Fotoblanqueo permite proyección de imagen de súper-resolución del anillo de FtsZ en la cianobacteria Prochlorococcus

Resumen

Aquí se describe un método de fotoblanqueo para reducir la autofluorescencia de las cianobacterias. Después de photobleaching, microscopia óptica estocástica de la reconstrucción se utiliza para obtener imágenes de resolución súper tridimensional del anillo de FtsZ cianobacterias.

Resumen

Microscopía de superresolución ha sido ampliamente utilizado para el estudio de las interacciones entre proteínas y estructuras subcelulares en muchos organismos. En organismos fotosintéticos, sin embargo, la resolución lateral de proyección de imagen de súper-resolución es sólo de ~ 100 nm. La baja resolución es principalmente debido al fondo de la autofluorescencia alta de células fotosintéticas causados por rayos láser de alta intensidad que se requieren para la proyección de imagen de súper-resolución, tales como microscopía óptica estocástica de la reconstrucción (tormenta). Aquí, describimos un asistida por photobleaching tormenta método desarrollado recientemente para la proyección de imagen la picocyanobacterium Marina Prochlorococcus. Después de photobleaching, el autofluorescence de Prochlorococcus es reducido por lo que la tormenta se puede realizar con una resolución lateral de ~ 10 nm. Usando este método, adquiere la organización en vivo tridimensional (3D) de la proteína FtsZ y caracterizar cuatro diferentes morfologías de anillo de FtsZ durante el ciclo celular de Prochlorococcus. El método que se describe aquí puede adoptarse para la proyección de imagen de súper-resolución de otros organismos fotosintéticos.

Introducción

Microscopías de super-resolución pueden romper el límite de difracción de la luz y proporcionan imágenes en resoluciones de la secundario-difracción (< 200 nm). Han sido ampliamente utilizados en muchos organismos para estudiar la localización de proteínas y estructuras subcelulares. Grandes súper resolución microscopia métodos incluyen microscopía de iluminación estructurada (SIM), estimuló la microscopia de agotamiento de la emisión (STED), tormenta y microscopía de localización fotoactivado (PALM). Los mecanismos y aplicaciones de estos súper-resolución microscopios han sido revisaron en otra parte^1,2.

TORMENTA puede alcanzar una resolución tan alta como 10 nm por separación espacial^3,4. Para la tormenta, solamente una molécula dentro de una región limitada de la difracción está activada ("on") y el resto de las moléculas se mantienen inactiva ("off"). Por una acumulación de encendido rápido y - de las moléculas individuales, una imagen "difracción ilimitado" puede ser generado³. Mientras tanto, muchas clases de colorantes orgánicos y proteínas fluorescentes son aplicables en la tormenta, lo que permite una fácil actualización de microscopía de fluorescencia regular a microscopía de alta resolución^5,6.

TORMENTA no se ha aplicado extensamente en células fotosintéticas, como cianobacterias, algas y células vegetales con cloroplastos^7,8, que es debido al hecho de la tormenta requiere intensidad de láser de alta a la unidad photoswitching. El láser de alta intensidad desfavorable excita autofluorescence fuerte fondo en células fotosintéticas e interfiere con la localización de una sola molécula en proyección de imagen de la tormenta. Para poder utilizar tormenta para investigar las estructuras subcelulares o interacciones de la proteína en células fotosintéticas, hemos desarrollado un protocolo fotoblanqueo para calmar el fondo autofluorescence señales⁹. En un procedimiento rutinario de tinción inmunofluorescente, ejemplares están expuestos a la luz blanca de alta intensidad durante la etapa de bloqueo que reduce el autofluorescence de células fotosintéticas para cumplir los requisitos para la tormenta. Así, este protocolo hace posible investigar organismos pigmentados con tormenta.

Aquí, describimos el protocolo para usar la tormenta a la imagen de la organización del anillo de FtsZ en la picocyanobacterium unicelular Prochlorococcus. FtsZ es una proteína citoesquelética altamente conservada de tubulina-como que se polimeriza para formar una estructura de anillo (el anillo Z) alrededor de la circunferencia de un celular de¹⁰ y es esencial para la división celular¹¹. Conserva Prochlorococcus células son primer photobleached para reducir el fondo autofluorescent y immunostained con un anticuerpo primario anti-FtsZ, y entonces un anticuerpo de IgG (H+L) de anti-conejo secundario se conjuga con un fluoróforo (p. ej. , Alexa Fluor 750). Finalmente, la tormenta se utiliza para observar a las organizaciones detalladas de anillo de FtsZ en Prochlorococcus en etapas del ciclo de la célula diferentes.

