Cirugía de nervios faciales en el modelo de rata para estudiar la inhibición y regeneración axonal

Resumen

Este protocolo describe un enfoque reproducible para la cirugía del nervio facial en el modelo de rata, incluyendo descripciones de varios patrones inducibles de lesión.

Resumen

Este protocolo describe métodos consistentes y reproducibles para estudiar la regeneración e inhibición axonal en un modelo de lesión del nervio facial de rata. El nervio facial puede ser manipulado a lo largo de toda su longitud, desde su segmento intracraneal hasta su curso extratemporal. Hay tres tipos principales de lesión nerviosa utilizados para el estudio experimental de propiedades regenerativas: aplastamiento nervioso, transección y brecha nerviosa. La gama de posibles intervenciones es vasta, incluyendo la manipulación quirúrgica del nervio, la administración de reactivos o células neuroactivas, y ya sea manipulaciones centrales o de órganos finales. Las ventajas de este modelo para estudiar la regeneración nerviosa incluyen simplicidad, reproducibilidad, consistencia entre especies, tasas de supervivencia confiables de la rata y un mayor tamaño anatómico en relación con los modelos murinos. Sus limitaciones implican una manipulación genética más limitada frente al modelo de ratón y la capacidad regenerativa superlativa de la rata, de modo que el científico del nervio facial debe evaluar cuidadosamente los puntos de tiempo para la recuperación y si traducir los resultados a animales superiores y estudios en humanos. El modelo de rata para la lesión del nervio facial permite parámetros funcionales, electrofisiológicos e histomorfométricos para la interpretación y comparación de la regeneración nerviosa. Por lo que cuenta con un enorme potencial para promover la comprensión y el tratamiento de las consecuencias devastadoras de la lesión del nervio facial en pacientes humanos.

Introducción

La lesión del nervio craneal en la región de la cabeza y el cuello puede ser secundaria a las etiologías congénitas, infecciosas, idiopáticas, iatrogénicas, traumáticas, neurológicas, oncológicas o sistémicas¹. El nervio craneal VII, o el nervio facial, se ve comúnmente afectado. La incidencia de disfunción del nervio facial puede ser significativa, ya que afecta a 20 a 30 por cada 100.000 personas cada año^2. Las principales ramas motoras del nervio facial son las ramas temporal, cigomática, bucal, mandibular marginal y cervical; dependiendo de la rama involucrada, las consecuencias pueden incluir incompetencia oral o babeo, sequedad corneal, obstrucción del campo visual secundaria a la ptosis, disartria o asimetría facial^2,3. La morbilidad a largo plazo incluye el fenómeno de la sinesquina, o movimiento involuntario de un grupo muscular facial, con intento de contracción voluntaria de un grupo muscular facial distinto. La sinesquina ocular-oral es la más común de la regeneración aberrante como secuencia de lesión del nervio facial y causa deterioro funcional, verguenza, disminución de la autoestima y mala calidad de vida³. Las lesiones a ramas individuales dictan las funciones que se ven comprometidas selectivamente.

El tratamiento clínico de la lesión del nervio facial no está bien estandarizado y necesita más investigación para mejorar los resultados. Los esteroides pueden aliviar la hinchazón aguda del nervio facial, mientras que el Botox es útil para temporizar los movimientos sincinéticos; pero, las principales opciones reconstructivas en el arsenal del practicante implican intervención quirúrgica a través de la reparación de los nervios, la sustitución, o la reanimación^3,4,5,6. Dependiendo del tipo de lesión del nervio facial sufrida, el cirujano del nervio facial puede utilizar una serie de opciones. Para la transección simple, la reanastomosis nerviosa es útil, mientras que la reparación del injerto de cable es más adecuada para un defecto nervioso; para una restauración de la función, el cirujano puede elegir procedimientos de reanimación facial estáticos o dinámicos. En muchos casos de lesión del nervio facial y reparación posterior, incluso en las manos de cirujanos de nervio facial experimentados, el mejor resultado todavía resulta en asimetría facial persistente y compromiso funcional⁷.

Estos resultados subóptimos han estimulado una extensa investigación sobre la regeneración del nervio facial. Los temas de interés amplios incluyen perfeccionar e innovar técnicas de reparación nerviosa, determinar el efecto de varios factores de regeneración nerviosa, y evaluar el potencial de inhibidores neuronales específicos para ayudar a combatir el resultado a largo plazo de la sinisquinesis^8,,9,10,11. Mientras que los modelos in vitro se pueden utilizar para evaluar algunas características de los factores pro-crecimiento o inhibitorios, la verdadera investigación traslacional sobre esta materia se logra mejor a través de modelos animales traducibles.

