Количественная оценка пролиферации антигена человека конкретных CD4и Т-клеток с использованием Carboxyfluorescein Succinimidyl Эфир

Резюме

Представлен протокол для измерения размножающихся CD4^и Т-клеток в ответ на антигенные белки или пептиды с использованием разбавления красителей. Этот ассси особенно чувствителен к редким антиген-специфическим Т-клеткам и может быть модифицирован для облегчения клонирования антиген-специфических клеток.

Аннотация

Описанный является простой, in vitro, на основе разбавления красителей метод для измерения антиген-специфических CD4^и Т-клеток пролиферации в периферических клеток крови человека (PBMCs). Развитие стабильных, нетоксических, флуоресцентных красителей, таких как carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) позволяет отличать редкие, антиген-специфические Т-клетки от прохожих путем увлажнения флуоресцентного окрашивания, как обнаруживается цитометрией. Этот метод имеет следующие преимущества по сравнению с альтернативными подходами: i) он очень чувствителен к низкочастотным Т-клеткам, (ii) не требуется никаких знаний об антигене или эпитопе, (iii) фенотип ответных клеток может быть проанализирован, и (iv) жизнеспособный, отвечая клетки могут быть отсортированы и использованы для дальнейшего анализа, такие как клонирование Т-клеток.

Введение

Способность обнаруживать и изучать антиген-специфические Т-клетки имеет важное значение в исследованиях клеточного иммунитета. Тем не менее, это особенно сложно для аутоантигена конкретных CD4^и Т-клеток ответов, которые являются очень слабыми и трудно обнаружить. Распространенным методом, используемым для обнаружения пролиферации антигена специфического лимфоцита, является тимидин, который представляет собой радиомаркированный нуклеотид, включенный в ДНК размножающихся клеток. Несмотря на то, что анализ «3H» может обнаружить синтез ДНК, этот метод является косвенным мерилом деления клеток, потому что синтез ДНК может инициировать независимо от митоза (т.е. во время дублирования генов и апоптоза¹). Этот вопрос усугубляется тем фактом, что антиген-специфическое пролиферацияклеток может привести к значительному апоптозу 2, что приводит к потенциальной переоценке антиген-специфического распространения. Кроме того, метод «3H» -тимидина не обеспечивает фенотипическую информацию для распространения лимфоцитов, таких как CD4^или CD8^- распространение линии в ПБМК, стимулируемых антигенными пептидами.

В 2003 году мы опубликовали первый рассеивание разбавления красителя с использованием CFSE, называется CFSE основе пролиферации асссы^3,4. CFSE является флуоресцентным красителем, который связывается с внутриклеточными белками, образуя ковалентную связь с внутриклеточными остатками лизина. Так как белки с маркировкой CFSE делятся поровну между дочерными клетками³, клетки, которые разделились, можно отличить от неразделенных клеток по цитометрии потока, что также позволяет количественное фенотипирование популяций лимфоцитов. Действительно, количество делений клетки претерпела со времени CFSE-окрашивания может быть измерена в некоторой степени⁵. В последнее время, многие подобные красители, такие как CellTrace фиолетовый краситель пролиферации (VPD) и CytoTrack краситель были разработаны, которые работают аналогичным образом⁶. Этот протокол фокусируется на CFSE, но принципы в равной степени применимы к другим связанным красителей.

Тетрамер пептида-MHC является широко используемым методом для обнаружения и клонирования антигена конкретных CD8^и Т-клеток. Это устоявшийсяметод 7,^8,9,10; однако, тетрамер основе клонирования требует существующих знаний о эпитоп / MHC ограничения и каждый эпитоп требует своего собственного тетрамера¹¹, который ограничивает область открытия и клонирования новых эпитопных конкретных Т-клеток. Пролиферация на основе CFSE может быть использована с пептидами, белками или клеточными лисатами. Описанный в настоящем году протокол является простым и надежным, а ответные CD4^и Т-клетки могут быть отсортированы для использования в нижепотечений функциональных и биохимических характеристик анализов^12,13.

протокол

Все испытуемые дали информированное согласие до сбора периферической крови. Этическое одобрение для экспериментов с использованием PBMC было дано Хосптиал Сент-Винсента (HREC-A 135/08, и HREC-A 161/15).

