Quantifizierung von proliferierenden humanen Antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen mit Carboxyfluorescein Succinimidylester

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Messung von vermehrenden CD4⁺ T-Zellen als Reaktion auf antigene Proteine oder Peptide mittels Farbstoffverdünnung vorgestellt. Dieser Assay ist besonders empfindlich gegenüber seltenen antigenspezifischen T-Zellen und kann modifiziert werden, um das Klonen von antigenspezifischen Zellen zu erleichtern.

Zusammenfassung

Beschrieben wird eine einfache, in vitro, auf Farbstoffen basierende Methode zur Messung der antigenspezifischen CD4⁺ T-Zellproliferation in mononukleären menschlichen Blutzellen (PBMCs). Die Entwicklung stabiler, ungiftiger Fluoreszenzfarbstoffe wie Carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) ermöglicht es, seltene, antigenspezifische T-Zellen von Umstehenden durch Verminderung der fluoreszierenden Färbung zu unterscheiden, wie sie durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Diese Methode hat gegenüber alternativen Ansätzen folgende Vorteile: (i) Sie ist sehr empfindlich gegenüber niederfrequenten T-Zellen, (ii) es ist keine Kenntnis des Antigens oder Epitops erforderlich, (iii) der Phänotyp der reagierenden Zellen kann analysiert werden, und (iv) lebensfähig, Zellen können sortiert und für weitere Analysen verwendet werden, z. B. t Zellklonen.

Einleitung

Die Fähigkeit, antigenspezifische T-Zellen zu erkennen und zu untersuchen, ist in Studien zur zellvermittelten Immunität wichtig. Dies ist jedoch besonders anspruchsvoll für autoantigenspezifische CD4⁺ T-Zell-Antworten, die sehr schwach und schwer zu erkennen sind. Eine gängige Methode zum Nachweis der antigenspezifischen Lymphozytenproliferation ist [3H]-Thymidin, ein radioaktiv markiertes Nukleotid, das in die DNA von proliferierenden Zellen integriert ist. Obwohl der [3H]-Thymidin-Assay die DNA-Synthese erkennen kann, ist diese Methode ein indirektes Maß für die Zellteilung, da die DNA-Synthese unabhängig von Mitose initiieren kann (d. h. bei Genduplizierung und Apoptose¹). Dieses Problem wird durch die Tatsache verschlimmert, dass antigenspezifische Proliferation von Zellen zu einer erheblichen Apoptose führen kann², was zu einer potenziellen Überschätzung der antigenspezifischen Proliferation führt. Darüber hinaus liefert die [3H]-Thymidin-Methode keine phänotypischen Informationen für vermehrende Lymphozyten, wie CD4⁺ oder CD8⁺ Lineage Proliferation in PBMCs, die mit antigenen Peptiden stimuliert werden.

Im Jahr 2003 veröffentlichten wir den ersten Farbstoffverdünnungstest mit CFSE, dem CFSE-basierten Proliferationstest^3,4. CFSE ist ein fluoreszierender Farbstoff, der stabil an intrazelluläre Proteine bindet, indem er eine kovalente Bindung an intrazelluläre Lysinrückstände bildet. Da CFSE-markierte Proteine gleichmäßig auf Tochterzellen³aufgeteilt sind, können Zellen, die sich geteilt haben, von ungeteilten Zellen durch Durchflusszytometrie unterschieden werden, was auch die quantitative Phänotypisierung von Lymphozytenpopulationen ermöglicht. Tatsächlich kann die Anzahl der Divisionen, die eine Zelle seit der Zeit der CFSE-Färbung durchgemacht hat, bis zu einem gewissen Grad^gemessenwerden 5 . In jüngerer Zeit wurden viele ähnliche Farbstoffe wie CellTrace Violet Proliferationsfarbstoff (VPD) und CytoTrack Farbstoff entwickelt, die in ähnlicher Weise arbeiten⁶. Dieses Protokoll konzentriert sich auf CFSE, aber die Prinzipien gelten gleichermaßen für andere verwandte Farbstoffe.

Peptid-MHC-Tetramerfärbung ist eine weit verbreitete Methode zum Erkennen und Klonen von antigenspezifischen CD8⁺ T-Zellen. Dies ist eine etablierte Methode^7,8,9,10; Das Klonen auf Tetramerbasis erfordert jedoch vorhandene Kenntnisse der Epitop-/MHC-Beschränkung und jedes Epitop erfordert sein eigenes Tetramer¹¹, das den Umfang der Entdeckung und des Klonens neuartiger Epitop-spezifischer T-Zellen begrenzt. Die CFSE-basierte Proliferation kann mit Peptiden, Proteinen oder Zelllysaten verwendet werden. Das hier beschriebene Protokoll ist einfach und robust, und die antwortenden CD4⁺ T-Zellen können für den Einsatz in nachgelagerten funktionellen und biochemischen Charakterisierungstests^12,13sortiert werden.

Protokoll

Alle Probanden gaben vor der Entnahme von peripherem Blut eine informierte Einwilligung. Die ethische Zulassung für Experimente mit PBMC wurde von St. Vincent es Hosptial erteilt (HREC-A 135/08 und HREC-A 161/15).

