Cirurgia do nervo facial no modelo de rato para estudar inibição e regeneração axonal

Resumo

Este protocolo descreve uma abordagem reprodutível para a cirurgia do nervo facial no modelo de rato, incluindo descrições de vários padrões induziveis de lesão.

Resumo

Este protocolo descreve métodos consistentes e reprodutíveis para estudar a regeneração e inibição axonal em um modelo de lesão do nervo facial de rato. O nervo facial pode ser manipulado ao longo de toda a sua extensão, desde seu segmento intracraniano até seu curso extratemporal. Existem três tipos primários de lesão nervosa utilizados para o estudo experimental de propriedades regenerativas: esmagamento nervoso, transsecção e abertura nervosa. A gama de possíveis intervenções é vasta, incluindo manipulação cirúrgica do nervo, parto de reagentes neuroativos ou células, e manipulações centrais ou de órgãos finais. As vantagens deste modelo para estudar a regeneração nervosa incluem simplicidade, reprodutibilidade, consistência entre espécies, taxas de sobrevivência confiáveis do rato e um tamanho anatômico aumentado em relação aos modelos murina. Suas limitações envolvem uma manipulação genética mais limitada versus o modelo do rato e a capacidade regenerativa superlativa do rato, de modo que o cientista do nervo facial deve avaliar cuidadosamente os pontos de tempo para recuperação e se traduzir resultados para animais superiores e estudos humanos. O modelo de rato para lesão do nervo facial permite parâmetros funcionais, eletrofisiológicos e histomorfométricos para a interpretação e comparação da regeneração nervosa. Assim, possui um enorme potencial para promover a compreensão e o tratamento das consequências devastadoras da lesão do nervo facial em pacientes humanos.

Introdução

A lesão do nervo craniano na região da cabeça e do pescoço pode ser secundária às etiologias congênitas, infecciosas, idiopáticas, iatrogênicas, traumáticas, neurológicas, oncológicas ou sistêmicas¹. O nervo craniano VII, ou nervo facial, é comumente afetado. A incidência de disfunção do nervo facial pode ser significativa, pois afeta de 20 a 30 por 100.000 pessoas a cada ano². Os principais ramos motores do nervo facial são os ramos temporal, zigomático, bucal, mandibular marginal e cervical; dependendo do ramo envolvido, as consequências podem incluir incompetência oral ou baba, secura da córnea, obstrução do campo visual secundária à ptose, disartria ou assimetria facial^2,3. A morbidade a longo prazo inclui o fenômeno da sincinese, ou movimento involuntário de um grupo muscular facial, com tentativa de contração voluntária de um grupo muscular facial distinto. A sincinese ocular-oral é a mais comum da regeneração aberrante como sequela da lesão do nervo facial e causa comprometimento funcional, constrangimento, diminuição da autoestima e má qualidade de vida³. A lesão aos ramos individuais dita as funções que estão seletivamente comprometidas.

O tratamento clínico da lesão do nervo facial não é bem padronizado e está precisando de mais pesquisas para melhorar os resultados. Esteróides podem aliviar o inchaço agudo do nervo facial, enquanto o Botox é útil para os movimentos sincinéticos temporizados; mas, as principais opções reconstrutivas no armamentário do praticante envolvem intervenção cirúrgica através de reparação nervosa, substituição ou reanimação^3,4,5,6. Dependendo do tipo de lesão do nervo facial sustentada, o cirurgião do nervo facial pode utilizar uma série de opções. Para uma transsecção simples, a reanastomose nervosa é útil, enquanto o reparo do cabo-enxerto é mais adequado para um defeito nervoso; para uma restauração da função, o cirurgião pode escolher procedimentos de reanimação facial estática ou dinâmica. Em muitos casos de lesão do nervo facial e posterior reparação, mesmo nas mãos de cirurgiões nervosos faciais experientes, o melhor resultado ainda resulta em assimetria facial persistente e comprometimento funcional⁷.

Esses resultados subótimos estimularam extensas pesquisas sobre a regeneração do nervo facial. Amplos tópicos de interesse incluem aperfeiçoar e inovar técnicas de reparação nervosa, determinar o efeito de vários fatores de regeneração nervosa e avaliar o potencial de inibidores neurais específicos para ajudar a combater o resultado a longo prazo da sincinese^8,9,10,11. Embora os modelos in vitro possam ser usados para avaliar algumas características de fatores pró-crescimento ou inibidores, a verdadeira pesquisa translacional sobre este assunto é melhor realizada através de modelos animais traduzíveis.