1. Подготовка реагента

1. Т-клеточные носители
   1. Приготовьте rp-5 media для культивирования PBMC, который состоит из RPMI 1640, 1x несущественных аминокислот, L-аланил-L-глютамин дипептид (2 мМ), пенициллин (100 U/mL)/стрептомицин (0,1 мг/мл), и 5% объединившейся человеческой сыворотки (PHS).
2. Акционерные решения CFSE
   1. Подготовьте основной запас, растворив 25 мг CFSE в 9 мл DMSO для достижения окончательного решения запасов с концентрацией 5 мМ.
   2. Подготовьте рабочий запас, разбавив основной запас в PBS для достижения рабочей концентрации в 10 км.

2. Подготовка ПБМК человека из цельной крови

1. Есть, как правило, между 0,5-1,5 х 10⁶ PBMCs / мл человеческой периферической крови. Таким образом, количество необходимой крови зависит от желаемого количества ПБМК. Разбавить человеческую периферийную кровь PBS по крайней мере 1:2. Отделите PBMCs путем добавлять 15 ml среды градиента плотности к пробке 50 mL, тогда накладываем 35 ml разбавленной цельной крови.
2. Центрифуга при 850 х г в течение 15 мин без замедления при комнатной температуре (RT). Это приведет к трем ясным слоям: нижний слой, содержащий гранулы красных кровяных клеток, средний слой градиентной среды плотности с белыми кровяными клетками, выстилающими его верхний интерфейс, и верхний плазменный слой^14.
3. Удалите около 20 мл верхнего слоя плазмы. Соберите слой белых кровяных телец, стараясь избежать красных кровяных клеток. Вымойте 3x с PBS и рассчитывать жизнеспособных клеток с помощью trypan синий исключение на гемоцитометр. Разбавить до 1 х 10⁶ PBMCs/mL в PBS.
4. Не-CFSE окрашенные клетки
   1. Эти клетки используются в качестве компенсационного контроля для цитометрии потока, состоящей из неокрашенных и CD4^- одноцветных клеток. Добавьте 300 л каждого контрольного образца подвески PBMC к трубке 10 мл, сверху с PBS и центрифугу при 550 х г в течение 5 мин на РТ.
   2. Resuspend 1 х 10⁶ ячеек/мл в носителе RP-5. Инкубировать эти немаркированные клетки в течение 7 дней в инкубаторе CO/5% co₂ с клетками с маркировкой CFSE (шаг 2.6.1).
5. Окрашенные CFSE клетки
   1. Перенесите клетки со ступени 2.3 в трубку 50 мл. Добавьте 1,0 л рабочего запаса CFSE (10 мкм) на 1 мл клеточной подвески на бок трубки. Быстро перемешайте, инвертируя трубку несколько раз. Окончательная концентрация CFSE составляет 10 нм.
   2. Инкубировать в течение 5 мин в инкубаторе CO 2 37 градусов по Цельсию/5%. Чтобы остановить окрашивание, добавьте 5 мл носителей RP-5, гранулы клетки центрифугирование м 5 мин при 550 х г. Приостановить PBMCs на 1 х 10⁶/мл в RP-5 средств массовой информации.
   3. Добавьте 1,0 мл клеточной подвески в трубку 10 мл. Используйте одну трубку для каждого антигена для тестирования.
6. Антигенная стимуляция ПБМК и клеточной культуры человека
   1. Культура человека CFSE помечены PBMCs с антигенами в RP-5 средств массовой информации в течение 7 дней в 37 КС / 5% CO₂ инкубатора. Культура 1 х 10⁵ клеток/хорошо (100 л) в пластине 96 скважин с 100 Л/кололи носителей RP-5, содержащими разбавленный антиген.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые антигены, включая рабочие концентрации, обобщены в таблице 1.

