ניתוח עצבי הפנים במודל חולדה כדי ללמוד עיכוב Axonal והתחדשות

Summary

פרוטוקול זה מתאר גישה מגובשת לניתוח עצבי הפנים במודל החולדה, כולל תיאורים של דפוסים inducible שונים של פציעה.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר שיטות עקביות ומתחדשות כדי ללמוד להתחדשות האקאליות ועכבות במודל של פגיעה בעצב הפנים חולדה. עצב הפנים יכול להיות מניפולציות לאורך כל אורכו, מפלח התוך-גולגולתי שלה אל המסלול החיצוני שלה. ישנם שלושה סוגים עיקריים של פגיעה בעצב המשמש למחקר ניסיוני של מאפייני רגנרציה: התאהבות עצבים, transection, ופער העצבים. מגוון התערבויות אפשריות הוא עצום, כולל מניפולציה כירורגית של העצב, משלוח של ריאגנטים נוירואקטיבי או תאים, או מניפולציות מרכזי או איברים הקצה. היתרונות של מודל זה ללימוד התחדשות עצבים כוללים פשטות, התמדה, עקביות בין מינים, שיעורי הישרדות אמין של החולדה, ו בגודל אנטומי מוגבר ביחס מודלים murine. המגבלות שלה כרוכות מניפולציה גנטית מוגבלת יותר לעומת מודל העכבר ואת יכולת ההתחדשות של החולדה, כגון מדען עצבי הפנים חייב להעריך נקודות זמן להתאוששות ואם לתרגם את התוצאות לבעלי חיים גבוהים יותר ולימודי אדם. מודל החולדה לפגיעה בעצב הפנים מאפשר פונקציונליות, אלקטרופיסיולוגית, ופרמטרים היקמריים לפרשנות והשוואה של התחדשות העצב. הדבר מתגאה בפוטנציאל עצום לקידום ההבנה והטיפול בהשלכות ההרסניות של פגיעה בעצב הפנים בחולים אנושיים.

Introduction

פגיעה בעצב הגולגולת בראש ובצוואר יכול להיות משני כדי מולדות, זיהומיות, אידיופטית, iatrogenic, טראומטי, נוירולוגי, אונולוג'יק, או חבלות מערכתית¹. עצב הגולגולת השביעי, או עצב הפנים, מושפע בדרך כלל. השכיחות של תפקוד עצבי הפנים יכול להיות משמעותי, כפי שהוא משפיע על 20 כדי 30 לכל 100,000 אנשים בכל שנה². ענפי המנוע העיקריים של עצב הפנים הם הזמן, הנזיזים, הלסת התחתונה, שוליים וענפים בצוואר הרחם; בהתאם לענף מעורב, ההשלכות יכולות לכלול יכולת למניעת הדלקת ריר אוראלי, יובש הקרנית, חסימה בשדה ויזואלי משני כדי ptosis לדיסאראז, או הפנים א-סימטרי^2,3. תחלואה ארוכת טווח כוללת תופעה של synkinesis, או תנועה בלתי רצונית של קבוצה אחת של שריר הפנים, עם ניסיון התכווצות מרצון של קבוצת שריר הפנים ברורים. הsynkinesis אוראלית-אוראלי הוא הנפוץ ביותר של התחדשות חריגה כמו הסקוויה של פגיעה בעצב הפנים וגורם ליקוי פונקציונלי, מבוכה, הערכה עצמית פחתה, ואיכות העניים של החיים³. פגיעה בענפים בודדים מכתיבה את הפונקציות הנמצאות בסיכון סלקטיבי.