A decisão de qual modelo animal utilizar pode ser desafiadora, pois os pesquisadores utilizaram tanto animais de grande porte, como ovinos e modelos de pequenos animais, como camundongos^12,13. Embora modelos de animais de grande porte ofereçam visualização anatômica ideal, seu uso requer equipamentos especializados e pessoal não disponível facilmente ou facilmente. Além disso, impulsionar um estudo para demonstrar efeito pode ser altamente proibitivo de custos e potencialmente não dentro do escopo viável de muitos centros científicos. Assim, o modelo animal pequeno é mais utilizado. O modelo do camundongo pode ser utilizado para avaliar uma série de desfechos relacionados à cirurgia do nervo facial; no entanto, o comprimento limitado do nervo pode restringir a capacidade do cientista de modelar certos padrões, como lesões de grande lacuna¹⁴.

Assim, o protótipo de murina de rato emergiu como o modelo workhorse através do qual o cientista pode realizar procedimentos cirúrgicos inovadores ou utilizar fatores inibidores ou pró-crescimento e avaliar o efeito em uma ampla gama de parâmetros de desfecho. A anatomia do nervo facial do rato é previsível e facilmente abordada de forma reprodutível. Sua escala maior, em comparação com o modelo do mouse, permite a modelagem de uma ampla gama de defeitos cirúrgicos, variando de transsecção simples a lacunas de 5 mm^15,16. Isso permite ainda a aplicação de intervenções complexas no local do defeito, incluindo a colocação tópica do fator, injeções intraneurais do fator e a colocação de isoenxertos ou pontes^{17,18,19,20,21,22,23}.

A natureza dócil do rato, sua anatomia confiável e sua propensão à regeneração nervosa eficaz permitem a coleta de muitas medidas de desfecho em resposta aos padrões cirúrgicos acima mencionados da lesão²⁴. Através do modelo de rato, o cientista do nervo facial é capaz de avaliar respostas eletrofisiológicas a lesões, desfechos histológicos nervosos e musculares através da imunohistoquímica, desfechos funcionais através do movimento de rastreamento da almofada vibrissal e avaliação do fechamento dos olhos, e alterações micro e macroscópicas por meio de microscopia fluorescente ou confocal, entre outras^{11,22,23,25,26,27,28,29}. Assim, o protocolo a seguir irá delinear uma abordagem cirúrgica para o nervo facial do rato e os padrões de lesão que podem ser induzidos.

Protocolo

Todas as intervenções foram realizadas de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucionais (IACUC) da Universidade de Michigan antes da implementação. Foram utilizados ratos sprague-dawley adultos de dez semanas de idade.

1. Antes do dia da operação

1. Garanta um estoque adequado de instrumentos cirúrgicos esterilizados, medicamentos analgésicos, medicamentos anestésicos e oxigênio antes do dia de operação. Consulte Tabela de Materiais para obter uma lista completa.

2. Configuração pré-operatória

1. Garantir um espaço de trabalho adequado, incluindo espaço para pelo menos dois indivíduos (o cirurgião e um assistente).
   NOTA: Há necessidade de uma mesa de operação dedicada, espaço para a configuração da máquina de anestesia e espaço de armazenamento adequado para suprimentos esterilizados e de backup.
2. Calibrar um microscópio operacional para uso durante os procedimentos. Certifique-se de que o cirurgião tem a capacidade de ajustar as alças do microscópio e os botões de zoom/foco colocando uma tampa esterilizada sobre as alças/botões
   NOTA: Utilizamos papel alumínio esterilizado sobre as alças/botões.

3. Anestesia e preparação

1. Coloque o animal na câmara de anestesia e induza anestesia geral através de 1,8% de isoflurano e 0,9 L/min de oxigênio.
   1. Confirme um plano adequado de anestesia através de uma avaliação da respiração espontânea e uma avaliação da consciência, avaliando a resposta da careta do animal a uma pitada do dedo do dedo.
2. Aplique lubrificante ocular bilateralmente para se proteger contra irritação ou ressecação da córnea.
3. Raspe o local operacional com uma navalha ou cortador automático.
   1. Estabeleça um método para identificação de ratos neste momento, seja através de uma etiqueta de ouvido ou etiqueta/marcação de cauda.
4. Administrar uma injeção subcutânea de 0,05 mg/kg de buprenorfina ao longo das costas do animal para profilaxia contra dor pós-operatória.

