Chirurgie du nerf facial dans le modèle de rat pour étudier l’inhibition et la régénération axonales

Résumé

Ce protocole décrit une approche reproductible à la chirurgie du nerf facial dans le modèle de rat, y compris des descriptions de divers modèles inductibles de blessure.

Résumé

Ce protocole décrit des méthodes cohérentes et reproductibles pour étudier la régénération et l’inhibition axonales dans un modèle de blessure de nerf facial de rat. Le nerf facial peut être manipulé sur toute sa longueur, de son segment intracrânienne à son cours extratemporal. Il existe trois types primaires de lésions nerveuses utilisées pour l’étude expérimentale des propriétés régénératrices : écrasement de nerf, transection et écart nerveux. La gamme d’interventions possibles est vaste, y compris la manipulation chirurgicale du nerf, l’administration de réactifs ou de cellules neuroactives, et soit des manipulations centrale ou d’organe final. Les avantages de ce modèle pour étudier la régénération nerveuse incluent la simplicité, la reproductibilité, la cohérence interspécifique, les taux de survie fiables du rat, et une taille anatomique accrue par rapport aux modèles murins. Ses limites impliquent une manipulation génétique plus limitée par rapport au modèle de souris et la capacité régénératrice superlative du rat, de sorte que le scientifique de nerf facial doit évaluer soigneusement les points de temps pour la récupération et s’il faut traduire des résultats à des animaux plus élevés et des études humaines. Le modèle de rat pour la blessure de nerf facial permet des paramètres fonctionnels, électrophysiologiques, et histomorphométriques pour l’interprétation et la comparaison de la régénération de nerf. Il bénéficie ainsi d’un potentiel énorme pour promouvoir la compréhension et le traitement des conséquences dévastatrices des lésions nerveuses faciales chez les patients humains.

Introduction

Les lésions nerveuses crâniennes dans la région de la tête et du cou peuvent être secondaires aux étiologies congénitales, infectieuses, idiopathiques, iiatrogéniques, traumatiques, neurologiques, oncologiques ou systémiques¹. Le nerf crânien VII, ou le nerf facial, est généralement affecté. L’incidence du dysfonctionnement du nerf facial peut être significative, car elle affecte 20 à 30 pour 100.000 personnes chaque année². Les principales branches motrices du nerf facial sont les branches temporelles, zygomatiques, buccales, maniibulaires marginales et cervicales; selon la branche impliquée, les conséquences peuvent inclure l’incompétence orale ou baver, sécheresse cornéenne, obstruction visuelle de champ secondaire à la ptosis, dysarthrie, ou asymétrie faciale^2,3. La morbidité à long terme inclut le phénomène de la synkinésie, ou mouvement involontaire d’un groupe de muscle facial, avec la contraction volontaire essayée d’un groupe distinct de muscle facial. La synkinésie ocular-orale est la plus commune de la régénération aberrante comme séquelle de lésions nerveuses faciales et provoque une déficience fonctionnelle, l’embarras, l’estime de soi diminuée, et la mauvaise qualité de vie³. Les blessures aux branches individuelles dictent les fonctions qui sont sélectivement compromises.

Le traitement clinique des lésions nerveuses faciales n’est pas bien normalisé et a besoin de recherches plus poussées pour améliorer les résultats. Les stéroïdes peuvent soulager l’enflure aigue du nerf facial, tandis que le Botox est utile pour temporiser les mouvements synkinetic ; mais, les principales options de reconstruction dans l’armamentarium du praticien impliquent une intervention chirurgicale par la réparation nerveuse, la substitution, ou la réanimation^3,4,5,6. Selon le type de blessure au nerf facial subie, le chirurgien neurotoxique facial peut utiliser un certain nombre d’options. Pour une transection simple, la réanastomose nerveuse est utile alors que la réparation de la greffe de câble est mieux adaptée pour un défaut de nerf ; pour une restauration de la fonction, le chirurgien peut choisir des procédures de réanimation faciale statiques ou dynamiques. Dans de nombreux cas de lésions nerveuses faciales et de réparations subséquentes, même dans les mains de chirurgiens neurotoxiques faciaux expérimentés, le meilleur résultat entraîne toujours l’asymétrie faciale persistante et le compromis fonctionnel⁷.

