Quantificazione delle cellule CD4 specifiche dell'antigene umano che proliferano utilizzando Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Riepilogo

Presentato qui è un protocollo per la misurazione delle cellule CD4 - T proliferanti in risposta a proteine antigeniche o peptidi utilizzando la diluizione del tinri. Questo analisi è particolarmente sensibile alle rare cellule T specifiche dell'antigene e può essere modificato per facilitare la clonazione delle cellule specifiche dell'antigene.

Abstract

Descritto è un metodo semplice, in vitro, basato sulla diluizione dei coloranti per misurare la proliferazione delle cellule T specifiche dell'antigene nelle cellule mononucleari del sangue periferico umano (PMC). Lo sviluppo di coloranti stabili, non tossici e fluorescenti come carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) consente di distinguere le cellule T rare e specifiche dell'antigene dai bystander per diminuzione della colorazione fluorescente, come rilevato dalla citometria di flusso. Questo metodo presenta i seguenti vantaggi rispetto agli approcci alternativi: (i) è molto sensibile alle cellule T a bassa frequenza, (ii) non è richiesta alcuna conoscenza dell'antigene o dell'epitopo, (iii) il fenotipo delle cellule rispondenti può essere analizzato e (iv) vitale, rispondente, rispondendo le cellule possono essere ordinate e utilizzate per ulteriori analisi, come la clonazione delle cellule T.

Introduzione

La capacità di rilevare e studiare le cellule T specifiche dell'antigene è importante negli studi sull'immunità mediata dalle cellule. Tuttavia, in questo modo è particolarmente difficile per il CD4 specifico di autoantigen^- risposte delle cellule T, che sono molto deboli e difficili da rilevare. Un metodo comune utilizzato per la rilevazione della proliferazione dei linfociti specifici dell'antigene è [3H]-thymidine, che è un nucleotide radioetichettato incorporato nel DNA delle cellule che proliferano. Anche se l'analisi [3H]-timinano può rilevare la sintesi del DNA, questo metodo è una misura indiretta della divisione cellulare, perché la sintesi del DNA può avviare indipendentemente dalla mitosi (cioè durante la duplicazione genica e l'apoptosi¹). Questo problema è aggravato dal fatto che la proliferazione delle cellule specifichedell'antigene può provocare una notevole apoptosi 2, portando a una potenziale sopravalutazione della proliferazione specifica dell'antigene. Inoltre, il metodo [3H]-thymidine non fornisce informazioni fenotipiche per la proliferazione dei linfociti, come cd4^o CD8^- proliferazione del lignaggio nei PBMCC stimolati con peptidi antigenici.

Nel 2003, abbiamo pubblicato il primo saggio di diluizione del colorone utilizzando CFSE, chiamato il saggio di proliferazione basato su CFSE^3,4. CFSE è un tinrito fluorescente che si lega stabilmente alle proteine intracellulari formando un legame covalente ai residui di lisina intracellulare. Poiché le proteine con etichetta CFSE sono divise equamente tra le cellule figlie³, le cellule che si sono divise possono essere distinte dalle cellule indivise per citometria di flusso, il che consente anche la fenotipizzazione quantitativa delle popolazioni di linfociti. Infatti, il numero di divisioni che una cellula ha subito dal momento della colorazione CFSE può essere misurato in una certa misura⁵. Più recentemente, sono stati sviluppati molti coloranti simili come cellTrace Violet proliferation colorante (VPD) e CytoTrack colorante, che funzionano in modo simile⁶. Questo protocollo si concentra su CFSE, ma i principi si applicano ugualmente ad altri coloranti correlati.

La colorazione del tetramer Peptide-MHC è un metodo ampiamente utilizzato per rilevare e clonare cellule CD8^- T specifiche dell'antigene. Questo è un metodo ben consolidato^7,8,9,10; tuttavia, la clonazione basata su tetramer richiede una conoscenza esistente della restrizione epitope/MHC e ogni epitopo richiede un proprio tetramero¹¹, che limita l'ambito di scoperta e clonazione di nuove cellule T specifiche dell'epitopo. La proliferazione basata su CFSE può essere utilizzata con peptidi, proteine o lismi cellulari. Il protocollo qui descritto è semplice e robusto, e il rispondente CD4^- t cellule possono essere ordinati per l'uso in saggi di caratterizzazione funzionale e biochimica a valle^12,13.

Protocollo

Tutti i soggetti hanno dato il consenso informato prima della raccolta del sangue periferico. L'approvazione etica per gli esperimenti con PBMC è stata data da St. Vincent's Hosptial (HREC-A 135/08 e HREC-A 161/15).

1. Preparazione del reagente

1. Supporti di cellule T umane
   1. Preparare i supporti RP-5 per la coltura PBMC, che consiste di RPMI 1640, 1x aminoacidi non essenziali, L-alanyl-L-glutamine dipeptide (2 mM), penicillina (100 U/mL)/streptomycin (0,1 mg/mL) e 5% di siero umano in pool (PHS).
2. Soluzioni azionarie CFSE
   1. Preparare uno stock master sciogliendo 25 mg di CFSE in 9 mL di DMSO per ottenere una soluzione di stock finale con una concentrazione di 5 mM.
   2. Preparare un'azione di lavoro diluindo lo stock principale in PBS per raggiungere una concentrazione di lavoro di 10 M.