4. Abordagem cirúrgica e padrões de lesões

1. Transfira o animal para a mesa de operação e continue o fluxo de gás através de um nariz. Certifique-se de que uma almofada de aquecimento esteja posicionada sob o animal e o campo estéril para manter a temperatura corporal.
2. Coloque a gaze esterilizada (enrolada e presa com fita) para usar como rolo de pescoço para o rato; isso proporcionará uma exposição aprimorada do campo cirúrgico. Observe que o posicionamento adequado do animal é primordial para a identificação e dissecção eficiente dos nervos.
3. Prepare a pele facial do animal para o procedimento. Use cloroxidina ou uma solução à base de iodo para esfregar o local cirúrgico 3x, alternando com 70% de etanol, para garantir a desinfecção.
4. Planeje e marque a incisão cirúrgica se desejar. Manipule o ouvido ipsilateral em uma direção anterior-posterior para determinar a dobra natural da pele pós-auricular.
5. Forme uma incisão de 4-5 mm no vinco pós-auricular usando uma tesoura de íris afiada ou uma lâmina número 15. Isso pode ser expandido posteriormente no procedimento, conforme necessário.
6. Dissecar sem rodeios através da fáscia subcutânea imediata e colocar um retrátil micro-Weitlaner para aumentar a exposição. Note que pode haver vasos sanguíneos de pequeno calibre nesta área; estes são melhor evitados retraindo-se superior ou inferiormente através do retrátil Weitlaner.
7. Identifique o músculo dizstrico anterior enquanto ele viaja em uma direção inferior-superior em direção à sua inserção ao longo da base do crânio.
   1. Espalhe suavemente através da barriga muscular ao longo de seu ponto de inserção para revelar o tendão da barriga anterior. Note que o tendão aparece como um processo branco filmado emanando do músculo com uma inserção sólida na base do crânio.
8. Após a identificação do músculo póstrico anterior e seu tendão, ajuste o retrátil Weitlaner para retrair ainda mais a barriga muscular. Note-se que a região posteriormente exposta é o espaço tridimensional onde está o tronco principal do nervo facial.
   NOTA: Esta região é limitada superior mente e medialmente pela base do crânio, lateralmente pelo músculo dizstrico anterior, posteromedialmente pelo canal auditivo, e inferiormente pelas estruturas do pescoço, incluindo a artéria temporal superficial.
9. Após a exposição adequada, identifique o tronco principal do nervo facial à medida que viaja inferiormente por baixo do tendão do músculo digastric, onde ele sai do forame estilomastóide da base do crânio. Note que o nervo aparece como um cordão branco perolado, envolto na fáscia parótida-massetérica do animal. Pratique cautela ao expor ainda mais o nervo, pelas seguintes razões.
   1. Evite dissecção agressiva, ou spreads perpendiculares, para se proteger contra lesões neuropraxia mediadas por estiramento.
   2. Evite dissecção agressiva posterior e medialmente direcionada para se proteger contra violar os tecidos finos sobrepostos ao canal auditivo, pois isso poderia introduzir a flora do ouvido médio no campo cirúrgico.
   3. Evite danificar a artéria temporal superficial através de uma dissecção ampla mediana e inferiormente dirigida. Note que uma lesão será identificada por sangramento pulsante.
      1. Se a artéria estiver ferida, aplique pressão imediata com um aplicador de ponta de algodão ou gaze estéril através de fórceps. Agentes hemostáticos ou selante de fibrina líquida podem ser colocados nas proximidades. Tenha em mente que o animal pode exigir uma injeção subcutânea de 0,9% de solução salina estéril para estabilização de fluidos.
10. Rastreie o tronco principal distalmente dissecando ao longo do nervo em uma direção inferior, distalmente a partir da saída do forame estilmastóide.
    1. Estender a incisão original para permitir uma exposição completa do nervo e seus ramos. Tome cuidado para evitar uma ruptura da glândula parótida, pois isso pode resultar em sialocele pós-operatória.
11. Induzir os padrões de lesão desejados da seguinte forma.
    1. Para uma lesão de esmagamento, use fórceps de joalheria de superfície lisa para agarrar firmemente o nervo e comprimi-lo⁹. Aplique pressão constante e reprodutível no nervo por um período de 30 s para garantir uma lesão de esmagamento adequada.
    2. Para uma simples transsecção, segure a fáscia sobreposta ao nervo, ou o epineúrio imediato, com fórceps de dentes finos, e use microtesouras afiadas para transcicar o nervo de forma limpa no ponto desejado com um único corte. Tome cuidado para evitar o excesso de tração no nervo com os fórceps.
    3. Para um modelo de lacuna nervosa, crie a lacuna nervosa desejada usando um método semelhante à lesão de transsecção simples. Use o eixo esterilizado de um aplicador com ponta de algodão para o comprimento do espaço nervoso desejado intraoperatório para garantir a similaridade do padrão de lesão entre os animais.

