Quantificação de células T antígeno-específicas humanas proliferating de CD4+ usando o éster do Succinimidyl do carboxyfluorescein

Resumo

É apresentado aqui um protocolo para medir proliferating pilhas de T CD4⁺ em resposta às proteínas antigénicas ou aos peptídeos usando a diluição da tintura. Este ensaio é particular sensível às pilhas de T antígeno-específicas raras e pode ser modificada para facilitar a clonagem de pilhas antígeno-específicas.

Resumo

Descrito é um método simples, in vitro, baseado na diluição da tintura para medir a proliferação antígeno-específica da pilha de T CD4⁺ em pilhas mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs). O desenvolvimento de tinturas estáveis, não-tóxicas, fluorescentes tais como o éster do grufo do usando (CFSE) permite que as pilhas de T raras, antígeno-específicas sejam distinguidas dos transeunte pela diminuição na mancha fluorescente, como detectado pelo fluxo cytometry. Este método tem as seguintes vantagens sobre abordagens alternativas: (i) é muito sensível a células T de baixa frequência, (II) nenhum conhecimento do antígeno ou epítopo é necessária, (III) o fenótipo das células que respondem pode ser analisado, e (IV) viável, respondendo células podem ser classificadas e usadas para análise posterior, como a clonagem de células T.

Introdução

A capacidade de detectar e estudar células T antígeno-específicas é importante em estudos de imunidade mediada por células. No entanto, isso é particularmente desafiador para as respostas de células T CD4⁺ específicas do autoantígeno, que são muito fracas e difíceis de detectar. Um método comum usado para a deteção da proliferação antígeno-específica do linfócito é [3H]-thymidine, que é um nucleotide radiolabeled incorporado no ADN de pilhas proliferating. Embora o ensaio de [3h]-thymidine possa detectar a síntese do ADN, este método é uma medida indireta da divisão da pilha, porque a síntese do ADN pode iniciar independentemente da mitose (isto é, durante a duplicação do gene e o apoptose¹). Esta edição é agravada pelo fato de que a proliferação antígeno-específica das pilhas pode conduzir ao apoptose considerável², conduzindo ao overestimato potencial da proliferação antígeno-específica. Além disso, o método de [3H]-timidina não fornece informações fenotípicas para linfócitos proliferantes, como a proliferação de linhagem CD4⁺ ou CD8⁺ em PBMCs estimulados com peptídeos antigênicos.

Em 2003, publicamos o primeiro ensaio de diluição de corante utilizando o CFSE, denominado ensaio de proliferação baseado em CFSE^3,4. O CFSE é um corante fluorescente que se liga de forma estável a proteínas intracelulares, formando uma ligação covalente aos resíduos de lisina intracelular. Desde que as proteínas CFSE-etiquetadas são divididas ingualmente entre as pilhas³da filha, as pilhas que dividiram podem ser distinguidas das pilhas undivididas pelo fluxo cytometry, que igualmente permite o fenotipagem quantitativo de populações do linfócito. Na verdade, o número de divisões que uma célula sofreu a partir do momento da coloração CFSE pode ser medido em algum grau⁵. Mais recentemente, muitas tinturas similares tais como a tintura violeta da proliferação de CellTrace (VPD) e a tintura de CytoTrack foram desenvolvidas, que trabalham em uma maneira similar⁶. Este protocolo centra-se no CFSE, mas os princípios aplicam-se ingualmente a outros corantes relacionados.

A coloração do tetrâmero de peptide-MHC é um método amplamente utilizado para detectar e clonar pilhas CD8⁺ T antígeno-específicas. Este é um método bem estabelecido^7,8,9,10; Entretanto, a clonagem tetrâmero-baseada exige o conhecimento existente da limitação de epítopo mapeado/MHC e cada epítopo exige seu próprio tetrâmero¹¹, que limita o espaço da descoberta e da clonagem de pilhas de T epítopo mapeado-específicas novas. A proliferação baseada em CFSE pode ser usada com peptídeos, proteínas ou lisados celulares. O protocolo aqui descrito é simples e robusto, e as células T CD4⁺ de resposta podem ser classificadas para uso em ensaios de caracterização funcional e bioquímica a jusante^12,13.