Ces résultats sous-optimaux ont stimulé la recherche étendue sur la régénération faciale de nerf. Les grands sujets d’intérêt incluent le perfectionnement et l’innovation des techniques de réparation de nerf, la détermination de l’effet de divers facteurs de régénération de nerf, et l’évaluation du potentiel des inhibiteurs neuronaux spécifiques pour aider à combattre le résultat à long terme de la synkinsis^8,9,10,11. Bien que les modèles in vitro puissent être utilisés pour évaluer certaines caractéristiques des facteurs pro-croissance ou inhibiteurs, la recherche translationnelle véritable sur ce sujet est mieux accomplie par l’intermédiaire de modèles animaux traduisibles.

La décision du modèle animal à utiliser peut être difficile, car les chercheurs ont utilisé à la fois de grands animaux, tels que les moutons et les petits modèles animaux, tels que les souris^12,13. Bien que les grands modèles animaux offrent une visualisation anatomique idéale, leur utilisation nécessite un équipement et un personnel spécialisés qui ne sont pas facilement ou facilement disponibles. En outre, l’alimentation d’une étude pour démontrer l’effet pourrait être hautement prohibitif sur le plan des coûts et peut-être ne pas être dans le champ d’application faisable de nombreux centres scientifiques. Ainsi, le petit modèle animal est le plus souvent utilisé. Le modèle de souris peut être utilisé pour évaluer un certain nombre de résultats liés à la chirurgie faciale de nerf ; cependant, la longueur limitée du nerf peut restreindre la capacité du scientifique à modéliser certains modèles, tels que la blessure à grand écart¹⁴.

Ainsi, le prototype de rat murine est apparu comme le modèle de cheval de bataille par lequel le scientifique peut effectuer des procédures chirurgicales innovantes ou utiliser des facteurs inhibiteurs ou pro-croissance et évaluer l’effet à travers un large éventail de paramètres de résultat. L’anatomie du nerf facial du rat est abordée de façon prévisible et facile. Sa plus grande échelle, par rapport au modèle de souris, permet la modélisation d’un large éventail de défauts chirurgicaux, allant de la transection simple à 5 mm lacunes^15,16. Cela permet également l’application d’interventions complexes sur le site de défauts, y compris le placement topique du facteur, les injections intraneurales du facteur, et le placement d’isografts ou de ponts^{17,18,19,20,21,22,23}.

La nature docile du rat, son anatomie fiable, et sa propension à la régénération efficace du nerf permet la collecte de nombreuses mesures de résultats en réponse aux modèles chirurgicaux susmentionnés de la blessure²⁴. Via le modèle de rat, le scientifique du nerf facial est en mesure d’évaluer les réponses électrophysiologic aux blessures, les résultats histologic nerveux et musculaire par immunohistochemistry, les résultats fonctionnels par le mouvement de suivi de la garniture vibrissal et l’évaluation de la fermeture des yeux, et micro- et macroscopiques changements par microscopie fluorescente ou confocale, entre autres^{11,22,23,25,26,27,28,29}. Ainsi, le protocole suivant exposera une approche chirurgicale au nerf facial de rat et aux modèles de blessure qui peuvent être induits.

Protocole

Toutes les interventions ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH). Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Michigan avant sa mise en œuvre. Des rats Sprague-Dawley adultes de dix semaines ont été utilisés.

1. Avant le jour opératoire

1. Assurer un stock approprié d’instruments chirurgicaux stérilisés, de médicaments analgésiques, de médicaments anesthésiques et d’oxygène avant le jour de l’opération. Veuillez consulter la Table des Matériaux pour une liste complète.

2. Configuration préopératoire

1. Assurer un espace de travail adéquat, y compris de la place pour au moins deux personnes (le chirurgien et un assistant).
   REMARQUE : Il est nécessaire d’avoir une table d’opération dédiée, de la place pour la configuration de la machine d’anesthésie et un espace de stockage adéquat pour les fournitures stérilisées et de secours.
2. Calibrer un microscope de fonctionnement pour une utilisation pendant les procédures. Assurez-vous que le chirurgien a la capacité d’ajuster les poignées du microscope et les boutons de zoom/focus en plaçant une couverture stérilisée sur les poignées/boutons
   REMARQUE : Nous avons utilisé du papier d’aluminium stérilisé sur les poignées/boutons.

3. Anesthésie et préparation

1. Placez l’animal dans la chambre d’anesthésie et induisez l’anesthésie générale par 1,8 % d’isoflurane et 0,9 L/min d’oxygène.
   1. Confirmer un plan adéquat d’anesthésie par une évaluation de la respiration spontanée et une évaluation de la conscience en évaluant la réponse grimace de l’animal à une pincée d’orteil.
2. Appliquer le lubrifiant pour les yeux bilatéralement pour se prémunir contre l’irritation cornéenne ou la sécheresse.
3. Rasez le site opérationnel avec un rasoir ou une tondeuse automatique.
   1. Établir une méthode d’identification des rats à ce moment-là, soit par l’intermédiaire d’une étiquette d’oreille ou d’une étiquette ou d’un marquage de queue.
4. Administrer une injection sous-cutanée de 0,05 mg/kg de buprénorphine le long du dos de l’animal pour la prophylaxie contre la douleur postopératoire.

