增殖人类抗原特异性CD4+ T细胞使用卡博曲莱辛苏奇尼米酯的定量

摘要

这里介绍的是一个协议,用于测量增殖CD4⁺ T细胞,以响应抗原蛋白或肽使用染料稀释。这种测定对稀有抗原特异性T细胞特别敏感,可以进行改性,以利于抗原特异性细胞的克隆。

摘要

所述是一种简单的体外染料稀释方法,用于测量人类外周血单核细胞(PBMC)中抗原特异性CD4+T细胞增殖。稳定、无毒的荧光染料(如卡博基氟辛苏奇尼酰基酯(CFSE)的开发,通过减少荧光染色(通过流式细胞测定)来区分稀有的抗原特异性T细胞。与替代方法不同,此方法具有以下优点:(i) 对低频 T 细胞非常敏感,(ii) 不需要抗原或表位的知识,(iii) 可以分析响应细胞的表型,以及 (iv) 可行、有反应的细胞可以排序,并用于进一步分析,如T细胞克隆。

引言

检测和研究抗原特异性T细胞的能力在细胞介导免疫研究中非常重要。然而,这样做对于自身抗原特异性CD4和T细胞反应尤其具有挑战性,后者非常弱,难以检测。用于检测抗原特异性淋巴细胞增殖的常用方法是[3H]-胸腺素,这是一种放射性标记的核苷酸,并结合在增殖细胞的DNA中。虽然[3H]-胸腺酰胺测定可以检测DNA合成,但这种方法是细胞分裂的间接测量,因为DNA合成可以独立于线粒体分裂(即,在基因复制和凋^亡1期间)启动。由于细胞抗原特异性增殖可导致大量细胞凋亡,导致抗原特异性增殖的潜在高估,使这一问题更加复杂。此外,[3H]-胸腺素法不为扩散淋巴细胞提供花样信息,如CD4+或CD8+在受抗原肽刺激的PBMC中系生增殖。

2003年,我们发布了第一个使用CFSE的染料稀释测定,称为CFSE增殖测定3,4。CFSE 是一种荧光染料,通过与细胞内溶酶残留物形成共价键,与细胞内蛋白质形成稳稳结合。由于CFSE标记的蛋白质在子细胞3之间平均分配,分裂细胞可以通过流动细胞测定来区分未分割的细胞,这也允许淋巴细胞群的定量型型。事实上,细胞从CFSE染色时开始经历的分裂数量可以测量到一定程度5。最近,许多类似的染料,如细胞跟踪紫罗兰增殖染料(VPD)和细胞跟踪染料已经开发出来,它们的工作方式相似6。该协议侧重于 CFSE,但这些原则同样适用于其他相关染料。

肽-MHC四聚体染色是检测和克隆抗原特异性CD8+T细胞的广泛使用的方法。这是一个公认的方法7,8,9,10;然而,基于四元体的克隆需要现有的表位/MHC限制知识,每个表位都需要自己的四元体11,这限制了发现和克隆新型表位特异性T细胞的范围。基于CFSE的增殖可用于肽、蛋白质或细胞裂物。本文所述的协议既简单又坚固,响应CD4+T细胞可分类,用于下游功能和生化表征测定12,13。

研究方案

所有受试者在采集外周血之前都给予知情同意。圣文森特霍斯普蒂亚尔(HREC-A 135/08和HREC-A 161/15)对使用PBMC的实验给予伦理批准。

1. 试剂制备

1. 人类T细胞培养基
   1. 准备RP-5培养PBMC,包括RPMI 1640、1x非必需氨基酸、L-丙烯-谷肽(2 mM)、青霉素(100 U/mL)/链霉素(0.1毫克/mL)和5%的人类血清(PHS)。
2. CFSE 库存解决方案
   1. 通过在+9 mL DMSO中溶解25毫克CFSE,制备主库存,以达到浓度为5 mM的最终库存溶液。
   2. 通过稀释 PBS 中的主库存来准备工作库存,以实现 10 μM 的工作浓度。

2. 全血制备人体多溴联苯细胞

1. 人外周血一般在0.5~1.5×10⁶ PBMC/mL之间。因此,所需血液量取决于所需数量的PBMC。用PBS至少稀释人外周血1:2。通过在 50 mL 管中加入 15 mL 的密度梯度介质,然后覆盖 35 mL 稀释的全血,分离 PBMC。
2. 在室温 (RT) 下,在 850 x g下离心 15 分钟,不减速。这将导致三个清晰的层:包含红血球颗粒的底层,中间层的密度梯度介质与白血球衬里其顶部界面,和顶部血浆^层14。
3. 拆下大约 20 mL 的顶层等离子层。收集白血球层,小心避免红细胞颗粒。用PBS洗涤3x,在血细胞计上使用锥形蓝色排除计数活细胞。在 PBS 中稀释至 1 x 10⁶ PBMC/mL。
4. 非CFSE染色细胞
   1. 这些细胞用作流动细胞学的补偿控制,包括未染色和CD4+单染色细胞。将每个控制样品的300 μL PBMC悬浮液加入10 mL管中,顶部加PBS,在550 x g下在RT下5分钟离心。
   2. 在 RP-5 介质中重新悬浮 1 x 10⁶个单元/mL。用CFSE标记的细胞在37°C/5%CO2培养箱中孵育这些未标记的细胞7天(步骤2.6.1)。
5. CFSE 染色细胞
   1. 将细胞从步骤 2.3 转移到 50 mL 管中。将 1.0 μL 的 CFSE 工作库存溶液 (10 μM) 每 1 mL 的电池悬浮液添加到管侧。通过多次反转管快速混合。CFSE的最终浓度为10 nM。
   2. 在37°C/5%CO2培养箱中孵育5分钟。为了停止染色,加入5 mL的RP-5介质,在550 x g下通过离心5分钟颗粒细胞。在 RP-5 介质中以 1 x 10⁶/mL 重新悬浮 PBMC。
   3. 将1.0 mL的细胞悬浮液添加到10 mL管中。对要测试的每个抗原使用一根管子。
6. 人类PBMC和细胞培养的抗原刺激
   1. 在37°C/5%CO2培养箱中培养带有抗原的含有抗原的PBMC。 在含有稀释抗原的RP-5介质的100μL/孔的96孔板中培养1 x 10⁵细胞/孔(100μL)。
      注:使用的抗原,包括工作浓度,在表1中概述。