La decisión de qué modelo animal utilizar puede ser difícil, ya que los investigadores han utilizado animales grandes, como modelos de ovejas y animales pequeños, como ratones^12,,13. Mientras que los modelos animales grandes ofrecen una visualización anatómica ideal, su uso requiere equipos y personal especializados que no estén disponibles fácilmente o fácilmente. Además, impulsar un estudio para demostrar el efecto podría ser altamente prohibitivo en cuanto a los costos y potencialmente no dentro del alcance factible de muchos centros científicos. Por lo tanto, el modelo animal pequeño se utiliza con mayor frecuencia. El modelo de ratón se puede utilizar para evaluar una serie de resultados relacionados con la cirugía del nervio facial; sin embargo, la longitud limitada del nervio puede restringir la capacidad del científico para modelar ciertos patrones, como la lesión de gran brecha¹⁴.

Por lo tanto, el prototipo de murina de rata ha surgido como el modelo de caballo de batalla a través del cual el científico puede realizar procedimientos quirúrgicos innovadores o utilizar factores inhibitorios o pro-crecimiento y evaluar el efecto a través de una amplia gama de parámetros de resultados. La anatomía del nervio facial de la rata se aborda predecible y fácilmente de una manera reproducible. Su mayor escala, en comparación con el modelo de ratón, permite modelar una amplia gama de defectos quirúrgicos, que van desde la simple transección hasta los huecos de 5 mm^15,,16. Esto permite además la aplicación de intervenciones complejas en el lugar del defecto, incluyendo la colocación tópica del factor, las inyecciones intraneurales de factor, y la colocación de isoinjertos o puentes^{17,,18,,19,,20,,21,,22,,23}.

La naturaleza dócil de la rata, su anatomía fiable, y su propensión a la regeneración nerviosa eficaz permite la recopilación de muchas medidas de resultado en respuesta a los patrones quirúrgicos de lesión²⁴antes mencionados. A través del modelo de rata, el científico del nervio facial es capaz de evaluar las respuestas electrofisiológicas a lesiones, resultados histológicos de los nervios y los músculos a través de la inmunohistoquímica, resultados funcionales a través del seguimiento del movimiento de la almohadilla vibrisal y la evaluación del cierre de los ojos, y los cambios micro y macroscópicos a través de microscopía fluorescente o confocal, entre otros^{11,,22,,23,,25,,26,27,28.29} Por lo tanto, el siguiente protocolo esbozará un enfoque quirúrgico para el nervio facial de la rata y los patrones de lesión que se pueden inducir.

Protocolo

Todas las intervenciones se realizaron de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El protocolo experimental fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Michigan antes de su implementación. Se utilizaron ratas hembras Sprague-Dawley adultas de diez semanas de edad.

1. Antes del día operativo

1. Asegurar un stock adecuado de instrumentos quirúrgicos esterilizados, medicamentos analgésicos, medicamentos anestésicos y oxígeno antes del día de funcionamiento. Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista completa.

2. Configuración preoperatoria

1. Asegurar un espacio de trabajo adecuado, incluyendo espacio para al menos dos individuos (el cirujano y un asistente).
   NOTA: Es necesario una mesa de operación dedicada, espacio para la configuración de la máquina de anestesia y un espacio de almacenamiento adecuado para los suministros esterilizados y de respaldo.
2. Calibrar un microscopio de funcionamiento para su uso durante los procedimientos. Asegúrese de que el cirujano tenga la capacidad de ajustar las manijas del microscopio y los botones de zoom/enfoque colocando una cubierta esterilizada sobre las manijas/botones
   NOTA: Utilizamos papel de aluminio esterilizado sobre las manijas/ botones.

3. Anestesia y preparación

1. Colocar al animal en la cámara de anestesia e inducir anestesia general a través de 1,8% de isoflurano y 0,9 L/min de oxígeno.
   1. Confirmar un plano adecuado de anestesia a través de una evaluación de la respiración espontánea y una evaluación de la conciencia mediante la evaluación de la respuesta de mueca del animal a un pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del sol.
2. Aplicar lubricante para los ojos bilateralmente para protegerse contra la irritación o sequedad de la córnea.
3. Afeite los lugares operativos con una maquinilla de afeitar o un cortador automático.
   1. Establezca un método para la identificación de ratas en este momento, ya sea a través de una etiqueta de oreja o etiqueta/marcado de cola.
4. Administrar una inyección subcutánea de 0,05 mg/kg de buprenorfina a lo largo de la espalda del animal para la profilaxis contra el dolor postoperatorio.

