大鼠模型中的面部神经外科研究同氧抑制与再生

摘要

该协议描述了大鼠模型中面部神经手术的可重复方法，包括各种可诱导损伤模式的描述。

摘要

该协议描述了研究大鼠面部神经损伤模型中的六角再生和抑制的一致和可重复的方法。面部神经可以沿其整个长度进行操纵，从颅内部分到外时过程。用于再生特性实验研究的主要神经损伤类型有三种:神经挤压、截断和神经间隙。可能的干预范围很广，包括神经手术操作、神经活性试剂或细胞的输送，以及中央或终末期器官操作。该模型在研究神经再生方面的优点包括简单性、可重复性、物种间一致性、大鼠的可靠生存率以及相对于鼠型增加解剖尺寸。其局限性涉及与小鼠模型相比，基因操作更为有限，大鼠的再生能力更胜一等，因此面部神经科学家必须仔细评估恢复的时间点，以及是否将结果转化为高等动物和人类研究。面部神经损伤大鼠模型允许功能性、电生理和组形参数，用于神经再生的解释和比较。因此，它具有巨大的潜力，进一步理解和治疗面部神经损伤在人类患者的破坏性后果。

引言

头部和颈部部位的颅神经损伤可继发先天性、传染性、特发性、致源性、创伤性、神经学、肿瘤或全身病因^1。颅神经VII，或面部神经，通常受到影响。面部神经功能障碍的发生率可能很大，因为它每年影响每10万人20至30人^2。面部神经的主要运动分支是时态、酶、布卡、边缘性腺和颈椎分支;根据所涉及的分支，后果可能包括口腔无能或流口水、角膜干燥、视觉场阻塞继为普托西斯、肌张力障碍或面部不对称^22、3。3长期发病包括同步性现象，或一个面部肌肉群的非自愿运动，试图自愿收缩一个独特的面部肌肉群。眼腔同步性是最常见的异常再生作为面部神经损伤的后遗症，导致功能障碍，尴尬，自尊下降，生活质量低下^3。对单个分支的伤害决定了有选择地受损的功能。

面部神经损伤的临床治疗效果不达标，需要进一步研究，以改善效果。类固醇可以缓解急性面部神经肿胀， 而肉毒杆菌是有用的天生运动;但是，在医生的军备中，主要的重建选择包括通过神经修复、替代或恢复^{33、4、5、64,5,6}进行手术干预。根据面部神经损伤的类型，面部神经外科医生可能使用多种选择。对于简单的截断，神经再抗是有用的，而电缆移植修复更适合神经缺陷;为了恢复功能，外科医生可以选择静态或动态面部恢复手术。在许多面部神经损伤和随后的修复的情况下，即使在有经验的面部神经外科医生手中，最好的结果仍然导致持续的面部不对称和功能损害^7。

这些不理想的结果刺激了对面部神经再生的广泛研究。广泛的关注主题包括完善和创新神经修复技术，确定各种神经再生因素的影响，以及评估特定神经抑制剂的潜力，以帮助对抗合成酶^{88，9，10，119,10,11}的长期结果。虽然体外模型可用于评估一些有利于生长或抑制因子的特征，但最好通过可翻译的动物模型完成关于这一主题的真正转化研究。

决定使用哪种动物模型可能具有挑战性，因为研究人员已经利用了大型动物，如绵羊和小动物模型，如老鼠^{12，13。12,}虽然大型动物模型提供理想的解剖可视化效果，但使用它们需要专用设备和人员，不易或容易获得。此外，推动一项研究来证明效果可能很高，而且可能不属于许多科学中心的可行范围。因此，小型动物模型被最常用的。小鼠模型可用于评估与面部神经手术相关的一些结果;然而，神经长度的有限会限制科学家模拟某些模式的能力，如大间隙损伤^14。

因此，大鼠鼠原型已成为科学家可以执行创新外科手术或利用抑制或促进生长因子并评估各种结果参数效果的主力模型。大鼠面部神经解剖学是可预测和容易接近在一个可重复的方式。与鼠标模型相比，其规模更大，允许对各种手术缺陷进行建模，范围从简单的截面到5毫米的间隙^{15，16。15,}这进一步允许在缺陷部位应用复杂的干预，包括局部因子的放置、因子的神经内注入，以及等体移植或桥17、18、19、20、21、22、23。^{17,18,19,20,21,22,23}