1. Reagenz-Vorbereitung

1. HumanE T-Zell-Medien
   1. Bereiten Sie RP-5-Medien für die Kultivierung von PBMC vor, das aus RPMI 1640, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid (2 mM), Penicillin (100 U/mL)/Streptomycin (0,1 mg/ml) und 5% gepooltem humanem Serum (PHS) besteht.
2. CFSE-Aktienlösungen
   1. Bereiten Sie einen Stammbestand vor, indem Sie 25 mg CFSE in 9 ml DMSO auflösen, um eine endgültige Bestandslösung mit einer Konzentration von 5 mM zu erzielen.
   2. Bereiten Sie einen Arbeitsbestand vor, indem Sie den Stammbestand in PBS verdünnen, um eine Arbeitskonzentration von 10 M zu erreichen.

2. Vorbereitung menschlicher PBMCs aus Vollblut

1. Es gibt in der Regel zwischen 0,5–1,5 x 10⁶ PBMCs/ml des peripheren Blutes. Daher hängt die benötigte Blutmenge von der gewünschten Anzahl an PBMCs ab. Verdünnen Sie das periphere Blut des Menschen mit PBS mindestens 1:2. Trennen Sie die PBMCs, indem Sie 15 ml Dichtegradientenmedium zu einem 50 ml-Rohr hinzufügen und dann 35 ml verdünntes Vollblut überlagern.
2. Zentrifuge bei 850 x g für 15 min ohne Verzögerung bei Raumtemperatur (RT). Dies führt zu drei klaren Schichten: die untere Schicht, die das rote Blutkörperchen pellet enthält, die mittlere Schicht des Dichtegradientenmediums mit weißen Blutkörperchen, die ihre obere Oberfläche aussäumen, und die obere Plasmaschicht¹⁴.
3. Entfernen Sie ca. 20 ml der oberen Plasmaschicht. Sammeln Sie die weiße Blutkörperchen Schicht, vorsichtig, um die rote Blutkörperchen Pellet zu vermeiden. Waschen Sie 3x mit PBS und zählen Sie lebensfähige Zellen mit Trypanblau-Ausschluss auf einem Hämozytometer. In PBS auf 1 x 10⁶ PBMCs/ml verdünnen.
4. Nicht-CFSE-gefärbte Zellen
   1. Diese Zellen werden als Kompensationssteuerung für die Durchflusszytometrie verwendet, die aus ungefärbten und CD4⁺ eingefärbten Zellen besteht. Fügen Sie 300 l jeder Kontrollprobe PBMC Suspension zu einem 10 ml Rohr, oben mit PBS, und Zentrifuge bei 550 x g für 5 min bei RT.
   2. 1 x 10⁶ Zellen/ml in RP-5-Medien aussetzen. Inkubieren Sie diese nicht beschrifteten Zellen 7 Tage lang in einem 37 °C/5% CO2-Inkubator mit den CFSE-markierten Zellen (Schritt 2.6.1).
5. CFSE-gefärbte Zellen
   1. Übertragen Sie die Zellen von Schritt 2,3 in ein 50 ml-Rohr. Fügen Sie 1,0 l CFSE-Arbeitsstofflösung (10 M) pro 1 ml Zellsuspension an der Seite des Rohres hinzu. Mischen Sie schnell, indem Sie das Rohr mehrmals invertieren. Die endgültige Konzentration von CFSE beträgt 10 nM.
   2. Inkubieren Sie für 5 min in einem 37 °C/5% CO2-Inkubator. Um die Färbung zu stoppen, fügen Sie 5 ml RP-5-Medien hinzu, pellet die Zellen durch Zentrifugieren für 5 min bei 550 x g. Setzen Sie die PBMCs in RP-5-Medien bei 1 x 10⁶/ml aus.
   3. 1,0 ml Zellsuspension zu einem 10 ml Rohr geben. Verwenden Sie ein Rohr für jedes zu prüfende Antigen.
6. Antigene Stimulation menschlicher PBMCs und Zellkultur
   1. Kultur humane CFSE-markierte PBMCs mit Antigenen in RP-5-Medien für 7 Tage in einem 37 °C/5% CO2-Inkubator. Kultur 1 x 10⁵ Zellen/Well (100 l) in einer 96-Well-Platte mit 100 l/Well von RP-5-Medien, die verdünntes Antigen enthalten.
      ANMERKUNG: Die verwendeten Antigene, einschließlich der Arbeitskonzentrationen, sind in Tabelle 1zusammengefasst.

3. Anti-CD4 Färbung für FACS-Analyse

1. Pipette 200 l der kultivierten Zellen in FACS-Röhren, Waschzellen 1x in 1,0 ml PBS mit 0,1% FCS und Zentrifuge für 5 min bei 550 x g.
2. Stain mit antihumaner CD4 Alexa Fluor 647 (0,25 mg/ml) in 100 l PBS/0,1% FCS. Halten Sie eine Probe von CFSE-markierten Zellen beiseite, die mit anderen Fluorophoren nicht befleckt sind, um die FACS CFSE-Kompensation festzulegen. Inkubieren Sie die Zellen bei 4 °C 20 min vor Licht geschützt.
3. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml PBS/0,1% FCS, Zentrifuge bei 550 x g für 5 min bei RT hinzufügen, und in 100 l PBS/0,1% FCS wieder aussetzen. Unmittelbar vor der FACS-Analyse fügen Sie allen Röhren 1 L Propidiumjodid (PI, 0,1 mg/ml) hinzu, damit die abgestorbenen Zellen durch Durchflusszytometrie ausgeschlossen werden können.