Protocolo

Todos os sujeitos deram consentimento informado antes da coleta de sangue periférico. A aprovação ética para experimentos usando PBMC foi dada por St. Vincent ' s hosptial (HREC-A 135/08, e HREC-A 161/15).

1. preparação do reagente

1. Meios humanos da pilha de T
   1. Prepare a mídia RP-5 para cultivar PBMC, que consiste em RPMI 1640, 1x aminoácidos não essenciais, dipeptídeo L-alanyl-L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U/mL)/estreptomicina (0,1 mg/mL) e 5% de soro humano agrupado (PHS).
2. Soluções de ações CFSE
   1. Prepare um estoque mestre dissolvendo 25 mgs de CFSE em ~ 9 mL de DMSO para conseguir uma solução de estoque final com uma concentração de 5 mM.
   2. Prepare um estoque de trabalho diluindo o estoque mestre em PBS para alcançar uma concentração de trabalho de 10 μM.

2. preparação de PBMCs humanos de sangue total

1. Existem geralmente entre 0,5 – 1,5 x 10⁶ PBMCs/ml de sangue periférico humano. Portanto, a quantidade de sangue necessária depende do número desejado de PBMCs. diluir o sangue periférico humano com PBS, pelo menos, 1:2. Separe os PBMCs adicionando 15 mL de meio de gradiente de densidade a um tubo de 50 mL e, em seguida, sobreponha 35 mL de sangue total diluído.
2. Centrifugador a 850 x g durante 15 min sem desaceleração à temperatura ambiente (RT). Isso resultará em três camadas claras: a camada inferior que contém o pellet de células vermelhas do sangue, camada média de meio de gradiente de densidade com células brancas do sangue que revestem sua interface superior e camada de plasma superior¹⁴.
3. Remova aproximadamente 20 mL da camada de plasma superior. Colete a camada de glóbulos brancos, sendo cuidadoso para evitar o pellet de glóbulos vermelhos. Lave 3x com PBS e contagem de células viáveis usando Tripan exclusão azul em um Hemocytometer. Diluir para 1 x 10⁶ PBMCs/ml em PBS.
4. Células não-CFSE-manchadas
   1. Essas células são usadas como controles de compensação para citometria de fluxo, compreendendo células não manchadas e CD4⁺ de coloração única. Adicionar 300 μL de cada amostra de controlo PBMC suspensão a um tubo de 10 mL, superior com PBS, e centrifugar a 550 x g durante 5 min em RT.
   2. Ressuscite 1 x 10⁶ células/ml na mídia RP-5. Incubar estas pilhas sem rótulo por 7 dias em uma incubadora de 37 ° c/5% co₂ com as pilhas CFSE-etiquetadas (etapa 2.6.1).
5. Células coradas por CFSE
   1. Transfira as células da etapa 2,3 para um tubo de 50 mL. Adicionar 1,0 μL de solução de trabalho CFSE (10 μM) por 1 mL de suspensão celular ao lado do tubo. Misture rapidamente invertendo o tubo várias vezes. A concentração final de CFSE é de 10 nM.
   2. Incubar por 5 min em uma incubadora de 37 ° c/5% CO₂ . Para parar a coloração, adicionar 5 mL de RP-5 mídia, pellet as células por centrifugação por 5 min em 550 x g. Ressuscite o PBMCs em 1 x 10⁶/ml na mídia RP-5.
   3. Adicionar 1,0 mL de suspensão celular a um tubo de 10 mL. Use um tubo para cada antígeno a ser testado.
6. Estimulação antigênica de PBMCs humanos e cultura celular
   1. Cultura de CFSE humano-rotulado PBMCs com antígenos em RP-5 mídia por 7 dias em um 37 ° c/5% CO₂ incubadora. Cultura 1 x 10⁵ células/poço (100 μL) em uma placa de poço 96 com 100 μl/poço de meios RP-5 contendo antígeno diluído.
      Nota: os antígenos utilizados, incluindo as concentrações de trabalho, estão resumidos na tabela 1.