5. Fechamento da ferida

1. Irrigar a ferida com soro retumae e secá-la com gaze estéril.
2. Aproxime as bordas da pele de forma simples e subcuticular com suturas absorvíveis, ou use cola de pele ou clipes de ferida, que também são aceitáveis para o fechamento da ferida. Coloque um ponto enterrado tomando uma mordida profunda para superficial de uma borda da pele e, em seguida, uma subsequente mordida superficial-profunda da borda da pele oposta.

6. Recuperação pós-operatória

1. Administrar uma injeção subcutânea de analgésico anti-inflamatório não esteróide (como 0,05 mg/kg de buprenorfina e 0,5 mg /kg de Carprofinen) para o controle da dor pós-operatória. Coloque a injeção nas costas do animal.
2. Cesse a administração do agente anestésico e permita que o animal inale oxigênio por mais 1 min.
3. Coloque o animal em um aquecedor (através de uma lâmpada de calor), gaiola asséptica desprovida de material de cama para evitar a ingestão acidental. Observe que o animal normalmente demonstrará sinais de recuperação dentro de 1-2 min e pode parecer desorientado, com uma recuperação retardada da função da perna traseira.
4. Devolva os animais para suas gaiolas na unidade habitacional adequada e administre analgésicos pós-operatórios no dia pós-operatório #1 para garantir a profilaxia contínua contra a dor.
5. Monitore os animais 2x por dia para avaliar se há sinais de desnutrição, irritação corneana ou infecção no local cirúrgico, e mantenha registros cirúrgicos apropriados.
   1. Administre 0,9% de soro fisiológico estéril de forma subcutânea se houver perda significativa de peso.
   2. Aplique a pomada lubrificante ocular diariamente até que o reflexo de piscar do animal seja restabelecido.

Resultados

Após o procedimento cirúrgico inicial, existem dois tipos principais de medidas de desfecho: medidas seriais no animal vivo e medidas que requerem sacrifício do animal. Exemplos de medidas seriais incluem ensaios eletrofisiológicos, como uma medição potencial de ação muscular composta³⁰, avaliações do movimento muscular facial através de laser assistido ou videografia significa⁹, ou mesmo imagens ao vivo repetitivas de recrescimen...

Discussão

O modelo de lesão do nervo facial de rato emergiu como o sistema mais versátil para a avaliação de fatores neurotróficos devido à sua acessibilidade cirúrgica, padrão de ramificação e significância fisiológica^{27,29,33,34,35,36}. A combinação de demonstração de vídeo e aplicação de dados de animais transgêni...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8% isoflurane	VetOne	13985-030-40
11-0 nylon microsutures	AROSuture	TK-117038
4-0 monocryl suture	VWR	75982-084
Buprenorphine SR	ZooPharm	MIF 900-006
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
Chlorhexidine	VWR	IC19135805
Jeweler forceps	VWR	21909-458
Micro Weitlaner retractor	VWR	82030-146
Micro-scissors	VWR	100492-348
Mini tenotomy scissors	VWR	89023-522
Number 15 scalpel blade	VWR	102097-834
Operating microscope	Leica
Petrolatum eye gel	Pharmaderm	B002LUWBEK
Sterile water	VWR	89125-834
Tissue adhesive	Vetbond, 3M	NC9259532
Water conductor pad	Aqua Relief System	ARS2000B
Bupivacaine			Use as a local analgesic