Protocolo

1. preparación y fijación de la muestra

1. Inocular 1 mL de axénicos Prochlorococcus MED4 a 5 mL de base de agua de mar Pro99 medio¹². Crecer culturas Prochlorococcus a 23 ° C a la luz con una intensidad de 35 μmol fotones/m²s. cinco días más tarde, recoger 1 mL de cultivo en un tubo de 1,5 mL.
   Nota: Cinco días después de la inoculación, Prochlorococcus MED4 llegará la última fase de registro, con aproximadamente 10⁸ células/mL, que es apropiado para la proyección de imagen de la tormenta.
2. Añadir 100 μl de formaldehído recién preparado de 25% paraformaldehido (PFA) (w/v) y 2 μl de glutaraldehido 50% en el tubo de 1,5 mL para fijar la cultura. Incubar la muestra en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos.
   Nota: La muestra se mantuvo en la oscuridad para la fijación ya que el glutaraldehído es luz sensible.
3. Desactivación de la muestra a 13.500 x g durante 1 min; a continuación, quite el sobrenadante y resuspender las células en 100 μl de medio Pro99¹². Almacenar la muestra a 4 ° C hasta immunostaining.

2. cubrir primero del cubreobjetos con perlas de poliestireno

Nota: Perlas de poliestireno se consideran como el marcador fiduciario para corrección de deriva.

1. Vórtice original frasco de poliestireno granos y preparar una dilución de 1: 20,000 con etanol al 50% como trabajo de la mezcla.
2. Encender la placa, ajuste la temperatura a 120 ° C y colocar el cubreobjetos sobre la placa caliente.
3. Carga de 100 μl de la mezcla de trabajo en cada cubreobjetos. Incubar el cubreobjetos sobre la placa durante 10 minutos y, luego, transferir cuidadosamente el cubreobjetos a placas de Petri para el almacenamiento a temperatura ambiente.
   Nota: El lado con los granos que se le atribuye debe afrontar, y las células deben fijarse en el mismo lado. Los granos son inmovilizados sobre el cubreobjetos y utilizados para la corrección de la deriva muestra en tiempo real durante la proyección de imagen de la tormenta. Después de la inmovilización de las cuentas, no pueden ser flameado el cubreobjetos.

3. capa de Poly-L-lisina en el cubreobjetos bola recubierta

Nota: Esto se hace para la inmovilización de células cianobacterianas.

1. Añada 100 μl de poli-l-lisina (1 mg/mL) en el centro del cubreobjetos con el grano recubierto hacia arriba. Dejar reposar 30 min a temperatura ambiente.
2. Utilice una pipeta aspire poly-L-lisina y transferirlo a un tubo de 1,5 mL. Guardar la poli-l-lisina a 4 ° C para su reutilización.
3. Enjuague el cubreobjetos con 10 mL de agua ultra filtrada en caja Petri de 60 mm y luego secar brevemente el cubreobjetos sobre una toalla de papel.
4. Almacenar el cubreobjetos en caja Petri (100 mm) para uso posterior. Para evitar el accesorio del cubreobjetos en el plato, línea de la caja Petri con una capa de parafilm.
   Nota: El cubreobjetos, cubierto primero con poli-l-lisina y granos pueden almacenarse a temperatura ambiente durante al menos medio año. Por lo tanto, preparar un lote de cubreobjetos de antemano es muy recomendable.

4. inmovilización de células sobre cubreobjetos

1. Transferir un cubreobjetos cubierto primero a una nueva caja Petri con parafilm en la parte inferior, que se refiere a como la cubeta de tinción de aquí en adelante. Carga 100 μl de la muestra fija en el cubreobjetos y deje reposar 30 min permitir el accesorio de celular.
2. Transferir el cubreobjetos a un pozo de una placa de 12 pozos, que se denomina el plato lavarse en adelante. Añadir 1 mL de tampón fosfato salino (PBS) (10 m m de Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl y 2.7 mM KCl, pH 7,4) al pozo para lavar lo cubreobjetos. Quitar el tampón PBS y añadir un nuevo tampón PBS para lavar lo cubreobjetos otra vez.

