Chirurgia del nervo facciale nel modello di ratto per studiare l'inibizione assonale e la rigenerazione

Riepilogo

Questo protocollo descrive un approccio riproducibile alla chirurgia del nervo facciale nel modello del ratto, comprese le descrizioni di vari modelli inducibili di lesioni.

Abstract

Questo protocollo descrive metodi coerenti e riproducibili per studiare la rigenerazione assonale e l'inibizione in un modello di lesione del nervo facciale del ratto. Il nervo facciale può essere manipolato lungo tutta la sua lunghezza, dal suo segmento intracranico al suo corso extratemporale. Ci sono tre tipi principali di lesioni nervose utilizzati per lo studio sperimentale delle proprietà rigenerative: schiacciamento del nervo, transezione e divario nervoso. La gamma di possibili interventi è vasta, compresa la manipolazione chirurgica del nervo, la consegna di reagenti neuroattivi o cellule, e manipolazioni centrali o dell'organo finale. I vantaggi di questo modello per lo studio della rigenerazione dei nervi includono semplicità, riproducibilità, coerenza interspecie, tassi di sopravvivenza affidabili del ratto e un aumento delle dimensioni anatomiche rispetto ai modelli murini. I suoi limiti riguardano una manipolazione genetica più limitata rispetto al modello murino e la capacità rigenerativa superlativa del ratto, in modo che lo scienziato del nervo facciale debba valutare attentamente i punti di tempo per il recupero e se tradurre i risultati in animali e studi umani superiori. Il modello di ratto per la lesione del nervo facciale consente parametri funzionali, elettrofisiologici e itomorfometrici per l'interpretazione e il confronto della rigenerazione del nervo. Vanta quindi un enorme potenziale per promuovere la comprensione e il trattamento delle conseguenze devastanti delle lesioni nervose facciali nei pazienti umani.

Introduzione

Lesione del nervo cranico nella regione della testa e del collo possono essere secondarie a eziologia congenita, infettiva, idiopatica, iatrogena, traumatica, neurologica, oncologica o sistemica¹. Nervo cranico VII, o il nervo facciale, è comunemente influenzato. L'incidenza della disfunzione del nervo facciale può essere significativa, in quanto colpisce 20 a 30 per 100.000 persone ogni anno². I principali rami motori del nervo facciale sono i rami temporali, zigomatici, buccali, marginali e cervicali; a seconda del ramo coinvolto, le conseguenze possono includere incompetenza orale o sbavamento, secchezza corneale, ostruzione del campo visivo secondario alla ptosi, disartria, o asimmetria facciale^2,3. La morbilità a lungo termine comprende il fenomeno della sicinesi, o movimento involontario di un gruppo muscolare facciale, con tentata contrazione volontaria di un gruppo muscolare facciale distinto. La sicinesi oculare-orale è la più comune della rigenerazione aberrante come sequela di lesioni facciali e provoca compromissione funzionale, imbarazzo, diminuzione dell'autostima e scarsa qualità della vita³. La lesione ai singoli rami determina le funzioni che vengono compromesse in modo selettivo.

Il trattamento clinico della lesione del nervo facciale non è ben standardizzato e ha bisogno di ulteriori ricerche per migliorare i risultati. Gli steroidi possono alleviare il gonfiore nervoso facciale acuto, mentre Botox è utile per temporizzare i movimenti sinanici; ma, le principali opzioni ricostruttive nell'armamentario del terapeuta comportano l'intervento chirurgico attraverso la riparazione del nervo, la sostituzione o la rianimazione^3,4,5^,6.⁶ A seconda del tipo di lesione del nervo facciale sostenuta, il chirurgo nervoso facciale può utilizzare una serie di opzioni. Per la transezione semplice, la reanastomosi nervosa è utile mentre la riparazione dell'innesto via cavo è più adatta per un difetto del nervo; per un ripristino della funzione, il chirurgo può scegliere procedure di rianimazione facciale statiche o dinamiche. In molti casi di lesioni nervose facciali e successiva riparazione, anche nelle mani di esperti chirurghi nervosi facciali, il miglior risultato si traduce ancora in asimmetria facciale persistente e compromesso funzionale⁷.

Questi risultati non ottimali hanno stimolato un'ampia ricerca sulla rigenerazione dei nervi facciali. Ampi argomenti di interesse includono il perfezionamento e l'innovazione delle tecniche di riparazione dei nervi, la determinazione dell'effetto di vari fattori di rigenerazione dei nervi e la valutazione del potenziale di specifici inibitori neurali per aiutare a combattere l'esito a lungo termine della sinocinesi^8,9,10,11. Mentre i modelli in vitro possono essere utilizzati per valutare alcune caratteristiche dei fattori pro-crescita o inibitori, la vera ricerca traslazionale su questo argomento è meglio realizzata tramite modelli animali traducibili.