4. Flow Cytometric Configuration and Gating Strategy

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die FACS-Konfiguration einschließlich Kompensationskontrollen und Gating-Strategie.

1. Gate der Vorwärtsstreuung (FSC) vs. Seitenstreuung (SSC) (Abbildung 1A) Population, um alle Lymphozyten einzubeziehen.
2. Gate die FSC vs. PI (Abbildung 1B) Population auf PI negativen Zellen, um apoptotische Zellen auszuschließen.
3. Verwenden Sie ungefärbte Zellen, um eine Spannungsbasislinie für nicht fluoreszierende Zellen festzulegen. Stellen Sie die Spannungen für CD4-A647 und CFSE so ein, dass das Fluoreszenzsignal für jeden Wert unter 1.000 liegt (Abbildung 1C). Verwenden Sie die einzelnen Farbsteuerungen CFSE (Abbildung 1D) und CD4-A647 (Abbildung 1E), um positive Fluoreszenzsignale (10.000 USD) für jede Farbe zu bestätigen, wobei die Mitspannungen verwendet werden, die mit ungefärbten Zellen eingestellt sind.
4. CFSE und PI haben einige spektrale Überlappung; die Kompensation anpassen, um die PI-Fluoresenz von der CFSE-Fluoresenz zu subtrahieren, bis die reine CFSE-Probe kein Signal im PI-Kanal liefert.
   HINWEIS: Diese Tore wurden auf alle hier analysierten Proben angewendet.

5. Berechnung des Zellteilungsindex zur Aufzählung antigenspezifischer CD4⁺ T-Zellproliferation

HINWEIS: Der Zellteilungsindex (CDI) bezieht sich auf die Anzahl der geteilten Zellen (CD4⁺/CFSE^dim) pro 5.000 ungeteilte Zellen (CD4⁺/ CFSE^hell). Wenn die Anzahl der ungeteilten CD4⁺ Zellen nicht genau 5.000 beträgt, wird die Anzahl der geteilten Zellen korrigiert, um die Anzahl der geteilten Zellen pro 5.000 ungeteilten Zellen auszudrücken. Zum Beispiel gab es mit der Tetanus-Toxoid-spezifischen Proliferation (Abbildung 2D), 4.930 ungeteilte Zellen (CFSE^hell)und 3.268 geteilte Zellen (CFSE^dim); Daher ist die korrigierte Anzahl der geteilten Zellen (5.000/4.930) x 3.268 = 3.304,3.

1. Berechnen Sie die CDI (Tabelle 1) durch Division der Anzahl der geteilten Zellen/5.000 ungeteilten Zellen aus der antigenstimulierten Gruppe durch die mittlere Anzahl der geteilten Zellen (pro 5.000 ungeteilte Zellen) aus den Zellen, die ohne Antigen kultiviert wurden (Tabelle 2).

Ergebnisse

In-vitro-Stimulation menschlicher PBMCs mit Tetanus-Toxoid-Protein: PBMCs wurden mit CFSE gefärbt und 7 Tage lang in Gegenwart von Tetanus-Toxoid stimuliert. Fast alle Spender zeigten eine starke T-Zell-Reaktion auf Tetanus-Toxoid, weil sie geimpft worden waren, was Tetanus-Toxoid zu einem nützlichen Positiv-Kontroll-Antigen macht. Abbildung 2 zeigt in dreifacher Ausfertigung, dass die CFSE-Proliferation von CD4⁺ T-Zellen aus nicht stimulierten P...

Diskussion

CFSE-basierte Proliferation ist eine einfache und robuste Methode zum Erkennen und Aufzählen von antigenspezifischen menschlichen CD4⁺ T-Zellen. Es wurde bereits gezeigt, dass die optimale Konzentration von CFSE für optimale Ergebnisse unerlässlich ist⁴. Zu viel CFSE hebt die Proliferation auf, während zu wenig nicht zulässt, dass geteilte und ungeteilte Zellen unterschieden werden. Im Gegensatz dazu werden relativ hohe CfSE-Konzentrationen (5,0 m) zur Kennzeichnung gereinigter mur...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-human CD4-AlexaFluor647	Biolegend	317422	RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	ThermoFisher	C1157
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	71-7167-00
Glutamax (1x)	Gibco	35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1	Sino Biological	40010-V07E
Non-essential amino acids (1x)	Gibco	11140
Penicillin/Streptomycin (1x)	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Pooled human serum	Australian Red Cross	N/A
Proinsulin C-peptide PI33-63	Purar Chemicals	N/A	Custom made synthetic peptide
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Tetanus Toxoid protein	Statens Serum Intitut	N/A