4. Enfoque quirúrgico y patrones de lesiones

1. Transfiera el animal a la mesa de operaciones y continúe el flujo de gas a través de un nosecone. Asegúrese de que una almohadilla de calentamiento esté colocada debajo del animal y del campo estéril para mantener su temperatura corporal.
2. Colocar la gasa esterilizada (enrollada y sujetada con cinta adhesiva) para usarla como rollo de cuello para la rata; esto proporcionará una mayor exposición del campo quirúrgico. Tenga en cuenta que el posicionamiento adecuado del animal es primordial para la identificación y disección eficiente de los nervios.
3. Prepare la piel facial del animal para el procedimiento. Utilice clorhexidina o una solución a base de yodo para fregar el sitio quirúrgico 3veces, alternando con 70% de etanol, para asegurar la desinfección.
4. Planifique y marque la incisión quirúrgica si lo desea. Manipular el oído ipsilateral en una dirección anterior-posterior para determinar el plegado natural de la piel postauricular.
5. Moda una incisión de 4-5 mm en el pliegue postauricular usando tijeras de iris afiladas o una hoja número 15. Esto se puede expandir más adelante en el procedimiento según sea necesario.
6. Diseccione con rodeos a través de la fascia subcutánea inmediata y coloque un retractor micro-Weitlaner para mejorar la exposición. Tenga en cuenta que puede haber vasos sanguíneos de pequeño calibre en esta área; estos se evitan mejor retraerse superior o inferiormente a través del retractor Weitlaner.
7. Identifique el músculo vaquérico anterior a medida que viaja en una dirección inferior a superior hacia su inserción a lo largo de la base del cráneo.
   1. Se extiende suavemente a través del vientre muscular a lo largo de su punto de inserción para revelar el tendón del vientre districo anterior. Tenga en cuenta que el tendón aparece como un proceso blanco filmado que emana del músculo con una inserción sólida en la base del cráneo.
8. Después de la identificación del músculo vifárico anterior y su tendón, ajuste el retractor Weitlaner para retraer aún más el vientre muscular. Tenga en cuenta que la región expuesta posteriormente es el espacio tridimensional donde se encuentra el tronco principal del nervio facial.
   NOTA: Esta región está delimitada superior y medialmente por la base del cráneo, lateralmente por el músculo velórico anterior, posteromedialmente por el canal auditivo, y inferiormente por las estructuras del cuello, incluyendo la arteria temporal superficial.
9. Después de una exposición adecuada, identifique el tronco principal del nervio facial a medida que viaja inferiormente desde debajo del tendón del músculo vístrico, donde sale del foramen estilmastoide de la base del cráneo. Tenga en cuenta que el nervio aparece como un cordón blanco perlado, encerrado en la fascia parótida-masseteric del animal. Tenga cuidado al exponer más el nervio, por las siguientes razones.
   1. Evite la disección agresiva, o los diferenciales perpendiculares, para protegerse contra lesiones de neuropraxia mediadas por estiramiento.
   2. Evite la disección agresiva posterior y medialmente dirigida para protegerse de violar los tejidos delgados que sobrepasan el conducto auditivo, ya que esto podría introducir la flora del oído medio en el campo quirúrgico.
   3. Evite dañar la arteria temporal superficial a través de disección amplia dirigida medialy e inferiormente. Tenga en cuenta que una lesión se identificará por sangrado rápido y pulsátil.
      1. Si la arteria está lesionada, aplique presión rápida con un aplicador con punta de algodón o una gasa estéril a través de fórceps. Los agentes hemostáticos o el sellador de fibrina líquida se pueden colocar cerca de las proximidades. Tenga en cuenta que el animal puede requerir una inyección subcutánea de 0.9% solución salina estéril para la estabilización de líquidos.
10. Trace el tronco principal districulándose a lo largo del nervio en una dirección inferior, distalmente de la salida del foramen estilomastoideo.
    1. Extender la incisión original para permitir una exposición completa del nervio y sus ramas. Tenga cuidado de evitar una interrupción de la glándula parótida, ya que esto podría resultar en sialocele postoperatorio.
11. Induzca los patrones de lesión deseados de la siguiente manera.
    1. Para una lesión por aplastamiento, utilice fórceps de joyeros de superficie lisa para agarrar firmemente el nervio y comprimirlo⁹. Aplique presión constante y reproducible al nervio durante un período de 30 s para asegurar una lesión de aplastamiento adecuada.
    2. Para una simple transección, agarre la fascia que cubre el nervio, o el epineurio inmediato, con fórceps de dientes finos, y utilice microtijeras afiladas para transditar limpiamente el nervio en el punto deseado con un solo corte. Tenga cuidado de evitar el exceso de tracción en el nervio con los fórceps.
    3. Para un modelo de brecha nerviosa, cree la brecha nerviosa deseada utilizando un método similar a la lesión de transección simple. Utilice el eje esterilizado de un aplicador con punta de algodón cortado a la longitud de la brecha nerviosa deseada intraoperatoriamente para asegurar la similitud del patrón de lesión entre los animales.

