve Pro99 orta¹²100 µL hücrelerde resuspend. Örnek 4 ° C'de immunostaining kadar saklayın.

2. precoating Coverslip polistren boncuklar ile

Not: Polistiren boncuk drift düzeltme için indirgeme marker olarak kabul edilir.

1. Girdap orijinal polistren boncuk şişe ve bir 1:20,000 seyreltme % 50 Etanol ile çalışan bulamaç olarak hazırlayın.
2. Sıcak plaka üzerinde açın sıcaklığı 120 ° C için ayarlamak ve coverslips sıcak plaka üzerine yerleştirin.
3. Çalışma Bulamaç her coverslip üzerine 100 µL yükleyin. Coverslip 10 dk sıcak plaka üzerinde kuluçkaya ve daha sonra dikkatlice Petri yemekler için depolama oda sıcaklığında coverslips transfer.
   Not: Yan bağlı boncuk ile yüzleşmeli ve hücreleri aynı tarafta iliştirilmesi gerekir. Boncuk coverslips üzerinde immobilize ve örnek sürüklenen düzeltmek için kullanılan fırtına görüntüleme sırasında gerçek zamanlı. Boncuk immobilizing sonra coverslips flamed olamaz.

3. Poly-L-lizin boncuk kaplı Coverslip üzerine kaplanması

Not: Bu siyanobakteriyel hücre immobilizasyon için yapılır.

1. Poli-L-lizin (1 mg/mL) 100 µL coverslip merkezine boncuk kaplamalı yüzü yukarı bakacak şekilde ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika oturmak izin.
2. Bir pipet dikkatle bekâr poli-L-lizin aspire ve 1.5 mL tüp aktarmak için kullanın. Poli-L-lizin 4 ° c yeniden kullanmak üzere kaydedin.
3. 60 mm kabında coverslip 10 mL ultra filtre su ile durulayın ve sonra kısa bir süre kuru kağıt havlu üzerinde coverslip.
4. Coverslip bir Petri (100 mm) daha sonra kullanım için saklayın. Yemek için coverslip ve eki önlemek için Petri kabına parafilm bir tabaka ile satır.
   Not: boncuk ve poli-L-lizin, precoated coverslip, oda sıcaklığında en az yarım yıl için saklanır. Bu nedenle, coverslips bir dizi önceden hazırlama önemle önerilir.

4. Coverslip sayfasında bulunan bir hücreler immobilizasyon

1. Precoated coverslip ile parafilm boyama tabak olarak bundan sonra sevk edilecek en altındaki yeni Petri kabına aktarın. Coverslip üzerinde sabit örnek 100 µL yük ve hücre ek izin vermek 30 dakika oturmak izin.
2. Coverslip çamaşır tabak olarak bundan sonra sevk edilecek bir 12-şey plaka bir kuyu için transfer. Fosfat tamponlu tuz (PBS) (10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl ve 2.7 mM KCl, pH 7,4) 1 mL coverslip yıkamak için kuyuya ekleyin. PBS arabellek kaldırın ve tekrar coverslip yıkamak için yeni bir PBS arabellek ekleyin.

5. permeabilization siyanobakteriyel hücre

1. PBS arabelleği bir pipet kullanarak kaldırın. Taze hazırlanmış permeabilization arabellek 1 mL %0,05 non-iyonik deterjan-100 (v/v), 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8.0) ve 0.2 mg/mL lizozim içeren çamaşır bulaşık kuyusu ekleyin.
2. 20 dk 37 ° C'de çamaşır bulaşık kuluçkaya. Sonra permeabilization arabellek kaldırın.
3. PBS arabellek 1 mL ekleyin ve hangi 5 dk. kaldırmak için PBS arabellek yavaşça çamaşır bulaşık sallıyor bir shaker çamaşır çanak yerleştirin. 3 x coverslip yıkamak için bu adımı yineleyin.