3. anti-CD4 coloração para FACS análise

1. Pipetam 200 μL das células cultivadas em tubos FACS, células de lavagem 1X em 1,0 mL de PBS contendo 0,1% de FCS e centrifugador por 5 min a 550 x g.
2. Mancha com anti-humano CD4 Alexa fluor 647 (0,25 mg/mL) em 100 μL de PBS/0,1% FCS. Mantenha de lado uma amostra de células rotuladas por CFSE, não manchada com outros fluoróforos, para usar para definir a compensação de CFSE FACS. Incubar as células a 4 ° c protegidas da luz durante 20 min.
3. Lave as células adicionando 1 mL de PBS/0,1% FCS, centrifugue a 550 x g durante 5 min em RT e ressuscitem em 100 ΜL de PBS/0,1% FCS. Imediatamente antes da análise de FACS, adicione 1 μL do iodeto do propidium (PI, 0,1 mg/mL) a todos os tubos para permitir que as pilhas inoperantes sejam excluídas pelo fluxo cytometry.

4. configuração Citométrica de fluxo e estratégia de gating

Nota: A Figura 1 mostra a configuração do FACS, incluindo controles de remuneração e estratégia de gating.

1. Porta o scatter dianteiro (FSC) vs. dispersão lateral (SSC) (Figura 1a) população para incluir todos os linfócitos.
2. Porta a população de FSC vs. PI (Figura 1b) em células PI negativas para excluir células apoptóticas.
3. Use células não manchadas para definir uma linha de base de tensão para células não-fluorescentes. Ajuste as tensões para CD4-A647 e CFSE de modo que o sinal da fluorescência esteja abaixo de 1.000 para cada um (Figura 1C). Use os controles de cor única CFSE (Figura 1D) e CD4-A647 (Figura 1e) para confirmar sinais fluorescentes positivos (~ 10.000) para cada cor, usando as tensões ajustadas com células não manchadas.
4. CFSE e PI têm alguma sobreposição espectral; ajuste a compensação para subtrair a fluoresence do PI da fluoresence de CFSE até que a amostra do CFSE-somente não rende um sinal no canal PI.
   Nota: Estas comportas foram aplicadas a todas as amostras analisadas neste documento.

5. cálculo do índice de divisão celular para enumerar a proliferação de células T CD4⁺ específica do antígeno

Nota: O índice de divisão celular (CDI) refere-se ao número de células divididas (CD4⁺/CFSE^dim) por 5.000 células não divididas (CD4⁺/CFSE^Bright). Quando o número de células CD4⁺ não divididas não é exatamente 5.000, o número de células divididas é corrigido para expressar o número de células divididas por 5.000 células não divididas. Por exemplo, usando a proliferação específica do toxóide tetânico (Figura 2D), havia 4.930 células não divididas (CFSE^bright) e 3.268 células divididas (CFSE^Dim); Portanto, o número corrigido de células divididas é (5000/4930) x 3.268 = 3304,3.

1. Calcule o CDI (tabela 1) dividindo o número de células divididas/5000 células não divididas do grupo estimulado pelo antígeno pelo número médio de células divididas (por 5.000 células não divididas) das células cultivadas sem antígeno (tabela 2).

Resultados

Estimulação in vitro de PBMCs humanos com proteína toxóide do tétano: PBMCs foram corados com CFSE e estimulados por 7 dias na presença de toxóide tetânico. Quase todos os doadores mostraram uma resposta forte da pilha de T ao toxóide do tétano porque tinham sido vacinados, que faz o toxóide do tétano um antígeno positivo útil do controle. A Figura 2 demonstra, em triplicado, que a proliferação CFSE de células T CD4⁺ de PBMCs não ...

Discussão

A proliferação CFSE-baseada é um método simples e robusto para detectar e enumerar pilhas humanas antígeno-específicas de CD4⁺ T. Tem sido demonstrado previamente que a utilização da concentração óptima de CFSE é essencial para resultados óptimos⁴. Demasiada proliferação dos AB roga de CFSE, visto que demasiado pouco não permite que as pilhas divididas e undivide sejam distinguidas. Por outro lado, concentrações relativamente elevadas (5,0 μM) de CFSE são usadas para...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-human CD4-AlexaFluor647	Biolegend	317422	RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	ThermoFisher	C1157
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	71-7167-00
Glutamax (1x)	Gibco	35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1	Sino Biological	40010-V07E
Non-essential amino acids (1x)	Gibco	11140
Penicillin/Streptomycin (1x)	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Pooled human serum	Australian Red Cross	N/A
Proinsulin C-peptide PI33-63	Purar Chemicals	N/A	Custom made synthetic peptide
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Tetanus Toxoid protein	Statens Serum Intitut	N/A