הטיפול הקליני של פציעה בעצב הפנים אינו מתוקננת היטב והוא זקוק למחקר נוסף כדי לשפר את התוצאות. סטרואידים יכולים להקל על נפיחות בעצב הפנים חריפה, בעוד בוטוקס הוא שימושי עבור התנועות התחביטיים בתנועה; אבל, האפשרויות השיחזור העיקריות בארמנטריום של המטפל כרוכות בהתערבות כירורגית באמצעות תיקון עצבי, החלפה או הנפשה מחודשת^3,4,5,6. בהתאם לסוג של פגיעה בעצב הפנים מתמשכת, מנתח עצבי הפנים עשוי לנצל מספר אפשרויות. עבור transection פשוט, החיבור העצבי הוא שימושי בעוד תיקון השתל כבל מתאים יותר לפגם עצבי; עבור שחזור של פונקציה, המנתח יכול לבחור את הליכים סטטי או דינמי הפנים מחדש. במקרים רבים של פגיעה בעצב הפנים ותיקון הבאים, גם בידי מנתחים מנוסים עצב הפנים, התוצאה הטובה ביותר עדיין התוצאות של אי-סימטריה הפנים מתמשך פשרה תפקודית⁷.

התוצאות האופטימליות הללו דרזו מחקר נרחב על התחדשות עצבי הפנים. נושאים נרחבים של הריבית כוללים לשכלול וחדשנות טכניקות תיקון עצבי, קביעת ההשפעה של גורמים שונים התחדשות העצבים, ולהעריך את הפוטנציאל של מעכבי עצביים ספציפיים כדי לעזור להילחם את התוצאה לטווח ארוך של synkinesis^8,9,10,11. בעוד מודלים בתחום החוץ ניתן להשתמש כדי להעריך מאפיינים מסוימים של הפרו-צמיחה או מעכבות, מחקר הטרנסלtional אמיתי על נושא זה הוא הטוב ביותר באמצעות מודלים בעלי חיים לתרגום.

ההחלטה של איזה מודל בעלי חיים לנצל יכול להיות מאתגר, כמו חוקרים השתמשו הן בעלי חיים גדולים, כגון כבשים ומודלים בעלי חיים קטנים, כגון עכברים^12,13. בעוד דגמי בעלי חיים גדולים מציעים הדמיה אנאטומית אידיאלית, השימוש בהם מצריך ציוד מיוחד ואנשי צוות לא בקלות או זמין. יתר על כן, הפעלת מחקר כדי להפגין אפקט יכול להיות מאוד חסכוני ובלתי אפשרי בתוך הטווח הריאלי של מרכזים מדעיים רבים. לפיכך, המודל החי הקטן מנוצל לעתים קרובות. מודל העכבר יכול להיות מנוצל להערכת מספר תוצאות הקשורות לניתוח עצבי הפנים; עם זאת, אורך מוגבל של העצב יכול להגביל את יכולתו של המדען לדגמן דפוסים מסוימים, כגון פגיעה בפער גדול¹⁴.

כך, אב טיפוס חולדה murine התפתחה בתור מודל סוס עבודה שדרכו המדען יכול לבצע הליכים כירורגיים חדשניים או לנצל מעכבות או פרו-צמיחה גורמים ולהעריך את האפקט על פני מגוון רחב של פרמטרים התוצאה. האנטומיה של עצב הפנים של החולדה היא בדרך-כצפוי ובקלות מתקרב באופן שאינו ניתן לעיצוב. בקנה מידה גדול יותר, בהשוואה למודל העכבר, מאפשר מידול של מגוון רחב של פגמים כירורגיים, החל רוחבי פשוטה 5 מ"מ פערים^15,16. זה עוד מאפשר את היישום של התערבויות מורכבות באתר פגם, כולל מיקום אקטואלי של פקטור, intraneural זריקות של פקטור, ואת המיקום של איזושתלים או גשרים^{17,18,19,20,21,22,23}.

האופי הצייתן של העכברוש, האנטומיה האמינה שלה, ואת הנטייה שלה להתחדשות העצב יעיל מאפשר את האוסף של צעדים רבים התוצאות בתגובה לדפוסי ניתוח כאמור של פציעה²⁴. דרך המודל חולדה, מדען עצבי הפנים הוא מסוגל להעריך את התגובות אלקטרופיזיולוגיות לפציעה, עצב ושריר היסטולוגיים התוצאות באמצעות אימונוהיסטוכימיה, תוצאות פונקציונליות דרך מעקב אחר התנועה של הלוח vibrissal והערכת סגירת העין, ו מיקרו-ומקרוסקופי שינויים באמצעות פלורסנט או קונפוקלית מיקרוסקופ, בין השאר^{11,22,23,25,26,27,28,29} לפיכך, הפרוטוקול הבא מתווה גישה כירורגית לעצב הפנים של החולדה ולדפוסי הפציעה שיכולים להיגרם.