6. Photobleaching klorofil engelleme bir adımda pigmentler

1. Coverslip boyama yemek için transfer. 50 µL % 0,2 (v/v) non-iyonik deterjan-100 ve coverslip üst kısmında %3 (v/v) keçi serum içeren engelleme arabelleği ekleyin.
2. Plaka buz üzerinde boyama bütün yer ve taşımak için photobleaching en az 60 dakika, xenon ışık kaynağı altında hafif yoğunlukta 1.800 µmol fotonlar/m²·s ile.
3. Photobleaching ve engelleme sonra kağıt havlu kenarı ile adsorbing tarafından dikkatli bir şekilde engelleme arabellek çıkarın.
   Not: Xenon ışığın şiddetini uygun güneş gözlüğü göz koruması için gerekli yüksek. Bu arada, ışık kaynağı ve göz zarar neden olabilir ışık sızıntı önlemek için alüminyum folyo kullanarak plaka sarın. Coverslip her 15dk coverslip nemli kalır emin olun. Coverslip kuru ise, engelleme arabelleği 50 µL ekleyin.

7. antikor bağlama

1. Anti -Anabaena FtsZ antikor su üretici yönergelerine göre 200 µL içinde çözülür.
2. Anti-FtsZ antikor engelleme arabelleği 99 µL içine 1 µL sulandırmak. Seyreltilmiş birincil antikor 50 µL üzerinde coverslip ekleyin ve 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.
3. Coverslip çamaşır bulaşık aktarın. PBS arabellek 1 mL ekleyin ve bir shake üzerinde çamaşır çanak yerleştirin. Yavaşça bu adımı coverslip yıkamak için 3 x 5 dk. tekrar çamaşır bulaşık salla.
4. Coverslip boyama yemek için transfer. İkincil bir antikor engelleme arabelleği 500 µL içine 1 µL sulandırmak. Seyreltilmiş ikincil antikor coverslip üzerine 50 µL ekleyin ve karanlık oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
5. Coverslip çamaşır bulaşık aktarın. PBS arabelleği bir shaker üzerine 1 mL ile yıkayın. Yavaşça 5 dk. şal için çamaşır bulaşık çamaşır bulaşık ışık geçirmez yapmak için alüminyum kağıt ile sallamak. 3 x bu adımı yineleyin.
6. 500 µL % 4 paraformaldehyde (PFA) (w/v) taze hazırlanmış formaldehit kuyuya ekleyin. 15 dakika içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında coverslip kuluçkaya.
7. Formaldehit kaldırmak ve 3 x çamaşır adımı yineleyin.
8. Coverslip görüntüleme kadar PBS arabellek karanlıkta 4 ° C'de depolayın.

8. arabellek Imaging fırtına hazırlanması

1. Tablo 1göre arabellek hemen önce fırtına görüntüleme görüntüleme 1 mL hazırlayın.
   Not: görüntüleme arabellek raf ömrü yaklaşık 2 h olduğu gibi taze, kullanımdan önce hazır olun. Vortexing glikoz oksidaz ve katalaz eklenmesinden sonra kaçının.
   Dikkat: Metil viologen zehirli malzemedir. Lütfen özel dikkat ile başa. Cyclooctatetraene bir kanserojen kedi sınıflandırılır. 1 kimyasal. İnhalasyon önlemek temas ten ve cyclooctatetraene hisse senedi çözüm ve görüntüleme tampon kimyasal bir mahallede olun.

9. resim alma fırtına veri

1. Coverslip yükleme odasında (Şekil 1) yükleyin. Taze hazırlanmış görüntüleme tampon yavaşça odasına siyanobakteriyel hücreleri dışına yıkama önlemek için yüklemek. Havadaki oksijen ile onun reaksiyonu önlemek için görüntüleme tampon üstüne bir dikdörtgen coverslip yerleştirin. Bindirme hava kabarcıkları coverslip altında kaçının.
2. Kamera, LED ışık ve lazer açın. Resim alma, centroid konum belirleme ve düzeltme¹³sürüklenen örnek için açık fırtına yazılım.
3. Objektifin üst kısmında Daldırma yağ yarım bir damla ekleyin. Odası yük ve amacın objektif emin olun coverslip ile temas.
4. Sinyal 750-nm lazer ile inceleyin.
   Not: Her zaman autofluorescence azalır emin olmak için ikinci antikor eksi boyama negatif denetimini içerir.
5. Hücreleri ve indirgeme işaretleri içeren bir örnek alanı tanımlayın. Yazılım düzeltme sürüklenen örnek için başlatın.
   Not: genel olarak, 10-30 hücre ideal örnek alanı var. Bu arada, hücreleri de herhangi bir çakışan hücrelerde önlemek için ayrılmalıdır.
6. Bir referans olarak bir geniş-alan görüntü elde etmek, 300 ve bir çekim hızı 30 ms (Şekil 2A) fotoğraf makinesi elektron çarpma (EM) ile kazanmak.
7. 750-nm uyarma lazer yoğunluğu yüksek bir güç, yaklaşık 4,5 kW/cm²için artırın. Bir kez fluorophores seyrek bir yanıp sönen kalıp içine geçiş, bir süper çözünürlüklü görüntü 33 Hz değerinde (Şekil 2B) 10.000 çerçeveler toplayarak elde etmek.
   Not: Eğer fluorophores izole değildir, birkaç dakika kadar daha fazla fluorophores karanlık durumuna geçiş yaptı ve sıralı olarak izole tek moleküllerin titreşim için bekleyin. Burada açıklanan çerçeve sayısı bizim örnek için uygundur ve hedeflenen diğer yapıları için optimize edilmiş olması gerekiyor.