5. permeabilización de células cianobacterianas

1. Quitar el tampón PBS con una pipeta. Añadir 1 mL de buffer de permeabilización recién preparada hasta el pozo de la placa de lavado, que contiene 0,05% no iónicos detergente-100 (v/v), 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8.0) y 0,2 mg/mL lisozima.
2. Incubar el plato lavarse a 37 ° C por 20 min. A continuación, eliminar el buffer de permeabilización.
3. Añadir 1 mL de tampón PBS y coloque el plato de lavado en un agitador que agita suavemente el plato de lavado para 5 minutos Retire el tampón PBS. Repetir este paso 3 veces para lavar lo cubreobjetos.

6. fotoblanqueo de la clorofila de pigmentos en un paso de bloqueo

1. Transferir el cubreobjetos a la cubeta de tinción. Añadir 50 μl de solución amortiguadora de bloqueo, que contiene detergente no iónico-100 de 0.2% (v/v) y 3% (v/v) de suero de cabra, en la parte superior el cubreobjetos.
2. Toda la coloración de la placa de hielo y muévala en la fuente de luz de xenón de fotoblanqueo de al menos 60 minutos, con una intensidad de luz en 1.800 μmol fotones/m²·s.
3. Después de photobleaching y bloqueo, retire con cuidado el amortiguador de bloqueo mediante la adsorción con el borde de una toalla de papel.
   Nota: La intensidad de luz de xenón es tan alta que se necesita un par de gafas de sol adecuadas para la protección de los ojos. Mientras tanto, envuelva la fuente de luz y la placa con papel de aluminio para evitar la filtración de luz, que puede causar daño de ojo. Verifique el cubreobjetos cada 15 minutos que el cubreobjetos quede húmedo. Si el cubreobjetos está seco, añadir 50 μl de solución amortiguadora de bloqueo.

7. Unión de anticuerpos

1. Disolver el anti -Anabaena FtsZ anticuerpo en 200 μL de agua de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
2. Diluir 1 μl de anticuerpo anti-FtsZ en 99 μl de solución amortiguadora de bloqueo. Añadir 50 μl de anticuerpo primario diluido sobre el cubreobjetos e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
3. Transferir el cubreobjetos en el plato de lavado. Añada 1 mL de tampón PBS y coloque el plato de lavado en un batido. Sacuda suavemente el plato de lavado durante 5 minutos repetir este paso 3 veces para lavar lo cubreobjetos.
4. Transferir el cubreobjetos a la cubeta de tinción. Diluya 1 μl de un anticuerpo secundario en 500 μl de solución amortiguadora de bloqueo. Añadir 50 μl de anticuerpo secundario diluido en el cubreobjetos e incubar durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente.
5. Transferir el cubreobjetos en el plato de lavado. Lave con 1 mL de tampón PBS en una coctelera Boston. Sacuda suavemente el plato de lavado durante 5 minutos abrigo el lavado en plato con papel de aluminio para hacerlo resistente a la luz. Repetir este paso 3 veces.
6. Añadir 500 μl de formaldehído recién preparado de paraformaldehído al 4% (PFA) (w/v) al pozo. Incubar el cubreobjetos por 15 min en oscuridad a temperatura ambiente.
7. Eliminar el formaldehído y repita el paso de lavado 3 x.
8. Guarde el cubreobjetos en tampón PBS a 4 ° C en la oscuridad hasta la proyección de imagen.

8. preparación de la tormenta de búfer

1. Preparar 1 mL de tampón según la tabla 1, inmediatamente antes de la proyección de imagen de tormenta la proyección de imagen.
   Nota: Como la vida útil de la imagen buffer está sobre 2 h, preparar frescos, justo antes de su uso. Evite el vórtex después de la adición de glucosa oxidasa y catalasa.
   PRECAUCIÓN: Metil viológeno es material venenoso. Por favor manejar con especial cuidado. Cyclooctatetraene es clasificado como un cancerígeno Cat. 1 química. Por favor evite la inhalación y contacto con la piel y la solución cyclooctatetraene y búfer de imagen en una campana química.

