축축한 억제 및 재생을 연구하는 쥐 모델의 안면 신경 수술

요약

이 프로토콜은 부상의 다양한 유도 패턴의 설명을 포함하여 쥐 모델에서 안면 신경 수술에 대한 재현 가능한 접근 방식을 설명합니다.

초록

이 프로토콜은 쥐 얼굴 신경 손상 모델에서 축축한 재생 및 억제를 연구하는 일관되고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 얼굴 신경은 두개내 세그먼트에서 시간외 코스에 이르기까지 전체 길이를 따라 조작 할 수 있습니다. 재생 속성의 실험 연구에 사용 되는 신경 부상의 세 가지 기본 유형이 있다: 신경 호감, transection, 그리고 신경 간격. 가능한 내정간섭의 범위는 신경의 외과 조작, 신경 성 시약 또는 세포의 납품, 및 중앙 또는 말기 조작을 포함하여 광대합니다. 신경 재생을 연구하기위한이 모델의 장점은 단순성, 재현성, 종 간 일관성, 쥐의 신뢰할 수있는 생존율, 그리고 뮤린 모델에 비해 증가 된 해부학 적 크기를 포함한다. 그것의 한계는 마우스 모형 과 쥐의 최상급 재생 능력에 비해 더 한정된 유전 조작을 관련시킵니다, 안면 신경 과학자는 신중하게 복구를 위한 시간 점을 평가하고 더 높은 동물과 인간 연구 결과에 결과를 번역할지 여부를 이렇게. 안면 신경 손상에 대한 쥐 모델은 신경 재생의 해석 및 비교를 위한 기능적, 전기 생리학적 및 조직체학적 파라미터를 허용합니다. 그것은 인간 환자에 있는 안면 신경 상해의 파괴적인 결과의 이해 그리고 처리를 발전시키는 쪽으로 엄청난 잠재력을 자랑합니다.

서문

머리와 목 부위의 두개골 신경 손상은 선천성, 전염성, 특발성, 난성성, 외상성, 신경학적, 종양학, 또는 전신 병인에 이차적일 수 있다^1. 두개골 신경 VII, 또는 안면 신경은 일반적으로 영향을 받습니다. 안면 신경 기능 장애의 부각은 매년 100,000명의 사람들 당 20에서 30에 영향을 미치기 때문에 중요할 수 있습니다^2. 안면 신경의 주요 운동 가지는 측두엽, zygomatic, 볼, 한계 하악골 및 자궁 경부 가지; 관련된 가지에 따라, 결과는 구강 무능력 또는 침을 흘리거나, 각막 건조, ptosis, dysarthria, 또는 안면 비대칭^2,,3에이차 적인 시야 방해를 포함할 수 있습니다. 장기 이환율은 synkinesis의 현상을 포함, 또는 하나의 얼굴 근육 그룹의 무의식적인 운동, 독특한 얼굴 근육 그룹의 자발적인 수축을 시도. 안구 구강 합성은 안면 신경 손상의 후유증으로 비정상적인 재생의 가장 흔한 기능 장애, 당황, 감소 된 자부심, 삶의 질^{저하를 야기3.} 개별 가지에 대한 부상은 선택적으로 손상된 기능을 지시합니다.

안면 신경 손상의 임상 치료는 잘 표준화되지 않고 결과를 개선하기 위해 추가 연구가 필요합니다. 스테로이드급성 안면 신경 부종을 완화할 수 있습니다., 보톡스는 synkinetic 움직임을 temporizing에 대 한 유용 하는 반면; 그러나, 개업의의 무기고에 있는 1 차적인 재건 선택권은 신경 수선, 대체, 또는 재애니메이션^{3,,4,,5,,6를}통해 외과 적 개입을 관련시킵니다. 안면 신경 손상의 유형에 따라 안면 신경 외과 의사는 여러 가지 옵션을 활용할 수 있습니다. 간단한 절제술의 경우 신경 절제술이 유용하지만 케이블 이식 수술 수리는 신경 결함에 더 적합합니다. 기능의 복원을 위해, 외과 의사는 정적 또는 동적 얼굴 재애니메이션 절차를 선택할 수 있습니다. 얼굴 신경 부상 및 후속 수리의 많은 경우에, 심지어 경험이 풍부한 얼굴 신경 외과 의사의 손에, 최고의 결과는 여전히 지속적인 얼굴 비대칭 및^기능적타협 7 결과 .

