Photoblanchiment permet l’imagerie de l’anneau FtsZ dans la cyanobactérie Prochlorococcus Super-résolution

Résumé

Nous décrivons ici une méthode de photoblanchiment afin de réduire l’autofluorescence des cyanobactéries. Après photoblanchiment, microscopie stochastique reconstruction optique est utilisée pour obtenir des images de Super-résolution en trois dimensions de l’anneau FtsZ cyanobactérie.

Résumé

Microscopie de Super-résolution a été largement utilisée pour étudier les interactions entre protéines et structures subcellulaires chez de nombreux organismes. Des organismes photosynthétiques, cependant, la résolution latérale de l’imagerie de Super-résolution est seulement ~ 100 nm. La faible résolution résulte principalement de l’arrière-plan de l’autofluorescence élevé des cellules photosynthétiques causée par des lasers de haute intensité qui sont nécessaires pour l’imagerie Super-résolution, telles que la microscopie stochastique reconstruction optique (tempête). Nous décrivons ici une méthode assistée par photoblanchiment STORM a été mis au point récemment pour l’imagerie de la marine picocyanobacterium Prochlorococcus. Après photoblanchiment, l’autofluorescence de Prochlorococcus est effectivement réduit donc cette tempête peut être effectuée avec une résolution latérale d’environ 10 nm. En utilisant cette méthode, nous acquérir l’organisation in vivo en trois dimensions (3d) de la protéine FtsZ et caractériser les quatre différentes morphologies de bague FtsZ durant le cycle cellulaire de Prochlorococcus. La méthode que nous décrivons ici pourrait être adoptée pour l’imagerie de Super-résolution d’autres organismes photosynthétiques.

Introduction

Microscopies Super-résolution peuvent briser la limite de diffraction de la lumière et fournir des images dans les résolutions de diffraction sous (< 200 nm). Ils ont été largement utilisés dans de nombreux organismes pour étudier la localisation des protéines et des structures subcellulaires. Major Super-résolution méthodes de microscopie comprennent illumination structurée microscopie (SIM), stimulée par la microscopie d’appauvrissement de la couche d’émission (STED), STORM et microscopie de localisation de photoactivation (PALM). Les mécanismes et les applications de ces super-résolution microscopes ont été examinés ailleurs^1,2.

ORAGE peut aboutir à une résolution aussi élevée que 10 nm par séparation spatiale^3,4. Pour STORM, qu’une seule molécule dans une région limitée par la diffraction est activée (« on ») et le reste des molécules restent inactivés (« off »). Par une accumulation de marche rapide et - à côté de molécules simples, une image « diffraction-illimité » peut être généré³. Pendant ce temps, plusieurs sortes de colorants organiques et des protéines fluorescentes sont applicables dans la tempête, ce qui permet une mise à niveau facile de microscopie de fluorescence ordinaire à la microscopie à haute résolution^5,6.

TEMPÊTE n’a pas été largement appliquée dans les cellules photosynthétiques, comme les cyanobactéries, algues, et les cellules végétales avec chloroplastes^7,8, qui est dû au fait que tempête exige intensité laser haute de disque photoswitching. Le laser de haute intensité défavorablement excite fort autofluorescence fond dans les cellules photosynthétiques et interfère avec la localisation de la molécule unique en imagerie de la tempête. Afin d’utiliser tempête pour étudier les structures subcellulaires ou les interactions de protéine dans les cellules photosynthétiques, nous avons élaboré un protocole de photoblanchiment pour étancher l’arrière-plan autofluorescence signaux⁹. Dans une méthode systématique de la coloration par immunofluorescence, spécimens sont exposés à la lumière blanche de forte intensité pendant l’étape de blocage, qui abaisse l’autofluorescence des cellules photosynthétiques pour répondre aux exigences de la tempête. Par conséquent, ce protocole rend possible d’enquêter sur les organismes pigmentés avec STORM.

Nous décrivons ici le protocole pour utiliser tempête à l’image de l’organisation de bague FtsZ dans le picocyanobacterium unicellulaire Prochlorococcus. FtsZ est une protéine du cytosquelette de tubuline-comme hautement conservée qui se polymérise pour former une structure d’anneau (l’anneau Z) autour de la circonférence d’une cellule¹⁰ et est essentielle pour la division cellulaire¹¹. Prochlorococcus cellules sont photobleached première pour réduire l’arrière-plan auto-fluorescente et immunomarquage avec un anticorps anti-FtsZ primaire et ensuite, un anticorps secondaire au anti-lapin IgG (H + L) se sont réuni avec un fluorophore (par exemple , Alexa Fluor 750). Finalement, STORM est utilisé pour observer les organisations d’anneau FtsZ détaillées dans Prochlorococcus pendant les étapes du cycle de cellules différentes.

