軸索抑制と再生を研究するラットモデルにおける顔面神経外科

要約

このプロトコルは、様々な傷害パターンの記述を含む、ラットモデルにおける顔面神経手術への再現可能なアプローチを記述する。

要約

このプロトコルは、ラット顔面神経損傷モデルにおける軸索再生および阻害を研究するための一貫した再現可能な方法を記述する。顔面神経は、頭蓋内セグメントから経時的な経過まで、その全長に沿って操作することができる。神経損傷には、神経クラッシュ、切除、神経ギャップの3つの主なタイプの再生特性の実験的研究に使用されます。可能な介入の範囲は、神経の外科的操作、神経活性試薬または細胞の送達、および中央または末期器官操作を含む広大である。神経再生を研究するためのこのモデルの利点は、単純さ、再現性、種間の一貫性、ラットの信頼性の高い生存率、およびマウスモデルに対する増加解剖学的サイズが含まれる。その制限は、マウスモデルに対するより限定的な遺伝子操作とラットの最上級の再生能力を含み、顔面神経科学者は回復のためのタイムポイントを慎重に評価し、結果をより高い動物およびヒト研究に翻訳するかどうかを決定しなければならない。顔面神経損傷のラットモデルは神経再生の解釈および比較のための機能的、電気生理学的および組織形態学的変数を可能にする。それによって、人間の患者における顔面神経損傷の壊滅的な結果の理解と治療を促進するための大きな可能性を誇る。

概要

頭頸部および頸部領域における頭蓋神経損傷は、先天性、感染性、特発性、外因性、外傷性、神経学的、腫瘍学的、または^全身病因に二次的であり得る。頭蓋神経VII、または顔面神経は、一般的に影響を受ける。顔面神経機能障害の発生率は^、毎年10万人当たり20〜30人に影響を及ぼすため、有意である。顔面神経の主な運動枝は、側頭、接合、頬、辺縁、頸部、頸部、および頚部である。関係する枝に応じて、その結果は、口腔の無能またはよだれを垂らしたり、角膜乾燥、下垂に続く視野閉塞、ジサルトリア、または顔面非対称性^22、33を含むことができる。長期罹患率には、異なる顔の筋肉群の自発的収縮を試みたシンキネシス、または1つの顔の筋肉群の不随意運動の現象が含まれる。口腔内シンキネシスは、顔面神経損傷の後遺症として異常な再生の最も一般的であり、機能的障害、恥ずかしさ、自尊心の低下、および生活の質の低下を引き起こす^3。個々の枝への傷害は選択的に妥協される機能を指示する。

顔面神経損傷の臨床治療は、よく標準化されておらず、結果を改善するためのさらなる研究が必要です.ステロイドは急性顔面神経腫脹を緩和することができます, 一方、ボトックスは、シンキネティック運動の温度に有用である;しかし、開業医の軍備の主要な再建オプションは、神経修復、置換、または再アニメーション^{33、4、5、64,5}を介した外科的介入^を6伴う。顔面神経損傷の種類に応じて、顔面神経外科医は多くの選択肢を利用し得る。単純な切除では、神経再吻合は有用であるのに対し、ケーブル移植片修復は神経欠損に適している。機能の回復のために、外科医は静的または動的な顔の再アニメーション手順のいずれかを選択することができる。顔面神経損傷とその後の修復の多くの場合、経験豊富な顔面神経外科医の手の中でも、最良の結果はまだ持続的な顔面非対称性と機能的妥協^7.