La decisione di quale modello animale utilizzare può essere difficile, in quanto i ricercatori hanno utilizzato sia animali di grandi dimensioni, come pecore e piccoli modelli animali, come^{topi 12,13}. Mentre i modelli animali di grandi dimensioni offrono una visualizzazione anatomica ideale, il loro uso richiede attrezzature e personale specializzati non facilmente o facilmente disponibili. Inoltre, potenziare uno studio per dimostrare l'effetto potrebbe essere altamente proibitivo e potenzialmente non nell'ambito fattibile di molti centri scientifici. Così, il modello animale di piccole dimensioni è più frequentemente utilizzato. Il modello di topo può essere utilizzato per valutare una serie di risultati relativi alla chirurgia del nervo facciale; tuttavia, la lunghezza limitata del nervo può limitare la capacità dello scienziato di modellare determinati modelli, come lesioni a grande spazio¹⁴.

Così, il prototipo di ratto murine è emerso come il modello di cavallo di battaglia attraverso il quale lo scienziato può eseguire procedure chirurgiche innovative o utilizzare fattori inibitori o pro-crescita e valutare l'effetto su una vasta gamma di parametri di risultato. L'anatomia del nervo facciale del ratto è prevedibile e facilmente avvicinata in modo riproducibile. La sua scala più grande, rispetto al modello del mouse, consente la modellazione di una vasta gamma di difetti chirurgici, che vanno da semplice transection a 5 mm lacune^15,16. Questo permette ulteriormente l'applicazione di interventi complessi nel sito difettoso, tra cui il posizionamento topico del fattore, iniezioni intraneurali di fattore, e il posizionamento di isoini o ponti^{17,18,19,20,21,22,23}.

La natura docile del ratto, la sua anatomia affidabile e la sua propensione per una rigenerazione efficace del nervo consentono la raccolta di molte misure esiti in risposta ai suddetti schemi chirurgici di lesioni²⁴. Attraverso il modello di ratto, lo scienziato nervoso facciale è in grado di valutare le risposte elettrofisiologiche a lesioni, esiti istologici nervosi e muscolari tramite immunostochimica, esiti funzionali attraverso il monitoraggio del movimento del pad vibrissale e la valutazione della chiusura degli occhi, e micro- cambiamenti macro-scopici attraverso microorescente o microscopia confocale, tra gli altri¹¹, 22^{,29,,23,23,25,26,28}.²⁸ Così, il seguente protocollo illustrerà un approccio chirurgico al nervo facciale del ratto e agli schemi di lesione che possono essere indotti.

Protocollo

Tutti gli interventi sono stati eseguiti in stretta conformità con le linee guida dei National Institutes of Health (NIH). Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC) dell'Università del Michigan prima dell'implementazione. Sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley di dieci settimane.

1. Prima del giorno operativo

1. Garantire uno stock adeguato di strumenti chirurgici sterilizzati, farmaci analgesici, farmaci anestetici e ossigeno prima della giornata operativa. Vedere La Tabella dei Materiali per un elenco completo.

2. Configurazione preoperatoria

1. Garantire uno spazio di lavoro adeguato, compreso lo spazio per almeno due individui (il chirurgo e un assistente).
   NOTA: è necessario un tavolo operatorio dedicato, spazio per la configurazione della macchina per anestesia e spazio di archiviazione adeguato per le forniture sterilizzate e di backup.
2. Calibrare un microscopio operativo per l'uso durante le procedure. Assicurarsi che il chirurgo abbia la capacità di regolare le maniglie del microscopio e i pulsanti zoom/focus posizionando una copertura sterilizzata sopra le maniglie /pulsanti
   NOTA: Abbiamo utilizzato un foglio di alluminio sterilizzato sopra le maniglie/pulsanti.

3. Anestesia e preparazione

1. Posizionare l'animale nella camera di anestesia e indurre l'anestesia generale attraverso l'1,8% di isoflurane e 0,9 l/min di ossigeno.
   1. Confermare un adeguato piano di anestesia attraverso una valutazione della respirazione spontanea e una valutazione della coscienza valutando la risposta di smorfia dell'animale a un pizzico.
2. Applicare il lubrificante per gli occhi bilateralmente per proteggersi dall'irritazione corneale o secchezza.
3. Rasare i siti operativi con un rasoio o un clipper automatico.
   1. Stabilire un metodo per l'identificazione del ratto in questo momento, sia tramite un'etichetta dell'orecchio o un'etichetta/marcatura della coda.
4. Somministrare un'iniezione sottocutanea di 0,05 mg/kg di buprenorphina lungo la schiena dell'animale per la profilassi contro il dolore postoperatorio.