大鼠的温顺性质，其可靠的解剖学，其有效神经再生的倾向，允许收集许多结果措施，以回应上述手术模式的伤害^24。通过大鼠模型，面部神经科学家能够通过免疫组化学评估对损伤、神经和肌肉组学结果的电生理反应，通过跟踪颤垫的运动和评估眼闭合的功能结果，以及通过荧光或共聚焦显微镜，通过荧光或^,共聚焦显微镜，包括11、22、23、25、26、27、28、29^,27,28等29微微和宏观变化。^{11,22,2325,26}因此，以下协议将概述对大鼠面部神经的手术方法以及可诱发的损伤模式。

研究方案

所有干预措施均严格按照国家卫生研究院（NIH）准则进行。该实验协议在实施前得到了密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。使用了十周大的成年雌性斯普拉格-道利大鼠。

1. 手术前

1. 确保手术前有适当的消毒手术器械、镇痛药、麻醉药物和氧气。有关完整列表，请参阅材料表。

2. 术前设置

1. 确保有足够的工作空间，包括至少两个人（外科医生和一名助理）的空间。
   注: 需要专用操作台、麻醉机设置空间以及足够的存储空间，用于消毒和备份耗材。
2. 校准操作显微镜，以便在手术过程中使用。确保外科医生能够通过在手柄/按钮上放置消毒盖来调整显微镜和变焦/对焦按钮的手柄
   注:我们在手柄/按钮上使用了消毒铝箔。

3. 麻醉和准备

1. 将动物放入麻醉室，通过1.8%的异氧酶和0.9升/分钟的氧气诱导一般麻醉。
   1. 通过评估自发呼吸和评估意识，通过评估动物对脚趾捏的鬼脸反应，确认麻醉的充足平面。
2. 双边涂抹眼睛润滑剂，防止角膜刺激或干燥。
3. 用剃须刀或自动钳子剃须操作部位。
   1. 此时通过耳标或尾标签/标记建立大鼠识别方法。
4. 沿动物背部注射0.05毫克/千克丁丙诺啡的皮下注射，以预防术后疼痛。

4. 手术方法和损伤模式

1. 将动物转移到操作台，然后通过无锥体继续气体流动。确保加热垫位于动物和无菌场下方，以保持其体温。
2. 放置消毒纱布（卷起并用胶带固定），用作大鼠的颈辊;这将提供外科领域的增露。请注意，动物的适当定位对于有效的神经识别和解剖至关重要。
3. 为手术准备动物的面部皮肤。使用氯西丁或碘基溶液擦洗手术部位3倍，交替使用70%乙醇，以确保消毒。
4. 如果需要，计划并标记手术切口。在前后朝方向操纵肌侧耳，确定后侧皮肤的自然折叠。
5. 使用锋利的虹膜剪刀或 15 号刀片在后眼褶皱中采用 4-5 mm 切口。这可以在以后的程序中根据需要展开。
6. 通过直接的皮下筋膜进行直接解剖，并放置一个微威特兰伸缩器，以提高暴露。请注意，该地区可能有小口径血管;最好通过威特兰的缩回器优胜劣地收回这些。
7. 识别前挖角肌肉，因为它沿着头骨底部向其插入方向以低劣方向移动。
   1. 沿着插入点轻轻地通过肌肉腹部扩散，露出前腹部的肌腱。请注意，肌腱显示为一个膜状的白色过程，从肌肉中发出，在颅底上插入固体。
8. 在识别前肌及其肌腱后，调整 Weitlaner 收缩器以进一步缩回肌肉腹部。请注意，随后暴露的区域是面部神经主干所在的三维空间。
   注:这个区域被头骨底座等优越和带合，横向由前部肌，后经耳道，低劣地由颈部结构，包括表面的时动脉。
9. 充分暴露后，识别面部神经的主躯干，因为它从脑肌腱下方低劣地移动，从颅骨底部退出节块肌。请注意，神经显示为珍珠白线，包裹在动物的法罗蒂-马塞西亚。出于以下原因，进一步暴露神经时要谨慎。
   1. 避免积极的解剖或垂直扩散，以防止拉伸性神经普拉夏损伤。
   2. 避免侵略性后背和医疗定向解剖，以防止违反违反细组织覆盖耳道，因为这可能引入中耳菌进入手术领域。
   3. 避免通过宽泛的教育和低方向的解剖破坏表面的时空动脉。请注意，损伤将通过轻快的、脉动出血来识别。
      1. 如果动脉受伤，使用棉尖施用器或无菌纱布通过钳子施加提示压力。止血剂或液体纤维蛋白密封剂可以放置在附近。请记住，动物可能需要皮下注射0.9%无菌盐水，以稳定液体。
10. 跟踪主躯干的错位，沿着神经向低劣的方向解剖，从舱红色前去者的出口中脱差。
    1. 延长原始切口，使神经及其分支完全暴露。小心避免帕罗蒂腺的中断，因为这可能导致术后异体。
11. 诱导所需的伤害模式，如下所示。
    1. 对于挤压损伤，使用光滑表面的珠宝商钳子，紧紧抓住神经并压缩它^9。在 30s 期间对神经施加恒定和可重复的压力，以确保适当的挤压损伤。
    2. 对于简单的截断，用细齿钳抓住覆盖神经的筋膜或直接的外皮，并使用锋利的微剪刀用一次切口在所需点清洁地转过神经。小心避免用钳子在神经上过度牵引。
    3. 对于神经间隙模型，使用与简单截断损伤类似的方法创建所需的神经间隙。使用棉尖施用器切口的消毒轴，用于所需的神经间隙长度-术中，以确保动物之间的损伤模式相似。