이러한 최적이 아닌 결과는 안면 신경 재생에 대한 광범위한 연구를 촉진했습니다. 관심의 광범위한 주제는 합성^{88,9,,10,,11의}장기적인 결과에 대처하는 데 도움이 되는 다양한 신경 재생 인자의 효과를 결정하고, 특정 신경 억제제의 잠재력을 평가하는, 신경 수리 기술을 완성하고 혁신하는 것을 포함한다. 시험관 내 모델은 프로 성장 또는 억제 인자의 일부 특성을 평가하는 데 사용할 수 있지만,이 주제에 대한 진정한 번역 연구는 번역 가능한 동물 모델을 통해 가장 잘 수행됩니다.

연구자들이 양과 같은 대형 동물모델과^{마우스(12,,13)와}같은 소형 동물 모델을 모두 활용했기 때문에 어떤 동물 모델을 활용해야 할지 결정하는 것은 어려울 수 있다. 대형 동물 모델은 이상적인 해부학 시각화를 제공하지만, 그 사용에는 전문 장비와 인력이 쉽게 또는 쉽게 구할 수 없습니다. 또한, 효과를 입증하기 위해 연구에 전원을 공급하는 것은 매우 비용 금지 및 잠재적으로 많은 과학 센터의 가능한 범위 내에서 하지 않을 수 있습니다. 따라서, 소형 동물 모델이 가장 빈번히 활용된다. 마우스 모델은 안면 신경 수술과 관련된 다수의 결과를 평가하는 데 활용될 수 있다; 그러나, 신경의 제한된 길이는 큰 갭 부상^(14)과같은 특정 패턴을 모델링하는 과학자의 능력을 제한 할 수 있습니다.

따라서, 쥐 뮤린 프로토타입은 과학자가 혁신적인 외과 적 수술을 수행하거나 억제 또는 프로 성장 인자를 활용하고 광범위한 결과 매개 변수에 걸쳐 효과를 평가 할 수있는 주력 모델로 부상했습니다. 쥐 얼굴 신경 해부학은 예측 가능하고 쉽게 재현 가능한 방식으로 접근합니다. 그것의 더 큰 규모는 마우스 모형에 비교하여, 간단한 transections에서 5 mm 간격^15,,16에구역 수색하는 수술 결함의 넓은 범위를 모델링을 허용합니다. 이것은 또한 요인의 국소 배치, 요인의 내신경 주사, 및 이원이식 또는 교량^{17,,18,,19,,20,,21,,22,,23의}배치를 포함하여 결함 부위에서 복잡한 개입을 적용 할 수 있습니다.

쥐의 유순한 성질, 그 신뢰할 수있는 해부학 및 효과적인 신경 재생에 대한 경향은 앞서 언급 한 부상²⁴의 수술 패턴에 대한 응답으로 많은 결과 측정의 수집을 허용합니다. 쥐 모델을 통해 안면 신경 과학자는 면역 조직화학을 통한 부상, 신경 및 근육 조직학적 결과에 대한 전기 생리학적 반응을 평가할 수 있으며, 생체 패드의 추적 운동을 통한 기능적 결과 및 눈 폐쇄를 평가하고, 형광 또는 공초점 현미경을 통한 미세 및 거시적 변화, 기타^{,26,27,2811,,,22,,,23,25}, 26 , 27 , 27 , 28 ,²⁸. 따라서, 이하의 프로토콜은 쥐 안면 신경및 유도될 수 있는 상해 패턴에 대한 외과적 접근법을 개략적으로 설명할 것이다.

프로토콜

모든 내정간섭은 건강의 국가 학회 (NIH) 지침에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 실험 프로토콜은 미시간 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 구현하기 전에 승인되었습니다. 10주령 성인 암컷 스프라그-다울리 쥐를 활용하였다.

1. 수술일 전

1. 수술 일 전에 멸균 수술 기구, 진통제, 마취 약물 및 산소의 적절한 재고를 확인하십시오. 전체 목록은 재료 표를 참조하십시오.

2. 수술 전 설정

1. 적어도 두 명 (외과 의사와 조수)을위한 공간을 포함하여 적절한 작업 공간을 확보하십시오.
   참고: 전용 수술대, 마취 기계 설치를 위한 공간, 멸균 및 백업 소모품을 위한 적절한 보관 공간이 필요합니다.
2. 시술 중에 사용할 작동 현미경을 교정합니다. 외과 의사는 손잡이 / 버튼 위에 살균 커버를 배치하여 현미경과 줌 / 초점 버튼의 핸들을 조정할 수있는 능력을 가지고 있는지 확인
   참고 : 우리는 손잡이 / 버튼 위에 살균 된 알루미늄 호일을 사용했습니다.