4. Approche chirurgicale et modèles de blessures

1. Transférer l’animal à la table d’opération et poursuivre le débit de gaz par un nez. Assurez-vous qu’une plaque chauffante est placée sous l’animal et le champ stérile pour maintenir sa température corporelle.
2. Placer la gaze stérilisée (enroulée et attachée avec du ruban adhésif) à utiliser comme rouleau de cou pour le rat; ceci fournira une exposition accrue du champ chirurgical. Notez que le positionnement approprié de l’animal est primordial pour l’identification efficace des nerfs et la dissection.
3. Préparer la peau du visage de l’animal pour l’intervention. Utilisez de la chlorhexidine ou une solution à base d’iode pour frotter le site chirurgical 3x, en alternance avec 70% d’éthanol, pour assurer la désinfection.
4. Planifiez et marquez l’incision chirurgicale si désiré. Manipuler l’oreille ipsilateral dans une direction antérieure-postérieure pour déterminer le pliage naturel de la peau postauricular.
5. Mode une incision de 4-5 mm dans le pli postauricular à l’aide de ciseaux d’iris pointus ou une lame numéro 15. Cela peut être élargi plus tard dans la procédure si nécessaire.
6. Disséquez franchement par le fascia sous-cutané immédiat et placez un rétracteur de micro-Weitlaner pour améliorer l’exposition. Notez qu’il peut y avoir des vaisseaux sanguins de petit calibre dans ce domaine; ceux-ci sont mieux évités en se rétractant supérieurement ou de façon inférieure par l’intermédiaire du rétracteur Weitlaner.
7. Identifiez le muscle digastric antérieur pendant qu’il se déplace dans une direction inférieure à supérieure vers son insertion le long de la base du crâne.
   1. Étendre doucement à travers le ventre musculaire le long de son point d’insertion pour révéler le tendon du ventre digastric antérieur. Notez que le tendon apparaît comme un processus blanc filmy émanant du muscle avec une insertion solide sur la base du crâne.
8. Après identification du muscle digastric antérieur et de son tendon, ajustez le rétracteur de Weitlaner pour rétracter davantage le ventre de muscle. Notez que la région exposée par la suite est l’espace tridimensionnel où se trouve le tronc principal du nerf facial.
   REMARQUE : Cette région est délimitée supérieurement et mediment par la base de crâne, latéralement par le muscle digastric antérieur, posteromedially par le canal d’oreille, et inférieurement par les structures du cou, y compris l’artère temporelle superficielle.
9. Après une exposition adéquate, identifier le tronc principal du nerf facial comme il se déplace de façon inférieure sous le tendon du muscle digastric, où il sort des foramen stylomastoid de la base du crâne. Notez que le nerf apparaît comme un cordon blanc nacré, enfermé dans le fascia parotide-masseteric de l’animal. Pratiquez la prudence lorsque vous exposez davantage le nerf, pour les raisons suivantes.
   1. Évitez la dissection agressive, ou les écarts perpendiculaires, pour vous prémunir contre les lésions neuropraxiques à médiation extensible.
   2. Évitez la dissection agressive postérieure et medially dirigée pour se prémunir contre la violation des tissus minces surlysant le conduit auditif car ceci pourrait introduire la flore moyenne d’oreille dans le domaine chirurgical.
   3. Évitez d’endommager l’artère temporelle superficielle par une dissection large et inférieure. Notez qu’une blessure sera identifiée par des saignements pulsatiles vifs.
      1. Si l’artère est blessée, appliquez une pression rapide avec un applicateur à pointe de coton ou une gaze stérile par l’intermédiaire de forceps. Les agents hémostatiques ou le scellant fibrin liquide peuvent être placés à proximité. Gardez à l’esprit que l’animal peut nécessiter une injection sous-cutanée de 0,9% saline stérile pour la stabilisation du liquide.
10. Tracez le tronc principal distally en disséquant le long du nerf dans une direction inférieure, distally de la sortie des foramen stylomastoid.
    1. Étendre l’incision d’origine pour permettre une exposition complète du nerf et de ses branches. Prenez soin d’éviter une perturbation de la glande parotide car cela pourrait entraîner sialocele postopératoire.
11. Induire les modèles de blessures souhaités comme suit.
    1. Pour une blessure d’écrasement, utilisez les forceps du bijoutier à surface lisse pour saisir fermement le nerf et le comprimer⁹. Appliquer une pression constante et reproductible sur le nerf pendant une période de 30 s pour assurer une blessure appropriée d’écrasement.
    2. Pour une transection simple, saisir le fascia surlysant le nerf, ou l’épineurium immédiat, avec des forceps à dents fines, et utiliser des microsciseurs pointus pour transecter proprement le nerf au point désiré avec une seule coupe. Prenez soin d’éviter l’excès de traction sur le nerf avec les forceps.
    3. Pour un modèle d’écart nerveux, créez l’écart nerveux désiré en utilisant une méthode similaire à la simple blessure transection. Utilisez l’arbre stérilisé d’une coupe applicateur à pointe de coton à l’écart nerveux désiré longueur-intraopératoire pour assurer la similitude du modèle de blessure entre les animaux.