これらの最適でない結果は、顔面神経再生に関する広範な研究に拍車をかけた。関心の広いトピックは、神経修復技術の完成と革新、様々な神経再生因子の効果を決定し、およびシンキネシス^{8、9、10、119,}の長期的な結果と戦うのに役立つ特定⁸の神経阻害剤の可能性を評価する。^10,11in vitroモデルは、成長促進因子または阻害因子の特徴を評価するために使用することができますが、この主題に関する真の翻訳研究は、翻訳可能な動物モデルを介して行われるのが最善です。

研究者は、羊などの大型動物と小動物モデル(マウス^12,13など)の両方を利用しているので、どの動物モデルを利用するかの決定は困難であり^得13る。大型動物モデルは理想的な解剖学的可視化を提供するが、その使用は、容易または容易に利用できない特殊な機器や人員を必要とします。さらに、効果を実証するための研究を行うことは、非常にコストが高く、潜在的に多くの科学センターの実現可能な範囲内にありません。したがって、小動物モデルが最も頻繁に利用される。マウスモデルは、顔面神経手術に関連する結果の数を評価するために利用することができます;しかし、神経の限られた長さは、大きなギャップ傷害¹⁴のような特定のパターンをモデル化する科学者の能力を制限することができます。

したがって、ラットマウスプロトタイプは、科学者が革新的な外科的処置を行うか、阻害または成長促進因子を利用し、幅広い結果パラメータにわたる効果を評価できる役馬モデルとして出現した。ラット顔面神経解剖学は、再現可能な方法で予測可能かつ容易に接近する。マウスモデルと比較して、その大きなスケールは、外科的欠陥の広い範囲のモデリングを可能にし、5 mmのギャップ^15、16,16に至るまで。これにより、因子の局所配置、因子の神経内注入、およびアイソグラフトまたはブリッジ^,,17、18、19、20、21、22、23を含む、欠陥部位での複雑な介入の適用をさらに可能にする。^{17,182320,21,22,19}

ラットの従順な解剖学、および効果的な神経再生のためのその傾向の教義的性質は、傷害²⁴の前述の外科的パターンに応答して多くの結果尺度の収集を可能にする。^26,ラットモデルを介して、顔面神経科学者は、免疫組織化学、ビブリサルパッドの動きを追跡し、眼閉鎖を評価することによって機能的な結果を介して傷害、神経および筋肉組織学的結果に対する電気生理学的反応を評価することができ、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡による微小および巨微小的な変化、とりわけ11、22、23、25、27、^{11,22,23,25,2927、27、 29。,,}したがって、以下のプロトコルは、ラット顔面神経および誘発され得る傷害パターンに対する外科的アプローチを概説する。

プロトコル

すべての介入は、国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに厳密に従って行われました。実験議定書は、実施前にミシガン大学の制度的動物ケア・使用委員会(IACUC)によって承認された。10週齢の成虫雌のスプレイグ・ドーリーラットを利用した。

1. 手術日の前

1. 手術日の前に、殺菌された手術器具、鎮痛薬、麻酔薬、酸素の適切な在庫を確保してください。完全なリストについては、資料一覧を参照してください。

2. 術前セットアップ

1. 少なくとも2人の個人(外科医と助手)のためのスペースを含む、十分な作業スペースを確保してください。
   メモ:専用の手術台、麻酔装置のセットアップのためのスペース、滅菌およびバックアップ用品のための十分な記憶スペースが必要です。
2. 手順中に使用するために操作顕微鏡を較正します。外科医がハンドル/ボタンの上に殺菌されたカバーを置くことによって顕微鏡およびズーム/フォーカスボタンのハンドルを調節する機能を持っていることを確認しなさい
   注:ハンドル/ボタンの上に滅菌アルミニウム箔を利用しました。

3. 麻酔と準備

1. 動物を麻酔室に入れ、1.8%のイオブルランと0.9 L/分酸素を介して全身麻酔を誘発する。
   1. 自発呼吸の評価と、つま先ピンチに対する動物の悲惨な反応を評価することによって、意識の評価を通じて麻酔の十分な平面を確認する。
2. 角膜刺激や乾燥から守るために、眼の潤滑剤を二国間に塗布してください。
3. カミソリまたは自動クリッパーで操作部位を剃ります。
   1. この時点で、耳札またはテールラベル/マーキングを介して、ラットの識別方法を確立します。
4. 術後疼痛に対する予防のために、動物の背中に沿って0.05mg/kgブプレノルフィンの皮下注射を投与する。