Protocol

כל התערבויות בוצעו בהתאמה קפדנית עם הנחיות המכון הלאומי לבריאות (NIH). הפרוטוקול הניסיוני אושר על ידי המועצה לטיפול בעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת מישיגן & השימוש הוועדה (IACUC) לפני היישום. מבוגרת בת 10 שבועות. שהיו משתמשים בחולדות

1. לפני היום הפעיל

1. להבטיח מלאי המתאים של כלי ניתוח מעוקר, תרופות משכך כאבים, תרופות הרדמה, וחמצן לפני יום הפעולה. נא עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה מלאה.

2. התקנה מראש

1. הקפידו על מרחב עבודה נאות, כולל מקום לשני אנשים לפחות (המנתח ועוזר).
   הערה: יש צורך בשולחן הפעלה ייעודי, מקום להתקנת מכונת ההרדמה, ומקום אחסון הולם לאספקה מחוטאת וגיבוי.
2. כיול מיקרוסקופ הפעלה לשימוש במהלך ההליכים. ודא כי המנתח יש את היכולת להתאים את ידיות של המיקרוסקופ ואת לחצני זום/מיקוד על ידי הצבת כיסוי מעוקר על ידיות/לחצנים
   הערה: אנו מנוצל רדיד אלומיניום מעוקר על ידיות/כפתורים.

3. הרדמה והכנה

1. מניחים את החיה בתא ההרדמה ולגרום הרדמה כללית באמצעות 1.8% isofלוריאן ו 0.9 L/min חמצן.
   1. לאשר מטוס הרדמה נאותה באמצעות הערכה של נשימה ספונטנית והערכה של התודעה על ידי הערכת תגובת בעלי החיים של החיה צביטה בבוהן.
2. החלת סיכה עין בקיעים להגן מפני גירוי הקרנית או יובש.
3. גלח את האתר (ים) הפעיל עם תער או קוצץ אוטומטי.
   1. הקמת שיטה לזיהוי עכברים בשלב זה, בין אם באמצעות תגית אוזן או באמצעות תווית/סימון זנב.
4. ניהול הזרקה תת עורית של 0.05 מ"ג/ק"ג בופרינורטין לאורך גבו של בעל החיים לצורך מניעה נגד כאבי הניתוח.