5. Cierre de heridas

1. Irrigar la herida con solución salina estéril y secarla con gasa estéril.
2. Aproximadamente los bordes de la piel de una manera simple y subcuticular con suturas absorbibles, o utilice pegamento de la piel o clips de la herida, que también son aceptables para el cierre de la herida. Coloque una puntada enterrada tomando una mordida profunda a superficial de un borde de la piel y luego una posterior mordida superficial a profunda del borde opuesto de la piel.

6. Recuperación postoperatoria

1. Administrar una inyección subcutánea de analgésico antiinflamatorio no esteroideo (como 0,05 mg/kg de buprenorfina y 0,5 mg/kg de carprofeno) para el control del dolor postoperatorio. Coloque la inyección a lo largo de la espalda del animal.
2. Cese la administración del agente anestésico y permita que el animal inhale oxígeno durante 1 min adicional.
3. Coloque el animal en un calentado (a través de una lámpara de calor), jaula aséptica desprovista de material de cama para evitar la ingestión accidental. Tenga en cuenta que el animal normalmente demostrará signos de recuperación dentro de 1-2 minutos y puede aparecer desorientado, con una recuperación tardía de la función de las patas traseras.
4. Devolver a los animales a sus jaulas en la unidad de alojamiento apropiada y administrar analgésicos postoperatorios el día postoperatorio #1 para asegurar la profilaxis continua contra el dolor.
5. Monitoree a los animales 2 veces al día para evaluar los signos de desnutrición, irritación corneal o infección en el sitio quirúrgico, y mantenga registros quirúrgicos adecuados.
   1. Administrar 0.9% solución salina estéril de una manera subcutánea si hay pérdida de peso significativa.
   2. Aplique un gesto lubrio a diario hasta que se restablezca el reflejo de parpadeo del animal.

Resultados

Después del procedimiento quirúrgico inicial, hay dos tipos principales de medidas de resultado: mediciones en serie en el animal vivo y mediciones que requieren sacrificar el animal. Ejemplos de mediciones en serie incluyen ensayos electrofisiológicos, tales como una medida de potencial de acción muscular compuesta³⁰, evaluaciones del movimiento muscular facial a través de asistida por láser o videografía significa⁹, o incluso imáge...

Discusión

El modelo de lesión del nervio facial de rata ha surgido como el sistema más versátil para la evaluación de factores neurotróficos debido a su accesibilidad quirúrgica, patrón de ramificación, y significación fisiológica^{27,,29,33,34,35,36}. La combinación de video demostración y aplicación de datos animales transg...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8% isoflurane	VetOne	13985-030-40
11-0 nylon microsutures	AROSuture	TK-117038
4-0 monocryl suture	VWR	75982-084
Buprenorphine SR	ZooPharm	MIF 900-006
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
Chlorhexidine	VWR	IC19135805
Jeweler forceps	VWR	21909-458
Micro Weitlaner retractor	VWR	82030-146
Micro-scissors	VWR	100492-348
Mini tenotomy scissors	VWR	89023-522
Number 15 scalpel blade	VWR	102097-834
Operating microscope	Leica
Petrolatum eye gel	Pharmaderm	B002LUWBEK
Sterile water	VWR	89125-834
Tissue adhesive	Vetbond, 3M	NC9259532
Water conductor pad	Aqua Relief System	ARS2000B
Bupivacaine			Use as a local analgesic