4. 外科的アプローチと傷害パターン

1. 動物を手術台に移し、ノセコンを介してガスの流れを続ける。温暖化パッドが動物の下に置かれていることを確認し、その体温を維持するために無菌フィールド。
2. ラットのネックロールとして使用するために殺菌されたガーゼ(巻き上げ、テープで留めた)を置きます。これは外科分野の高められた露出を提供する。動物の適切な位置決めは、効率的な神経同定および解剖のために最も重要であることに注意してください。
3. 処置のために動物の顔の皮膚を準備する。クロルヘキシジンまたはヨウ素系溶液を使用して、手術部位3xをスクラブし、70%エタノールと交互に、消毒を確実にする。
4. 必要に応じて、外科的切開を計画し、マークします。前後方向にイプシラテリアを操作して、心房後皮膚の自然な折り畳みを決定します。
5. 鋭い虹彩はさみまたは番号15刃を使用して、耳介後の折り目に4〜5mmの切開をファッション。これは、必要に応じて、手順の後半で拡張することができます。
6. 即時皮下筋膜を通してぶっきらぼうに解剖し、露出を高めるためにマイクロワイトラナーレトラクタを置く。この領域には小口径血管がある可能性があることに注意してください;これらは、ヴァイトラナーレトラクターを介して優れたまたは劣った退避によって避けるのが最善です。
7. 頭蓋骨の基部に沿って挿入に向かって劣った方向から優れた方向に移動する前の筋を識別します。
   1. 挿入ポイントに沿って筋肉腹を通して穏やかに広がり、前部筋の腱を明らかにする。腱は、頭蓋骨の基部に固体挿入を有する筋肉から発せられるフィルム状の白いプロセスとして現れる。
8. 前部筋と腱を同定した後、さらに筋肉の腹を引っ込めるためにワイトラナーレトラクターを調整します。なお、その後の露出領域は、顔面神経の主幹が位置する立体空間であることに注意してください。
   注:この領域は、頭蓋骨の基部によって優れた内側に境界され、後方は前部の筋、外耳道による後心、および表在側側動脈を含む首の構造によって劣っている。
9. 十分な暴露の後、頭蓋骨の基部から左回筋を出るジガスト筋肉の腱の下から劣って移動する顔面神経の主幹を特定する。神経は、動物の耳下腺腫性マセセリック筋膜に包まれた真珠の白いコードとして現れる。さらに神経を露出させる場合は、次の理由により注意を払ってください。
   1. ストレッチ媒介性神経障害を防ぐために、積極的な解剖、または垂直な広がりを避けてください。
   2. これは外科分野に中耳の植物相を導入する可能性がありますので、外耳道の上に薄い組織の違反を防ぐために積極的な後部および内側方向の解剖を避けてください。
   3. 広い内側と劣った指示された解剖を通して表面的な側頭動脈を損傷することは避けてください。傷害は、活発で脈動性の出血によって識別されることに注意してください。
      1. 動脈が損傷した場合は、綿先端のアプリケーターまたは鉗子を介して滅菌ガーゼで迅速な圧力を加えます。止血剤または液体フィブリンシーラントは近接して配置することができます。動物は、流体安定化のために0.9%の無菌生理食動物の皮下注射を必要とする場合があることを覚えておいてください。
10. 主幹を遠位にトレースし、神経に沿って下方向に解剖し、スティロマストイドの口腔の出口から遠位にする。
    1. 元の切開を拡張して、神経とその枝の完全な露出を可能にします。これは術後シアロセレをもたらす可能性がありますので、耳下腺の破壊を避けるために注意してください。
11. 目的の傷害パターンを以下のように誘導する。
    1. クラッシュ傷害のために、滑らかな表面の宝石商の鉗子を使用して神経をしっかりとつかみ、^それを9.に圧縮する。適切なクラッシュ傷害を確実にするために、30 sの期間神経に一定の再現性の圧力を適用します。
    2. 単純なトランセクションの場合は、神経の上に筋膜、または直下の上耳神経を細かい歯の鉗子でつかみ、鋭利なマイクロシザーを使用して、1回の切り口で所望のポイントで神経をきれいにトランセクトします。鉗子で神経に余分な牽引を避けるように注意してください。
    3. 神経ギャップモデルの場合は、単純な横断損傷と同様の方法を使用して、所望の神経ギャップを作成します。綿状のアプリケータカットの滅菌シャフトを、所望の神経ギャップの長さに切り取り、動物間の傷害パターンの類似性を確保します。