4. Approccio chirurgico e modelli di lesioni

1. Trasferire l'animale al tavolo operatorio e continuare il flusso di gas tramite un naso cono. Assicurarsi che una piastra di riscaldamento sia posizionata sotto l'animale e il campo sterile per mantenere la temperatura corporea.
2. Mettere la garza sterilizzata (arrotolata e fissata con nastro adesivo) da utilizzare come rotolo di collo per il ratto; questo fornirà una maggiore esposizione del campo chirurgico. Si noti che il posizionamento appropriato dell'animale è fondamentale per un'efficiente identificazione del nervo e la dissezione.
3. Preparare la pelle del viso dell'animale per la procedura. Utilizzare clorèxidine o una soluzione a base di iodio per pulire il sito chirurgico 3x, alternandolo al 70% di etanolo, per garantire la disinfezione.
4. Pianificare e contrassegnare l'incisione chirurgica, se lo si desidera. Manipolare l'orecchio ipsilaterale in una direzione anteriore-posteriore per determinare il ripiegamento naturale della pelle postauricolare.
5. Modellare un'incisione di 4-5 mm nella piega postauricolare con forbici iris taglienti o una lama numero 15. Questo può essere espanso più avanti nella procedura in base alle esigenze.
6. Sezionata in modo schiacciante attraverso l'immediata fascia sottocutanea e posiziona un retrattore micro-Weitlaner per migliorare l'esposizione. Si noti che ci possono essere vasi sanguigni di piccolo calibro in questa zona; questi sono meglio evitati ritraendo in modo superiore o inferiore tramite il retrattore Weitlaner.
7. Identificare il muscolo digastrico anteriore mentre viaggia in una direzione inferiore a superiore verso il suo inserimento lungo la base del cranio.
   1. Diffondere delicatamente attraverso il ventre muscolare lungo il suo punto di inserimento per rivelare il tendine del ventre digastrico anteriore. Si noti che il tendine appare come un processo bianco filmy emanato dal muscolo con un inserimento solido sulla base del cranio.
8. Dopo l'identificazione del muscolo digastrico anteriore e del suo tendine, regolare il retrattore Weitlaner per ritrarre ulteriormente la pancia muscolare. Si noti che la regione successivamente esposta è lo spazio tridimensionale in cui si trova il tronco principale del nervo facciale.
   NOTA: Questa regione è delimitata in modo superiore e mediale dalla base del cranio, lateralmente dal muscolo digastrico anteriore, posteromediale dal canale uditivo e in modo inferiore dalle strutture del collo, compresa l'arteria temporale superficiale.
9. Dopo un'adeguata esposizione, identificare il tronco principale del nervo facciale mentre viaggia in modo inferiore da sotto il tendine del muscolo digastrico, dove esce dal forame stilomastoide dalla base del cranio. Si noti che il nervo appare come una corda bianca perla, racchiusa nella fascia marina parotide dell'animale. Prestare attenzione quando espone ulteriormente il nervo, per i seguenti motivi.
   1. Evitare la dissezione aggressiva, o si diffonde perpendicolarmente, per proteggersi da lesioni neuroprassia mediata allungata.
   2. Evitare la dissezione aggressiva posteriormente e medialmente diretta per evitare di violare i tessuti sottili che sovrasserverono il condotto uditivo in quanto ciò potrebbe introdurre la flora dell'orecchio medio nel campo chirurgico.
   3. Evitare di danneggiare l'arteria temporale superficiale attraverso un'ampia dissezione mediale e inferiore. Si noti che una lesione sarà identificata da sangue vivace e pulsatile.
      1. Se l'arteria è ferita, applicare una pressione rapida con un applicatore con punta di cotone o una garza sterile tramite pinze. Gli agenti emostatici o sigillanti di fibrina liquida possono essere collocati in prossimità. Tenete a mente che l'animale può richiedere un'iniezione sottocutanea di 0.9% sterile salina per la stabilizzazione dei fluidi.
10. Tracciare il tronco principale distay dissipando lungo il nervo in una direzione inferiore, distay dall'uscita del forame stylomastoid.
    1. Estendere l'incisione originale per consentire una piena esposizione del nervo e dei suoi rami. Fare attenzione a evitare una rottura della ghiandola parotide come questo potrebbe provocare sialocele postoperatorio.
11. Indurre i modelli di lesioni desiderati come segue.
    1. Per una ferita da schiacciamento, utilizzare le pinze del gioielliere dalla superficie liscia per afferrare saldamente il nervo e comprimerlo⁹. Applicare una pressione costante e riproducibile sul nervo per un periodo di 30 s per garantire un'adeguata lesione da schiacciamento.
    2. Per una semplice transezione, afferrare la fascia sovrastante il nervo, o l'epineurium immediato, con pinze dai denti fini, e utilizzare microscissors taglienti per transetto pulito il nervo nel punto desiderato con un solo taglio. Fare attenzione a evitare l'eccesso di trazione sul nervo con le pinze.
    3. Per un modello di gap nervoso, creare il divario nervoso desiderato utilizzando un metodo simile alla semplice lesione di transezione. Utilizzare l'albero sterilizzato di un applicatore con punta di cotone tagliato al gap nervoso desiderato lunghezza-intraoperatorio per garantire la somiglianza del modello di lesione tra gli animali.