4. גישה כירורגית ודפוסי פציעה

1. להעביר את החיה לשולחן ההפעלה ולהמשיך את זרימת הגז באמצעות nosecone. ודא כי כרית ההתחממות ממוקמת מתחת לבעל החיים והשדה הסטרילי כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלו.
2. המקום גזה מעוקר (מגולגל ומהודק עם קלטת) להשתמש כמו גליל הצוואר עבור העכברוש; זה יספק חשיפה משופרת של השדה הכירורגי. שימו לב כי המיקום המתאים של בעל החיים הוא בעל חשיבות עליונה לזיהוי עצבי ולניתוח יעיל.
3. הכינו את עור הפנים של בעל החיים לפרוצדורה. השימוש כלורקסדין או פתרון יוד מבוסס לקרצף את האתר כירורגי 3x, לסירוגין עם 70% אתנול, כדי להבטיח חיטוי.
4. לתכנן ולסמן את החתך כירורגי במידת הצורך. לתמרן את האוזן התסילבת בכיוון האחורי הקדמי כדי לקבוע את קיפול טבעי של העור החותמות.
5. אופנה 4-5 מילימטר החתך בקמט משני באמצעות קשתית חדה מספריים או להב מספר 15. ניתן להרחיב זאת מאוחר יותר בשגרה בהתאם לצורך.
6. במיומנות לנתח דרך הfascia תת עורית מיידית ולמקם מיקרו-Weitlaner מפסק כדי לשפר את החשיפה. שימו לב כי ייתכנו כלי דם קטנים בקוטר באזור זה; הדרך הטובה ביותר למנוע את הירי באמצעות מפסק הוואיטלנר.
7. לזהות את השריר דיקיבה הקדמי כפי שהוא נוסע בכיוון נחות למעלה לכיוון ההוספה שלה לאורך בסיס הגולגולת.
   1. להתפשט בעדינות דרך בטן השריר לאורך נקודת הכניסה שלה כדי לחשוף את הגיד של בטן digastric הקיבה הקדמית. שימו לב כי הגיד מופיע כתהליך לבן אריג הנובע השריר עם החדרת מוצק על בסיס הגולגולת.
8. לאחר זיהוי של שריר הקיבה הקדמי והגיד שלה, להתאים את מפסק Weitlaner לשוב לסגת הבטן שריר. שימו לב שהאזור שנחשף לאחר מכן הוא המרחב התלת-מימדי שבו נמצא העורק הראשי של עצב הפנים.
   הערה: אזור זה מוגבל על ידי בסיס הגולגולת, באופן מיידי על ידי שריר הקיבה הקדמי, הפומאדילי על ידי תעלת האוזן, ובאופן מכריע על ידי המבנים של הצוואר, כולל עורק הרקה השטחית.
9. לאחר חשיפה נאותה, לזהות את המטען העיקרי של עצב הפנים כפי שהוא נוסע מתחת לגיד של שריר הקיבה digastric שם הוא יוצא את stylomastoid מבסיס הגולגולת. שים לב כי העצב מופיע כמו חוט לבנה פנינה, עטוף הfascia מעסים של בעל החיים ללעיסה. נהג בזהירות בעת חשיפת העצב, מהסיבות הבאות.
   1. להימנע מניתוח אגרסיבי, או כפולות הניצב, כדי למנוע מתיחה למתוח מתווך פציעה נוירופראקסיה.
   2. הימנע מבחינה אגרסיבית ומכוונת לניתוח מונחה כדי להגן מפני הפרה של רקמות דקות על תעלת האוזן כמו זה יכול להחדיר פלורה האוזן התיכונה לתוך השדה כירורגי.
   3. הימנע מפגיעה בעורק הזמני השטייתי באמצעות מדיה רחבה וניתוח מכוון. שימו לב שהפציעה תזוהה באמצעות דימום מרענן.
      1. אם העורק נפצע, להחיל לחץ הבקשה עם המוליך משופעת כותנה או גזה סטרילי דרך מלקחיים. סוכני הומוסטטי או איטום נוזלי של הפיברוב ניתן להציב בסמיכות. זכרו כי החיה עשויה לדרוש הזרקה תת עורית של 0.9% תמיסת מלח סטרילי לייצוב נוזלים.
10. עקוב אחר המטען הראשי באמצעות מבתר לאורך העצב בכיוון נחות, קרוב מן היציאה של stylomastoid foramen.
    1. הארך את החתך המקורי כדי לאפשר חשיפה מלאה של העצב והענפים שלה. לטפל כדי למנוע הפרעה של בלוטת הפרוטיד כמו זה יכול לגרום sialocele postאופרטיבית.
11. לגרום לדפוסי הפציעה הרצויים כדלקמן.
    1. עבור פציעה למחוץ, השתמש מלקחיים חלקה הצורף של התכשיטן כדי לתפוס בחוזקה את העצב ולדחוס אותו⁹. החלת לחץ קבוע ומתמשך על העצב לתקופה של 30 s כדי להבטיח פציעת התאהבות מתאימה.
    2. עבור העברה פשוטה, לתפוס את הfascia על העצב, או את הקולטן המיידית, עם מלקחיים בעלי שיניים משובחות, ולהשתמש מיקרו מספריים חדים כדי לשנות את העצב בנקודה הרצויה עם חתך אחד. לדאוג למנוע המתיחה עודפת על העצב עם מלקחיים.
    3. עבור מודל הפער העצבי, ליצור את הפער העצבי הרצוי באמצעות שיטה דומה הפציעה רוחבי פשוט. השתמש פיר מעוקר של המוליך כותנה משופעת-גזור את הפער עצב הרצוי אורך-תוך הקפדה על מנת להבטיח דמיון של דפוס פציעה בין בעלי חיים.