5. 創傷閉鎖

1. 滅菌生理的な状態で傷を灌漑し、滅菌ガーゼで乾燥させます。
2. 吸収性縫合糸を持つ単純な、サブカットの方法で皮膚の縁を近似するか、傷の閉鎖のためにも許容される皮膚の接着剤または傷のクリップを使用する。1つの皮膚の端の深い表面的な咬傷を取り、その後、反対側の皮膚の端の表面的から深い一口を取ることによって、埋もれたステッチを置きます。

6. 術後回復

1. 非ステロイド性抗炎症鎮痛薬(例えば、ブプレノルフィンの0.05mg/kgおよび0.5mg /kgカルプロフェン)の皮下注射を投与して術後疼痛制御を行う。動物の背中に沿って注射を置きます。
2. 麻酔薬の投与を中止し、動物が酸素を1分間吸入できるようにします。
3. 動物を(ヒートランプを介して)暖かく、偶発的な摂取を避けるために寝具材を欠いた無菌ケージに置きます。動物は通常、1〜2分以内に回復の兆候を示し、後肢機能の遅れた回復で、混乱しているように見えることがあることに注意してください。
4. 動物を適切な住宅ユニットのケージに戻し、術後の日に術後鎮痛薬を投与#1痛みに対する継続的な予防を確実にします。
5. 動物を1日2倍に監視して、栄養失調、角膜刺激、または外科的部位感染の兆候を評価し、適切な外科ログを維持する。
   1. 有意な体重減少がある場合は、皮下の方法で0.9%の無菌生理食糸を投与する。
   2. 動物のまばたき反射が再確立されるまで、潤滑眼軟膏を毎日塗布してください。

結果

最初の外科的処置に続いて、結果の測定の2つの主要なタイプがある:生きている動物の連続測定および動物を犠牲にする必要がある測定。連続測定の例としては、化合物筋肉作用電位測定³⁰などの電気生理学的アッセイ、レーザーアシストまたはビデオ撮影手段⁹を介した顔面筋運動の評価、あるいは蛍光トランスジェニック動物

ディスカッション

このラット顔面神経損傷モデルは、外科的アクセス性、分岐パターン、および^,生理学的意義^,27、29、33、34、35、36^27,29,33による神経栄養因子の評価のための最も汎用性の高いシステムとして登場した。^35,3634ビデオデモとトランスジェニック動物?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8% isoflurane	VetOne	13985-030-40
11-0 nylon microsutures	AROSuture	TK-117038
4-0 monocryl suture	VWR	75982-084
Buprenorphine SR	ZooPharm	MIF 900-006
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
Chlorhexidine	VWR	IC19135805
Jeweler forceps	VWR	21909-458
Micro Weitlaner retractor	VWR	82030-146
Micro-scissors	VWR	100492-348
Mini tenotomy scissors	VWR	89023-522
Number 15 scalpel blade	VWR	102097-834
Operating microscope	Leica
Petrolatum eye gel	Pharmaderm	B002LUWBEK
Sterile water	VWR	89125-834
Tissue adhesive	Vetbond, 3M	NC9259532
Water conductor pad	Aqua Relief System	ARS2000B
Bupivacaine			Use as a local analgesic