Protocole

1. préparation des échantillons et Fixation

1. Inoculer 1 mL d’axéniques Prochlorococcus med 4 à 5 mL des axée sur l’eau de mer Pro99 moyenne¹². Culture de Prochlorococcus cultures à 23 ° C, sous la lumière d’une intensité de 35 µmol photons/m²s. cinq jours plus tard, prélever 1 mL de culture dans un tube de 1,5 mL.
   NOTE : Cinq jours après l’inoculation, Prochlorococcus MED4 atteindra la phase logarithmique tardive, avec environ 10⁸ cellules/mL, qui est appropriée pour l’imagerie de la tempête.
2. Ajouter 100 µL de formaldéhyde fraîchement préparé à partir de paraformaldéhyde à 25 % (PFA) (p/v) et 2 µL de glutaraldéhyde à 50 % dans le tube de 1,5 mL pour fixer la culture. Incuber l’échantillon dans l’obscurité à température ambiante pendant 20 min.
   NOTE : L’échantillon a été gardé dans l’obscurité pour la fixation glutaraldéhyde étant lumière sensible.
3. Tournez en bas de l’échantillon à 13 500 g pendant 1 minute ; Ensuite, retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 µL de la moyenne Pro99¹². Conserver l’échantillon à 4 ° C jusqu'à l’immunomarquage.

2. PRELIMINAIRE de la lamelle avec billes de polystyrène

NOTE : Billes de polystyrène sont considérés comme le marqueur fiducial pour la correction de la dérive.

1. Vortex l’original flacon de billes de polystyrène et préparer une dilution au 1/20 000 avec 50 % d’éthanol dans le lisier de travail.
2. Tourner sur la plaque chauffante, régler la température à 120 ° C et placer les lamelles sur la plaque chaude.
3. Charger 100 µL de lisier de travail sur chaque lamelle couvre-objet. Incuber le couvre-objet sur la plaque chauffante pendant 10 min et, ensuite, transvaser avec soin les lamelles couvre-objet pour boîtes de Pétri pour le stockage à température ambiante.
   Remarque : Le côté avec les perles en annexe doit faire face, et les cellules doivent être fixés sur le même côté. Les perles sont immobilisés sur les lamelles et utilisés pour corriger l’échantillon-à la dérive en temps réel pendant la formation image de tempête. Après les perles de l’immobilisation, le couvre-objet ne peut pas être flambé.

3. revêtement de Poly-L-lysine sur la lamelle perle-enduit

NOTE : Ceci est fait pour l’immobilisation de cellules de cyanobactéries.

1. Ajouter 100 µL de la poly-L-lysine (1 mg/mL) au centre de la lamelle avec le côté recouvert talon vers le haut. Laisser reposer pendant 30 min à température ambiante.
2. Utiliser une pipette aspire la poly-L-lysine seule et transférez-le dans un tube de 1,5 mL avec soin. Enregistrez la poly-L-lysine à 4 ° C pour les réutiliser.
3. Rincez la lamelle avec 10 mL d’eau ultra-filtrée dans un plat de Pétri de 60 mm et sécher ensuite brièvement la lamelle sur une serviette en papier.
4. Stocker la lamelle dans une boîte de Pétri (100 mm) pour un usage ultérieur. Pour empêcher la fixation de la lamelle couvre-objet pour le plat, ligne de la boîte de Pétri avec une couche de parafilm.
   Remarque : La lamelle, recouvertes de perles et de la poly-L-lysine, peut être stockée à température ambiante pendant au moins six mois. Préparer un lot de lamelles couvre-objet à l’avance est donc fortement recommandé.

4. immobilisation des cellules sur la lamelle couvre-objet

1. Transférer une lamelle prêtes à l’emploi à une nouvelle boîte de Pétri avec parafilm au fond, qui sera dénommé le plat coloration désormais. Charger 100 µL de l’échantillon fixe sur la lamelle couvre-objet et laisser reposer pendant 30 min permettre la fixation des cellules.
2. Transférer la lamelle à un puits d’une plaque de 12 puits, qui sera dénommé le lavage plat désormais. Ajouter 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl et 2,7 mM KCl, pH 7,4) dans le puits pour laver la lamelle. Retirer le tampon PBS et ajouter un nouveau tampon PBS pour laver la lamelle à nouveau.