9. imagen adquisición de datos de la tormenta

1. Coloque el cubreobjetos en la cámara de carga (figura 1). Cargar el buffer de imagen recién preparado suavemente en la cámara para evitar el lavado de las células cianobacterianas. Coloque un cubreobjetos rectangular en la parte superior del imagen buffer para prevenir su reacción con el oxígeno en el aire. Evitar las burbujas de aire captura debajo del cubreobjetos.
2. Encienda la cámara, la luz del LED y el láser. Software abierto de la tormenta para la adquisición de la imagen, determinación de la posición del centroide y muestra deriva corrección¹³.
3. Añadir la mitad una gota de aceite de inmersión sobre la lente. Cargar la cámara y asegúrese de que la lente del objetivo hace contacto con el cubreobjetos.
4. Examinar la señal con un laser de 750 nm.
   Nota: Siempre incluya segunda tinción de anticuerpos menos control negativo para asegurar que la autofluorescencia se disminuye.
5. Identificar un área de muestra que contiene células y marcadores de referencia. Inicie el software para corrección de deriva de la muestra.
   Nota: en general, el área de muestra ideal contiene 10-30 células. Mientras tanto, las células deben estar separadas para evitar cualquier superposición de las células.
6. Adquirir una imagen de gran campo como referencia, con la multiplicación de la electrónica de cámara (EM) de ganancia en 300 y un tiempo de exposición de 30 ms (figura 2A).
7. Aumentar la intensidad del láser de excitación de 750 nm a una energía más alta, aproximadamente 4,5 kW/cm². Una vez que los fluoróforos con transición a un patrón parpadeo escaso, adquirir una imagen de súper-resolución por la recogida de 10.000 marcos a 33 Hz (figura 2B).
   Nota: Si no están aislados los fluoróforos, espere un par de minutos hasta que los fluoróforos más están activadas al Estado oscuro y las moléculas aisladas solo parpadean secuencialmente. El número de fotogramas aquí descritos es conveniente para nuestra muestra y debe ser optimizado para otras estructuras específicas.

10. reconstrucción de imágenes de la súper resolución de datos

1. Utilizar un plugin llamado QuickPALM (Tabla de materiales)¹⁴ en ImageJ para reconstruir una imagen de súper-resolución 3-d color.
   Nota: Una preliminar cromática imagen (figura 2) junto con una barra codificada por colores de la escala aparece (figura 2). El color representa la profundidad en el eje z.
2. Para demostrar el 3-d de la estructura en un video, construir una pila de súper-resolución imágenes con eje seccionaron cada 10 nm utilizando QuickPALM¹⁴. Ajustar el brillo de las pilas y duplicar la pila de la célula objetivo. Utilizar un plugin llamado 3D Viewer (Tabla de materiales)¹⁵ en ImageJ para generar la imagen 3D de la célula. Registro de la rotación de la estructura 3-d para fines de demostración.

Resultados

TORMENTA alcanza proyección de imagen de súper-resolución activando fotoconmutables individuales fluoróforos estocástico. Se registra la ubicación de cada fluoróforo y una súper resolución de imagen se construye entonces basado en estos puntos⁴. Por lo tanto, la precisión de la localización del fluoróforo es importante para la reconstrucción de imagen de la estupendo-resolución. Los espectros de absorción de Prochlorococcus pico en 447 nm y ...

Discusión

En este protocolo, se describe un procedimiento para reducir significativamente la autofluorescencia de la cianobacteria Prochlorococcus (figura 3) y, luego, immunostain las proteínas en las células, que nos permitieron utilizar tormenta para estudiar la FtsZ 3D morfologías de anillo en Prochlorococcus (figura 4). Este protocolo puede adoptarse para la proyección de imagen de súper-resolución de otros organismos fotosintéticos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polystyrene particles	Spherotech	PP-20-10	2.0-2.4 µm
Coverslip	Marienfeld	0111580	18 mm ∅, Thickness No. 1
Ethanol	Scharlau	ET00021000
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P9155	mol wt 70,000-150,000
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Glutaraldehyde solution, 50%	Sigma-Aldrich	340855
PBS	Sigma	P3813
Triton X-100	Sigma	T8787
EDTA Disodium Salt, 2-hydrate	Gold biotechnology	E-210-500
Trizma base	Sigma	T1503
Lysozyme	Sigma	L6876
Goat serum	Sigma	G9023
anti-Anabaena FtsZ antibody	Agrisera	AS07217
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Life Technologies	A-21039	conjugated with Alexa Fluor 750
D-Glucose Anhydrous	Fisher Scientific	D16-1
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960
Methyl Viologen	Sigma-Aldrich	856177
Cyclooctatetraene	Sigma-Aldrich	138924
tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	646547
Glucose Oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
XD-300 Xenon light source			250 W
STORM microscope	NBI	SRiS microscope
Rohdea	NBI	SRiS 3.0	software for imaging acquisition
Luna	NBI	SRiS 3.0	software for drifting correction
QuickPALM			https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis
3D Viewer			http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home