3. 用于 FACS 分析的抗 CD4 染色

1. 将培养细胞的移液200μL放入FACS管中,在含有0.1%FCS的PBS中洗涤细胞1x,在550 x g下离心5分钟。
2. 在 100 μL 的 PBS/0.1% FCS 中染色,带抗人 CD4 Alexa Fluor 647 (0.25 mg/mL)。留出一个CFSE标记细胞的样本,未与任何其他荧光道染色,用于设置FACS CFSE补偿。在4°C下孵育细胞,防止光线照射20分钟。
3. 通过加入1 mL的PBS/0.1%FCS清洗细胞,在550 x g下在RT下离心5分钟,并在100μL的PBS/0.1%FCS中重新悬浮。在FACS分析之前,在所有管中加入1μL的碘化钠(PI,0.1 mg/mL),以便通过流动细胞学排除死细胞。

4. 流式细胞测量配置和浇注策略

注:图 1显示了 FACS 配置,包括补偿控制和门控策略。

1. 门正向散射 (FSC) 与侧散射 (SSC) (图 1A) 总体,以包括所有淋巴细胞。
2. 将FSC与PI(图1B)总体在PI负细胞上,以排除凋亡细胞。
3. 使用未染色的细胞为非荧光细胞设置电压基线。设置 CD4-A647 和 CFSE 的电压,使每个荧光信号低于 1,000(图1C)。使用单色控制 CFSE (图 1D) 和 CD4-A647 (图 1E) 使用未染色电池的电压来确认每种颜色的正荧光信号 (+10,000)。
4. CFSE 和 PI 有一些光谱重叠;调整补偿以从CFSE荧光中减去PI荧光,直到仅CFSE样品在PI通道中产生信号。
   注:这些门适用于本文分析的所有样品。

5. 计算细胞分裂指数,以枚举抗原特异性CD4⁺ T细胞增殖

注:细胞分裂指数 (CDI) 是指每 5,000 个未分割细胞 (CD4⁺/ CFSE^明亮) 的分裂细胞数 (CD4⁺/CFSE^暗数)。当未分割 CD4⁺细胞的数量不完全为 5,000 时,将更正分割的细胞数以表示每 5,000 个未分割细胞的分裂细胞数。例如,使用破伤风类毒素特异性增殖(图2D),有4,930个未分割细胞(CFSE明亮)和3,268个分裂细胞(CFSE^暗);因此,被修正的分裂细胞数为(5,000/4,930) x 3,268 = 3,304.3。

1. 计算CDI(表1),方法是将抗原刺激组中的分裂细胞数/5,000个未分割细胞数除以未培养的未抗原细胞的平均分裂细胞数(每5,000个未分割细胞)。

结果

用破伤风类毒素蛋白对人PBMC进行体外刺激:在破伤风类毒素存在的情况下,PBMC被染色,并在破伤风类毒素下被刺激7天。几乎所有的捐赠者都表现出强烈的T细胞对破伤风类毒素的反应,因为他们已经接种了疫苗,这使得破伤风类毒素是一种有用的阳性控制抗原。图2在三联中显示,CD4⁺ T细胞从未刺激的PBMC中增殖最小(±12 CFSE^暗细胞;

讨论

基于CFSE的增殖是检测和枚举抗原特异性人类CD4+T细胞的简单而可靠的方法。此前已经证明,使用CFSE的最佳浓度对于最佳^结果4至关重要。过多的CFSE会废除增殖,而太少不允许分离和未分割的细胞被区分。相比之下,相对较高的CFSE浓度(5.0μM)用于标记纯化的鼠T细胞3。由于批次之间的变异性,建议对每批进行定位,以确定最佳浓度。我们使用当前批次的浓度(10 nM)...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-human CD4-AlexaFluor647	Biolegend	317422	RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	ThermoFisher	C1157
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	71-7167-00
Glutamax (1x)	Gibco	35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1	Sino Biological	40010-V07E
Non-essential amino acids (1x)	Gibco	11140
Penicillin/Streptomycin (1x)	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Pooled human serum	Australian Red Cross	N/A
Proinsulin C-peptide PI33-63	Purar Chemicals	N/A	Custom made synthetic peptide
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Tetanus Toxoid protein	Statens Serum Intitut	N/A