10. Süper çözünürlük fotoğraf ham verilerden inşası

1. QuickPALM (Tablo reçetesi)¹⁴ ImageJ içinde bir eklenti bir 3-b rengi süper çözünürlüklü görüntü yeniden oluşturmak için kullanın.
   Not: Bir ön kromatik görüntü (Şekil 2C) ile birlikte bir renk kodlu ölçek çubuğu (Şekil 2C)-ecek gözükmek. Renk derinliğini z ekseni üzerinde gösterir.
2. 3-b yapı video, bir yapı içinde a yığın-in süper çözünürlük göstermek için her 10 z ekseni görüntülerle kesitli QuickPALM¹⁴kullanarak nm. Yığınlar parlaklığını ayarlayın ve bir hedef hücre yığını çoğaltın. 3B görüntüleyici (Tablo reçetesi)¹⁵ ImageJ içinde bir eklenti hücre 3 boyutlu görüntü oluşturmak için kullanın. Kayıt Gösterim amacıyla 3 boyutlu yapısı döndürme.

Sonuçlar

FIRTINA süper kararlılık düşsel bireysel photoswitchable fluorophores stochastically harekete geçirerek elde eder. Her fluorophore konumunu kaydedilir ve bir süper çözünürlüklü görüntü sonra bu mekanlar⁴üzerinde dayalı inşa edilmiştir. Bu nedenle, fluorophore konumu duyarlığını Süper çözünürlük görüntü yeniden yapılanma için önemlidir. Prochlorococcus emme spectra zirve 447 nm ve 680 nmve Prochlorococcus dalga b...

Tartışmalar

Bu protokol için biz cyanobacterium Prochlorococcus (Şekil 3 c) autofluorescence önemli ölçüde azaltmak için bir prosedür açıklanan ve daha sonra immunostain 3-b FtsZ çalışmaya fırtına kullanmak için bize etkin hücre proteinleri Yüzük türleri morfoloji olarak Prochlorococcus (Şekil 4). Bu iletişim kuralı için süper kararlılık düşsel fotosentetik diğer organizmalarda kabul.

Fotosentetik c...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polystyrene particles	Spherotech	PP-20-10	2.0-2.4 µm
Coverslip	Marienfeld	0111580	18 mm ∅, Thickness No. 1
Ethanol	Scharlau	ET00021000
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P9155	mol wt 70,000-150,000
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Glutaraldehyde solution, 50%	Sigma-Aldrich	340855
PBS	Sigma	P3813
Triton X-100	Sigma	T8787
EDTA Disodium Salt, 2-hydrate	Gold biotechnology	E-210-500
Trizma base	Sigma	T1503
Lysozyme	Sigma	L6876
Goat serum	Sigma	G9023
anti-Anabaena FtsZ antibody	Agrisera	AS07217
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Life Technologies	A-21039	conjugated with Alexa Fluor 750
D-Glucose Anhydrous	Fisher Scientific	D16-1
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960
Methyl Viologen	Sigma-Aldrich	856177
Cyclooctatetraene	Sigma-Aldrich	138924
tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	646547
Glucose Oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
XD-300 Xenon light source			250 W
STORM microscope	NBI	SRiS microscope
Rohdea	NBI	SRiS 3.0	software for imaging acquisition
Luna	NBI	SRiS 3.0	software for drifting correction
QuickPALM			https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis
3D Viewer			http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home