5. la perméabilisation de cellules de cyanobactéries

1. Retirez le tampon PBS à l’aide d’une pipette. Ajouter 1 mL de tampon de perméabilisation fraîchement préparés dans le puits du lavage plat, contenant 0,05 % non ioniques détergent-100 (v/v), 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8,0) et lysozyme de 0,2 mg/mL.
2. Incuber le plat de lavage à 37 ° C pendant 20 min. Ensuite, retirer le tampon de la perméabilisation.
3. Ajouter 1 mL de tampon PBS et placer le plat de lavage sur un agitateur qui secoue doucement le plat de lavage pour 5 min. Retirez le tampon PBS. Répétez cette opération 3 fois pour laver la lamelle.

6. le photoblanchiment de la chlorophylle Pigments dans une étape de blocage

1. Transférer la lamelle dans le plat de coloration. Ajouter 50 µL de tampon de blocage, qui contient 0,2 % (v/v) de détergent non ionique-100 et sérum de chèvre de 3 % (v/v), sur le dessus de la lamelle.
2. Placer l’ensemble plaque sur la glace de coloration et déplacez-le dans la source de lumière au xénon pour photoblanchiment pendant au moins 60 min, avec une intensité lumineuse au 1 800 µmol photons/m²·s.
3. Après photoblanchiment et blocage, retirez soigneusement le tampon de blocage par adsorbant il avec le bord du papier absorbant.
   Remarque : L’intensité de la lumière au xénon est tellement élevée qu’une paire de lunettes de soleil appropriées est nécessaire pour une protection oculaire. Pendant ce temps, envelopper la source lumineuse et la plaque à l’aide de papier d’aluminium pour éviter la fuite de lumière, ce qui peut provoquer des lésions oculaires. Vérifier la lamelle toutes les 15 min pour s’assurer que la lamelle reste humide. Si la lamelle est sèche, ajouter 50 µL de tampon de blocage.

7. anticorps

1. Dissoudre anti -Anabaena FtsZ anticorps dans 200 µL d’eau selon les instructions du fabricant.
2. Diluer 1 µL d’anticorps anti-FtsZ dans 99 µL de tampon de blocage. Ajouter 50 µL d’anticorps primaire dilué sur la lamelle couvre-objet et il incuber à température ambiante pendant 30 min.
3. Transférer la lamelle dans le plat de lavage. Ajouter 1 mL de tampon PBS et placer le plat de lavage sur une secousse. Secouez légèrement le plat de lavage pendant 5 min. répéter cette étape 3 x pour laver la lamelle.
4. Transférer la lamelle dans le plat de coloration. Diluer 1 µL d’un anticorps secondaire dans 500 µL de tampon de blocage. Ajouter 50 µL d’anticorps secondaire dilué sur la lamelle couvre-objet et il incuber 30 min à l’obscurité à température ambiante.
5. Transférer la lamelle dans le plat de lavage. Lavez-le avec 1 mL de tampon PBS sur un agitateur. Secouez légèrement le plat de lavage pendant 5 min. envelopper le plat de laver avec du papier d’aluminium pour le rendre opaque. Répétez cette opération 3 fois.
6. Ajouter 500 µL de formaldéhyde fraîchement préparé à partir de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) (p/v) dans le puits. Incuber le couvre-objet pour 15 min à l’obscurité à température ambiante.
7. Enlever le formaldéhyde et répéter l’étape de lavage 3 x.
8. Conserver la lamelle dans le tampon PBS à 4 ° C dans l’obscurité jusqu'à l’imagerie.

8. préparation de la tempête d’imagerie tampon

1. Préparer 1 mL de tampon conformément au tableau 1, immédiatement avant l’imagerie tempête d’imagerie.
   Remarque : La durée de conservation de la mémoire tampon d’imagerie est environ 2 h, préparez-le fraîche, juste avant son utilisation. Évitez les Vortex après l’addition de glucose oxydase et catalase.
   ATTENTION : Méthyl viologène est matière toxique. Traitez-le avec un soin particulier. Cyclooctatétraène est classée comme cancérogène Cat. 1 chimique. S’il vous plaît éviter toute inhalation et contact avec la peau et faire le cyclooctatétraène solution mère et tampon d’imagerie sous une hotte chimique.