5. סגירת הפצע

1. מייבשים את הפצע בתמיסת מלח סטרילית. וייבוש אותו בגזה סטרילית
2. משוער את קצות העור בצורה פשוטה, משנית עם תפרים נספגים, או להשתמש דבק העור או הפצע קליפים, אשר גם מקובלים על סגירת הפצע. מניחים תפר קבור על ידי נטילת נשיכה עמוקה-שטחית של קצה אחד של העור ולאחר מכן לאחר מכן שטחית-עמוק לנשוך את הקצה השני של העור.

6. שחזור שלאחר הניתוח

1. ניהול הזרקה תת עורית של כאבים אנטי דלקתיות נגד דלקת (כגון 0.05 מ"ג/ק"ג של בופרנורפין ו 0.5 mg/ק"ג Carprofen) עבור בקרת כאב הניתוח. הניחו את הזריקה לאורך גבו של בעל החיים.
2. הפסיקו את הניהול של סוכן ההרדמה והניחו לבעל החיים לשאוף חמצן במשך 1 דקות נוספות.
3. מניחים את החיה ב מחומם (דרך מנורת חום), כלוב אספטי נטול חומר מצעים כדי למנוע בליעה מקרית. שים לב כי החיה יהיה בדרך כלל להפגין סימנים של התאוששות בתוך 1-2 דקות יכול להיראות מבולבל, עם התאוששות מושהית של הרגל האחוריות.
4. להחזיר את בעלי החיים לכלובים שלהם ביחידת הדיור המתאים ולנהל משככי כאבים שלאחר הניתוח ביום שלאחר הניתוח #1 כדי להבטיח המשך מניעה מפני כאב.
5. עקוב אחר בעלי החיים 2x ליום כדי להעריך סימנים של מלריה, גירוי הקרנית, או זיהום באתר כירורגי, ולשמור על יומני ניתוח המתאימים.
   1. ניהול 0.9% תמיסת מלח סטרילית בצורה תת עורית אם יש ירידה במשקל משמעותי.
   2. החל משחה עין סיכה מדי יום עד רפלקס המצמוץ של בעל החיים נוצר מחדש.

תוצאות

לאחר הליך הניתוח הראשוני, ישנם שני סוגים עיקריים של מדדי התוצאה: מדידות סדרתיות בעלי חיים ומדידות הדורשות הקרבת החיה. דוגמאות של מדידות טוריות כוללות אלקטרופיזיולוגיה assays כגון פעולה שרירים מורכבים המדד הפוטנציאלי³⁰, הערכות של תנועת שריר הפנים דרך באמצעות לי...

Discussion

מודל פציעה הפנים חולדה הגוף התפתחה כמערכת המגוונת ביותר עבור הערכה של גורמים neurotrophic בשל נגישות כירורגית שלה, מסעף דפוס, ומשמעות פיזיולוגית^{27,29,33,34,35,36}. השילוב של הדגמת וידאו ויישום ש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8% isoflurane	VetOne	13985-030-40
11-0 nylon microsutures	AROSuture	TK-117038
4-0 monocryl suture	VWR	75982-084
Buprenorphine SR	ZooPharm	MIF 900-006
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
Chlorhexidine	VWR	IC19135805
Jeweler forceps	VWR	21909-458
Micro Weitlaner retractor	VWR	82030-146
Micro-scissors	VWR	100492-348
Mini tenotomy scissors	VWR	89023-522
Number 15 scalpel blade	VWR	102097-834
Operating microscope	Leica
Petrolatum eye gel	Pharmaderm	B002LUWBEK
Sterile water	VWR	89125-834
Tissue adhesive	Vetbond, 3M	NC9259532
Water conductor pad	Aqua Relief System	ARS2000B
Bupivacaine			Use as a local analgesic