3. Anti-CD4 Окрашивание для анализа FACS

1. Пипетка 200 л культивированных клеток в трубки FACS, мыть клетки 1x в 1,0 мл PBS, содержащий 0,1% FCS, и центрифуги в течение 5 мин при 550 х г.
2. Пятно с анти-человеческой CD4 Alexa Fluor 647 (0,25 мг/мл) в 100 Л Л PBS/0,1% FCS. Держите в стороне образец клеток с маркировкой CFSE, неокрашенных любыми другими флюорофорами, чтобы использовать для установки компенсации FACS CFSE. Инкубировать клетки при 4 градусах по Цельсию, защищенные от света в течение 20 мин.
3. Вымойте клетки, добавив 1 мл PBS/0,1% FCS, центрифугу при 550 х г в течение 5 мин на РТ, и повторно в 100 л PBS/0,1% FCS. Непосредственно перед анализом FACS, добавить 1 литр пропидия йодида (PI, 0,1 мг/мл) для всех труб, чтобы мертвые клетки должны быть исключены поток цитометрии.

4. Поток Цитометрическая конфигурация и Стратегия Gating

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показана конфигурация FACS, включая контроль над компенсацией и стратегию gating.

1. Ворота вперед рассеяния (FSC) против стороны рассеяния (SSC) (Рисунок 1A) населения включить все лимфоциты.
2. Ворота FSC против PI(Рисунок 1B) населения на PI отрицательных ячеек, чтобы исключить апоптотические клетки.
3. Используйте неокрашенные клетки, чтобы установить базовый уклад напряжения для нелюфлуесцентных клеток. Установите напряжение для CD4-A647 и CFSE так, чтобы сигнал флуоресценции был ниже 1000 для каждого(рисунок 1C). Используйте одноцветные элементы управления CFSE(рисунок 1D)и CD4-A647 (рисунок1E)для подтверждения положительных флуоресцентных сигналов (10 000 евро) для каждого цвета, используя напряжение, установленное с неокрашенными клетками.
4. CFSE и PI имеют некоторые спектральные перекрытия; настроить компенсацию для вычета ФЛуоресции PI из ФЛуоресции CFSE до тех пор, пока только образец CFSE не даст сигнала в канале PI.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти ворота были применены ко всем образцам, проанализированным в данном документе.

5. Расчет индекса деления клеток для перечисления антигена конкретных CD4^и T-сотовой пролиферации

ПРИМЕЧАНИЕ: Индекс деления ячеек (CDI) относится к числу разделенных ячеек (CD4^/CFSE^dim)на 5000 неразделенных ячеек (CD4^/CFSE^яркий). Когда количество неразделенных клеток CD4^и составляет не совсем 5000, количество разделенных ячеек корректируется, чтобы выразить количество разделенных ячеек на 5000 неразделенных ячеек. Например, с использованием столбняка токсоидного-специфического пролиферации(рисунок 2D),было 4930 неразделенных клеток (CFSE^яркий) и 3268 разделенных клеток (CFSE^{тусклый);} Таким образом, исправленное число разделенных ячеек составляет (5000/4,930) х 3268 и 3 304,3.

1. Рассчитайте CDI (Таблица 1) путем деления числа разделенных клеток / 5000 неразделенных клеток из антиген-стимулировали группу на среднее количество разделенных клеток (на 5000 неразделенных клеток) из клеток, культивируемых без антигена (Таблица 2).

Результаты

В пробирке стимуляция ПБМК человека с столбняком токсоидного белка: ПБМК были окрашены CFSE и стимулировали в течение 7 дней в присутствии столбняка токсоидов. Почти все доноры показали сильную реакцию Т-клеток на столбняк аксоид, потому что они были вакцинированы, что д...

Обсуждение

Пролиферация на основе CFSE является простым и надежным методом для обнаружения и перечисления антиген-специфических человеческих CD4^и Т-клеток. Ранее было продемонстрировано, что использование оптимальной концентрации CFSE имеет важное значение для оптимальных результатов

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-human CD4-AlexaFluor647	Biolegend	317422	RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	ThermoFisher	C1157
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	71-7167-00
Glutamax (1x)	Gibco	35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1	Sino Biological	40010-V07E
Non-essential amino acids (1x)	Gibco	11140
Penicillin/Streptomycin (1x)	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Pooled human serum	Australian Red Cross	N/A
Proinsulin C-peptide PI33-63	Purar Chemicals	N/A	Custom made synthetic peptide
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Tetanus Toxoid protein	Statens Serum Intitut	N/A