9. image Acquisition de données de la tempête

1. Charger la lamelle dans la chambre de chargement (Figure 1). Charger le tampon d’imagerie fraîchement préparé doucement dans la chambre afin d’éviter le lavage de la cellules de cyanobactéries. Place un lamelle couvre-objet rectangulaire sur le dessus de la mémoire tampon d’imagerie afin d’empêcher sa réaction avec l’oxygène dans l’air. Éviter les bulles d’air de piégeage sous la lamelle.
2. Allumez l’appareil photo, le voyant et le laser. Logiciels ouverts de tempête pour l’acquisition d’images, la détermination de position centroïde et échantillon¹³de la correction de la dérive.
3. Ajouter la moitié d’une goutte d’huile à immersion sur le dessus de la lentille. Charger la chambre et assurez-vous que la lentille de l’objectif entre en contact avec le couvre-objet.
4. Examiner le signal avec un laser de 750 nm.
   NOTE : Toujours inclure un deuxième témoin négatif anticorps-minus-coloration pour s’assurer que l’autofluorescence est diminuée.
5. Identifier une zone de prélèvement qui contient les cellules et les marqueurs fiducial. Lancez le logiciel pour exemple de correction de la dérive.
   Remarque : en général, la zone d’échantillon idéal contient des cellules de 10-30. Pendant ce temps, les cellules doivent être séparés bien afin d’éviter toutes les cellules qui se chevauchent.
6. Acquérir une image de grand champ comme une référence, avec la multiplication des électrons caméra (EM) gagne à 300 et un temps de pose de 30 ms (Figure 2 a).
7. Augmenter l’intensité du laser excitation 750 nm pour une puissance plus élevée, environ 4,5 kW/cm². Une fois les fluorophores ont été transférées dans un modèle clignotant clairsemé, acquérir une image de Super-résolution en recueillant 10 000 cadres à 33 Hz (Figure 2 b).
   Remarque : Si les fluorophores ne sont pas isolés, attendez quelques minutes jusqu'à ce que plusieurs fluorophores sont passés à l’État foncé et les molécules simples isolées scintillent dans l’ordre. Le nombre d’images décrites ici convient pour notre échantillon et doit être optimisée pour d’autres structures ciblées.

10. Reconstruction de Super-résolution Images des données brutes

1. Utiliser un plugin appelé QuickPALM (Table des matières)¹⁴ dans ImageJ pour reconstruire une image de Super-résolution couleur 3D.
   Remarque : Une préliminaire chromatique image (Figure 2) ainsi qu’une échelle de couleur graphique apparaîtra (Figure 2). La couleur représente la profondeur sur l’axe z.
2. Pour démontrer la structure de la 3-d dans une construction de vidéo, une pile de Super-résolution images avec axe z sectionné tous les 10 nm à l’aide de QuickPALM¹⁴. Régler la luminosité des piles et dupliquer la pile de la cellule d’une cible. Utiliser un plugin appelé visionneuse 3D (Table des matières)¹⁵ dans ImageJ pour générer l’image en 3D de la cellule. Enregistrement de la rotation de la structure 3D à des fins de démonstration.

Résultats

TEMPÊTE atteint imagerie Super-résolution en activant des fluorophores individuels ayant stochastique. La position de chaque molécule est enregistrée et une image de Super-résolution est alors construite selon ces emplacements⁴. Par conséquent, la précision de la localisation du fluorophore est importante pour la reconstruction d’image de Super-résolution. Les spectres d’absorption de Prochlorococcus culminer à 447 nm et 680 nmet Prochloro...

Discussion

Dans ce protocole, nous avons décrit une procédure pour réduire de façon significative l’autofluorescence de la cyanobactérie Prochlorococcus (Figure 3) et, ensuite, réagissent les protéines dans les cellules, ce qui nous a permis d’utiliser la tempête afin d’étudier la FtsZ 3D morphologies anneau en Prochlorococcus (Figure 4). Ce protocole pourrait être adopté pour l’imagerie de Super-résolution chez d’autres organismes p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polystyrene particles	Spherotech	PP-20-10	2.0-2.4 µm
Coverslip	Marienfeld	0111580	18 mm ∅, Thickness No. 1
Ethanol	Scharlau	ET00021000
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P9155	mol wt 70,000-150,000
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Glutaraldehyde solution, 50%	Sigma-Aldrich	340855
PBS	Sigma	P3813
Triton X-100	Sigma	T8787
EDTA Disodium Salt, 2-hydrate	Gold biotechnology	E-210-500
Trizma base	Sigma	T1503
Lysozyme	Sigma	L6876
Goat serum	Sigma	G9023
anti-Anabaena FtsZ antibody	Agrisera	AS07217
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Life Technologies	A-21039	conjugated with Alexa Fluor 750
D-Glucose Anhydrous	Fisher Scientific	D16-1
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960
Methyl Viologen	Sigma-Aldrich	856177
Cyclooctatetraene	Sigma-Aldrich	138924
tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	646547
Glucose Oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
XD-300 Xenon light source			250 W
STORM microscope	NBI	SRiS microscope
Rohdea	NBI	SRiS 3.0	software for imaging acquisition
Luna	NBI	SRiS 3.0	software for drifting correction
QuickPALM			https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis
3D Viewer			http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home