3. 마취 및 준비

1. 마취 챔버에 동물을 배치하고 1.8 % 이소플루란 과 0.9 L / 분 산소를 통해 전신 마취를 유도.
   1. 발가락 핀치에 대한 동물의 찡그린 반응을 평가하여 자발적인 호흡 평가와 의식 평가를 통해 적절한 마취 평면을 확인합니다.
2. 각막 자극이나 건조함을 막기 위해 눈 윤활제를 양자간 발라주세요.
3. 면도기 또는 자동 클리퍼로 수술 부위를 면도하십시오.
   1. 이 때 귀 태그 또는 꼬리 라벨/마킹을 통해 쥐 식별 방법을 설정합니다.
4. 수술 후 통증에 대한 예방을 위해 동물의 등을 따라 0.05 mg / kg buprenorphine의 피하 주사를 투여하십시오.

4. 외과 접근 및 상해 패턴

1. 동물을 수술대에 옮기고 노코콘을 통해 가스 흐름을 계속합니다. 온난화 패드가 동물과 멸균 장 아래에 위치하여 체온을 유지하도록 하십시오.
2. 멸균 된 거즈 (말려서 테이프로 고정)를 놓고 쥐를위한 목 롤로 사용합니다. 이것은 외과 필드의 향상된 노출을 제공할 것입니다. 동물의 적절한 위치는 효율적인 신경 식별 및 해부를 위해 가장 중요합니다.
3. 시술을 위해 동물의 얼굴 피부를 준비합니다. 클로르헥시딘 또는 요오드 기반 용액을 사용하여 70% 에탄올과 번갈아 가며 수술 부위를 3배 문질러 소독하십시오.
4. 원하는 경우 수술 절개를 계획하고 표시하십시오. 전방 후방 방향으로 입시쪽 귀를 조작하여 후면 피부의 자연스러운 접기를 결정합니다.
5. 날카로운 홍 채 가위 또는 숫자 15 블레이드를 사용 하 여 후 주름에 4 ~ 5mm 절개를 패션. 필요에 따라 절차의 나중에 확장할 수 있습니다.
6. 즉각적인 피하 근막을 통해 무딘 해부하고 노출을 향상시키기 위해 마이크로 바이틀러 리트랙터를 배치합니다. 이 지역에 작은 구경 혈관있을 수 있습니다 참고; Weitlaner 리트랙터를 통해 우월하거나 열등하게 후퇴하여 피하는 것이 가장 좋습니다.
7. 두개골 기지를 따라 삽입을 향해 열등한 에서 우수한 방향으로 여행할 때 전방 굴절 근육을 식별합니다.
   1. 삽입 지점을 따라 근육 배를 통해 부드럽게 확산하여 전방 굴착 배의 힘줄을 드러냅니다. 힘줄은 두개골 베이스에 단단한 삽입과 근육에서 방출 필름 흰색 과정으로 나타납니다.
8. 전방 굴착 근육과 힘줄을 식별 한 후, 더 근육 배를 철회하기 위해 Weitlaner 리트랙터를 조정합니다. 이후에 노출된 영역은 안면 신경의 주요 트렁크가 있는 3차원 공간입니다.
   참고 : 이 부위는 두개골 기지에 의해 우월하고 중간으로 경계되며, 측면 측두엽 근육에 의해, 외이도에 의한 후방, 그리고 표면 측두동맥을 포함한 목의 구조에 의해 열등합니다.
9. 적절한 노출 후, 그것은 두개골 기지에서 스타일로마스토이드 포어맨을 종료 digastric 근육의 힘줄 아래에서 열등하게 여행으로 얼굴 신경의 주요 트렁크를 식별합니다. 신경은 동물의 parotid-masseteric 근막에 싸여 진주 백색 코드로 나타납니다. 다음과 같은 이유로 신경을 더 노출시킬 때주의를 기울이라.
   1. 적극적인 해부, 또는 수직 스프레드를 피하십시오, 스트레치 매개 신경 실증 부상에 대해 보호하기 위해.
   2. 이 수술 필드에 중이 식물을 소개 할 수 로 외이도 위에 얇은 조직을 위반에 대한 보호하기 위해 적극적인 후방 및 내측 지시 해부를 피하십시오.
   3. 광범위 하 게 중간 및 열등 지시 해 부를 통해 표면 측두 동맥손상 하지 마십시오. 부상은 활발한 맥동 출혈로 식별됩니다.
      1. 동맥이 다친 경우, 면팁 어플리케이터또는 집게를 통해 멸균 거즈로 신속한 압력을 가하십시오. 지압 제 또는 액체 피브린 실란트는 가까운 거리에 배치 할 수 있습니다. 동물은 유체 안정화를 위해 0.9 % 멸균 식염수의 피하 주입을 필요로 할 수 있음을 명심하십시오.
10. 주 트렁크를 열등한 방향으로 해부하여, stylomastoid 포라멘의 출구에서 분리하여 추적합니다.
    1. 신경과 그 가지의 완전한 노출을 허용하도록 원래 절개를 확장합니다. 이 수술 후 sialocele 귀착될 수 있기 때문에 parotid 동맥의 중단을 피하기 위해주의하십시오.
11. 원하는 부상 패턴을 다음과 같이 유도한다.
    1. 호감 부상의 경우, 단단히 신경을 잡고 압축 매끄러운 표면 보석의 집게를 사용하여^9. 적절한 호감 부상을 보장하기 위해 30 s의 기간 동안 신경에 일정하고 재현 가능한 압력을 가하십시오.
    2. 간단한 transection의 경우, 신경을 오버리 근막, 또는 즉각적인 상피, 미세 치아 집게와, 그리고 깨끗한 하나의 컷으로 원하는 지점에서 신경을 변환하는 날카로운 미세 가위를 사용합니다. 집게와 신경에 과잉 견인을 피하기 위해주의하십시오.
    3. 신경 갭 모델의 경우, 간단한 성분절 손상과 유사한 방법을 사용하여 원하는 신경 갭을 생성합니다. 동물 간의 부상 패턴의 유사성을 보장하기 위해 원하는 신경 갭 길이에 면 팁 어플리케이터 컷의 멸균 샤프트를 사용 수술 중.