5. 伤口封闭

1. 用无菌盐水灌溉伤口，用无菌纱布擦干伤口。
2. 用可吸收缝合线以简单、皮下的方式近似皮肤边缘，或使用皮肤胶或伤口夹，伤口闭合也是可以接受的。通过深到表面咬一个皮肤边缘，然后随后对相反的皮肤边缘进行表面到深的叮咬，放置埋藏的缝合线。

6. 术后恢复

1. 管理非类固醇抗炎镇痛剂（如0.05毫克/千克丁丙诺啡和0.5毫克/千克卡普罗芬）的皮下注射术，用于术后疼痛控制。沿着动物的背部注射。
2. 停止麻醉剂的给剂，让动物再吸入氧气1分钟。
3. 将动物放在加热（通过热灯），无菌笼子没有床上用品材料，以避免意外摄入。请注意，动物通常会在1-2分钟内表现出恢复的迹象，并可能显得迷失方向，后腿功能恢复延迟。
4. 将动物送回适当住房单元的笼子，并在术后#1施用术后镇痛药，以确保持续预防疼痛。
5. 每天对动物进行2次监测，以评估是否有营养不良、角膜刺激或手术部位感染的迹象，并维持适当的手术记录。
   1. 如果体重减轻显著，以皮下方式施用0.9%无菌盐水。
   2. 每天涂抹润滑眼药膏，直到动物的眨眼反射重新建立。

结果

在最初的外科手术后，有两种主要的结果测量:活体动物的连续测量和需要牺牲动物的测量。连续测量的例子包括电生理测定，如复合肌肉动作势谱测量^30，通过激光辅助或摄像手段⁹评估面部肌肉运动，甚至重复现场成像荧光转基因动物面部神经的再生^{31，32。,32}图1演示?...

讨论

大鼠面部神经损伤模型已成为最通用的系统，评估神经营养因子，由于其手术可及性，分支模式，和生理意义27，29，33，34，35，36。^{27,29,33,34,35,36}视频演示与转基因动物数据应用的结合，为神经再生现象的科学研究提供了新的可能。该模型允许对创?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8% isoflurane	VetOne	13985-030-40
11-0 nylon microsutures	AROSuture	TK-117038
4-0 monocryl suture	VWR	75982-084
Buprenorphine SR	ZooPharm	MIF 900-006
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
Chlorhexidine	VWR	IC19135805
Jeweler forceps	VWR	21909-458
Micro Weitlaner retractor	VWR	82030-146
Micro-scissors	VWR	100492-348
Mini tenotomy scissors	VWR	89023-522
Number 15 scalpel blade	VWR	102097-834
Operating microscope	Leica
Petrolatum eye gel	Pharmaderm	B002LUWBEK
Sterile water	VWR	89125-834
Tissue adhesive	Vetbond, 3M	NC9259532
Water conductor pad	Aqua Relief System	ARS2000B
Bupivacaine			Use as a local analgesic