5. Fermeture de blessure

1. Irriguer la plaie avec saline stérile et la sécher avec de la gaze stérile.
2. Approximatif les bords de la peau d’une manière simple et sous-cutanée avec des sutures absorbables, ou utilisez de la colle de peau ou des pinces de plaie, qui sont également acceptables pour la fermeture de la plaie. Placez un point enterré en prenant une morsure profonde à superficielle d’un bord de peau, puis une morsure superficielle-à-profonde suivante du bord de peau opposé.

6. Récupération postopératoire

1. Administrer une injection sous-cutanée d’analgésique anti-inflammatoire non stéroïdien (comme 0,05 mg/kg de buprénorphine et 0,5 mg/kg de carprofène) pour le contrôle postopératoire de la douleur. Placez l’injection le long du dos de l’animal.
2. Cessez l’administration de l’agent anesthésique et permettre à l’animal d’inhaler de l’oxygène pendant 1 min de plus.
3. Placez l’animal dans un chaud (via une lampe thermique), cage aseptique dépourvue de matériaux de literie pour éviter l’ingestion accidentelle. Notez que l’animal démontrera généralement des signes de rétablissement dans un délai de 1 à 2 minutes et peut sembler désorienté, avec un rétablissement retardé de la fonction de la jambe arrière.
4. Retournez les animaux dans leurs cages dans l’unité de logement appropriée et administrez des analgésiques postopératoires le jour postopératoire #1 pour assurer la prophylaxie continue contre la douleur.
5. Surveillez les animaux 2x par jour pour évaluer les signes de malnutrition, d’irritation cornéenne ou d’infection par le site chirurgical, et maintenez les journaux chirurgicaux appropriés.
   1. Administrer 0,9% saline stérile d’une manière sous-cutanée s’il y a une perte de poids significative.
   2. Appliquer la pommade lubrifiante des yeux tous les jours jusqu’à ce que le réflexe de clignotement de l’animal soit rétabli.

Résultats

Après la procédure chirurgicale initiale, il existe deux principaux types de mesures de résultats: les mesures en série chez l’animal vivant et les mesures qui nécessitent le sacrifice de l’animal. Des exemples de mesures en série incluent des essais électrophysiologiques, tels qu’une mesure potentielle d’action musculaire composée³⁰, évaluations du mouvement du muscle facial par laser-assisté ou vidéographie signifie⁹, ou...

Discussion

Le modèle de lésion du nerf facial de rat a émergé comme le système le plus polyvalent pour l’évaluation des facteurs neurotrophiques en raison de son accessibilité chirurgicale, modèle de ramification, et la signification physiologique^{27,29,33,34,35,36}. La combinaison de la démonstration vidéo et de l’applicati...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8% isoflurane	VetOne	13985-030-40
11-0 nylon microsutures	AROSuture	TK-117038
4-0 monocryl suture	VWR	75982-084
Buprenorphine SR	ZooPharm	MIF 900-006
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
Chlorhexidine	VWR	IC19135805
Jeweler forceps	VWR	21909-458
Micro Weitlaner retractor	VWR	82030-146
Micro-scissors	VWR	100492-348
Mini tenotomy scissors	VWR	89023-522
Number 15 scalpel blade	VWR	102097-834
Operating microscope	Leica
Petrolatum eye gel	Pharmaderm	B002LUWBEK
Sterile water	VWR	89125-834
Tissue adhesive	Vetbond, 3M	NC9259532
Water conductor pad	Aqua Relief System	ARS2000B
Bupivacaine			Use as a local analgesic