5. 상처 폐쇄

1. 멸균 식염수로 상처를 관개하고 멸균 거즈로 건조시면 됩니다.
2. 흡수성 봉합사를 사용하여 단순하고 피하 방식으로 피부 가장자리를 근사화하거나 상처 폐쇄에 허용되는 피부 접착제 또는 상처 클립을 사용합니다. 한 피부 가장자리의 깊은 피상적 인 물린 다음 반대 피부 가장자리의 후속 피상적 인 깊은 물린하여 매장 스티치를 배치합니다.

6. 수술 후 회복

1. 수술 후 통증 조절을 위해 비스테로이드 성 항 염증 진통제 (예 : 부프레노르핀 0.05 mg / kg 및 0.5 mg /kg 카프로펜)의 피하 주사를 투여하십시오. 동물의 등을 따라 주사를 놓습니다.
2. 마취제의 투여를 중단하고 동물이 추가로 1 분 동안 산소를 흡입 할 수 있도록하십시오.
3. 동물을 우발적인 섭취를 피하기 위해 침구 재료가 없는 무균 케이지(열 램프를 통해)에 놓습니다. 동물은 일반적으로 1-2 분 이내에 회복의 징후를 보여주고 뒷다리 기능의 지연 된 회복과 함께 방향 감각이 상실 될 수 있습니다.
4. 적절한 하우징 유닛에 있는 새장에 동물을 돌려보내고 수술 후 #1 통증에 대한 지속적인 예방을 보장하기 위해 수술 후 진통제를 투여하십시오.
5. 영양 실조, 각막 자극 또는 수술 부위 감염의 징후를 평가하기 위해 하루에 2 배의 동물을 모니터링하고 적절한 수술 로그를 유지하십시오.
   1. 상당한 체중 감소가있는 경우 피하 방식으로 0.9 % 멸균 식염수 투여.
   2. 동물의 깜박임 반사가 다시 확립 될 때까지 매일 윤활 눈 연고를 적용하십시오.

결과

초기 수술 후, 결과 측정의 두 가지 주요 유형이 있다: 살아있는 동물의 직렬 측정 및 동물을 희생 해야 하는 측정. 직렬 측정의 예로는 화합물 근육 작용 전위^측정(30)등의 전기생리학적 측정, 레이저 보조 또는 비디오그래피 수단을 통한 안면 근육 움직임의 평가^9,형질전환 동물에서 얼굴 신경의 재성장의 반복적인 라이브^?...

토론

랫트 안면 신경 손상 모델은 수술 접근성, 분기 패턴 및 생리적 유의성^{27,,29, 33,,,33,34,,35,36으로}인한 신경 영양 인자의 평가를 위한 가장 다재다능한 시스템으로 부상되었다. 비디오 데모와 형질전환 동물 데이터의 응용의 조합은 신경 재생 현상의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8% isoflurane	VetOne	13985-030-40
11-0 nylon microsutures	AROSuture	TK-117038
4-0 monocryl suture	VWR	75982-084
Buprenorphine SR	ZooPharm	MIF 900-006
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
Chlorhexidine	VWR	IC19135805
Jeweler forceps	VWR	21909-458
Micro Weitlaner retractor	VWR	82030-146
Micro-scissors	VWR	100492-348
Mini tenotomy scissors	VWR	89023-522
Number 15 scalpel blade	VWR	102097-834
Operating microscope	Leica
Petrolatum eye gel	Pharmaderm	B002LUWBEK
Sterile water	VWR	89125-834
Tissue adhesive	Vetbond, 3M	NC9259532
Water conductor pad	Aqua Relief System	ARS2000B
Bupivacaine			Use as a local analgesic