5. Chiusura delle ferite

1. Irrigare la ferita con sterile salina e asciugarla con garza sterile.
2. Approssimare i bordi della pelle in modo semplice e subcuticolare con suture assorbibili, o utilizzare colla della pelle o clip della ferita, che sono accettabili anche per la chiusura della ferita. Posizionare un punto sepolto prendendo un morso profondo-superficiale di un bordo della pelle e poi un successivo morso superficiale-profondo del bordo opposto della pelle.

6. Recupero postoperatorio

1. Somministrare un'iniezione sottocutanea di analgesico antinfiammatorio non steroideo (ad esempio 0,05 mg/kg di buprenorfina e 0,5 mg /kg di Carprofen) per il controllo del dolore postoperatorio. Posizionare l'iniezione lungo la schiena dell'animale.
2. Cessare la somministrazione dell'agente anestetico e consentire all'animale di inalare ossigeno per un ulteriore 1 min.
3. Mettere l'animale in una scaldatto (tramite una lampada termica), gabbia asettica priva di materiale da letto per evitare l'ingestione accidentale. Si noti che l'animale in genere dimostra segni di recupero entro 1-2 min e può apparire disorientato, con un recupero ritardato della funzione della gamba posteriore.
4. Riportare gli animali nelle loro gabbie nell'unità abitativa appropriata e somministrare analgesici postoperatori nei giorni #1 per garantire una continua profilassi contro il dolore.
5. Monitorare gli animali 2 volte al giorno per valutare i segni di malnutrizione, irritazione corneale o infezione del sito chirurgico, e mantenere i registri chirurgici appropriati.
   1. Amministrare 0.9% sterile salina in modo sottocutaneo se c'è una significativa perdita di peso.
   2. Applicare l'unguento oculare lubrificante ogni giorno fino a quando il riflesso del battito di ciglia dell'animale è ristabilito.

Risultati

Dopo la procedura chirurgica iniziale, ci sono due tipi principali di misure di esito: misurazioni seriali nell'animale vivo e misurazioni che richiedono il sacrificio dell'animale. Esempi di misurazioni seriali includono saggi elettrofisiologici, come una misura potenziale di azione muscolare composta³⁰, valutazioni del movimento del muscolo facciale tramite laser-assistito o videografia significa⁹, o anche ripetitivo imaging dal vivo di ri...

Discussione

Il modello di lesione del nervo facciale del ratto è emerso come il sistema più versatile per la valutazione di fattori neurotrofici grazie alla sua accessibilità chirurgica, al modello di ramificazione e al significato fisiologico^{27,29,33,34,35,36}. La combinazione di dimostrazione video e applicazione di dati sugli animal...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8% isoflurane	VetOne	13985-030-40
11-0 nylon microsutures	AROSuture	TK-117038
4-0 monocryl suture	VWR	75982-084
Buprenorphine SR	ZooPharm	MIF 900-006
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
Chlorhexidine	VWR	IC19135805
Jeweler forceps	VWR	21909-458
Micro Weitlaner retractor	VWR	82030-146
Micro-scissors	VWR	100492-348
Mini tenotomy scissors	VWR	89023-522
Number 15 scalpel blade	VWR	102097-834
Operating microscope	Leica
Petrolatum eye gel	Pharmaderm	B002LUWBEK
Sterile water	VWR	89125-834
Tissue adhesive	Vetbond, 3M	NC9259532
Water conductor pad	Aqua Relief System	ARS2000B
Bupivacaine			Use as a local analgesic