2. Preparazione di PFC umani da tutto il sangue

1. Ci sono generalmente tra 0,5–1,5 x 10⁶ PBMC/mL di sangue periferico umano. Pertanto, la quantità di sangue necessaria dipende dal numero desiderato di PMC. Diluire il sangue periferico umano con PBS almeno 1:2. Separare i PBMC aggiungendo 15 mL di gradiente medio di densità a un tubo da 50 mL, quindi sovrapporre 35 mL di sangue intero diluito.
2. Centrifuga a 850 x g per 15 min senza decelerazione a temperatura ambiente (RT). Questo si tradurrà in tre strati chiari: lo strato inferiore contenente il pellet di globuli rossi, strato intermedio di grado di densità medio con globuli bianchi che riveste la sua interfaccia superiore, e superiore strato plasmatico¹⁴.
3. Rimuovere circa 20 mL dello strato superiore di plasma. Raccogliere lo strato di globuli bianchi, facendo attenzione a evitare il pellet di globuli rossi. Lavare 3x con PBS e contare cellule vitali utilizzando l'esclusione blu trypan su un emocitometro. Diluire a 1 x 10⁶ PBMC/mL in PBS.
4. Cellule non macchiate CFSE
   1. Queste cellule sono utilizzate come controlli di compensazione per la citometria di flusso, che comprende celle non colorate e CD4. Aggiungere 300 l di ogni sospensione PBMC del campione di controllo a un tubo da 10 mL, riempirti con PBS e centrifugare a 550 x g per 5 min a RT.
   2. Risospendere 1 x 10⁶ celle/mL nel supporto RP-5. Incubare queste cellule senza etichetta per 7 giorni in un incubatore di CO₂ a 37 gradi con le cellule con etichetta CFSE (passaggio 2.6.1).
5. Cellule colorate CFSE
   1. Trasferire le celle dal passaggio 2.3 in un tubo da 50 mL. Aggiungete a lato del tubo 1,0 l di stock di lavoro CFSE (10 m) per 1 ll di sospensione cellulare. Mescolare rapidamente invertendo il tubo più volte. La concentrazione finale di CFSE è di 10 nM.
   2. Incubare per 5 min in un incubatore di CO₂ 37 gradi centigradi. Per fermare la colorazione, aggiungere 5 mL di supporto RP-5, pellet le cellule da centrifugaper per 5 min a 550 x g. Risospendere i PBMC a 1 x 10⁶/mL nei supporti RP-5.
   3. Aggiungere 1,0 mL di sospensione cellulare a un tubo da 10 mL. Utilizzare un tubo per ogni antigene da testare.
6. Stimolazione antigenica dei PBMC umani e della coltura cellulare
   1. Coltura umana CFSE-etichettato PBMC con antigeni nei media RP-5 per 7 giorni in un 37 C/5% CO₂ incubatore. Coltura 1 x 10⁵ cellule/pozzo (100 l) in una piastra di 96 pozze con 100 l/pozzetto di supporti RP-5 contenenti antigene diluito.
      NOTA: gli antigeni utilizzati, comprese le concentrazioni di lavoro, sono riepilogati nella Tabella 1.

3. Colorazione anti-CD4 per l'analisi FACS

1. Pipette 200 - L delle cellule coltivate in tubi FACS, celle di lavaggio 1x in 1,0 mL di PBS contenenti 0,1% FCS e centrifuga per 5 min a 550 x g.
2. Macchie con CD4 anti-umano Alexa Fluor 647 (0,25 mg/mL) in 100 - L di PBS/0.1% FCS. Tenere da parte un campione di cellule con etichettatura CFSE, incontaminate con qualsiasi altro fluoroforo, da utilizzare per impostare la compensazione FACS CFSE. Incubare le cellule a 4 gradi centigradi protetti dalla luce per 20 min.
3. Lavare le cellule aggiungendo 1 mL di PBS/0,1% FCS, centrifugare a 550 x g per 5 min a RT e risospendere nuovamente in 100 : L di PBS/0.1% FCS. Immediatamente prima dell'analisi FACS, aggiungere 1 l'l ofoppo di iodio di propidio (PI, 0,1 mg/mL) a tutti i tubi per consentire alle cellule morte di essere escluse dalla citometria di flusso.

4. Configurazione citometrica del flusso e strategia Di Gating

NOT: Nella figura 1 è illustrata la configurazione FACS, inclusi i controlli di compensazione e la strategia di gating.

1. Cancellare la popolazione a dispersione in avanti (FSC) e a dispersione laterale (SSC) (Figura1A)per includere tutti i linfociti.
2. Cancellare la popolazione FSC vs PI (Figura 1B) su cellule negative PI per escludere le cellule apoptotiche.
3. Utilizzare celle non colorate per impostare una linea di base di tensione per le celle non fluorescenti. Impostare le tensioni per CD4-A647 e CFSE in modo che il segnale di fluorescenza sia inferiore a 1.000 per ciascuno (Figura 1C). Utilizzare i controlli a colore singolo CFSE (Figura 1D) e CD4-A647 (Figura 1E) per confermare i segnali fluorescenti positivi (10.000 USD) per ogni colore, utilizzando le tensioni impostate con celle non colorate.
4. CFSE e PI hanno una certa sovrapposizione spettrale; regolare la compensazione per sottrarre la fluorenza PI dalla fluorenza CFSE fino a quando il campione solo CFSE non produce un segnale nel canale PI.
   NOT: Questi cancelli sono stati applicati a tutti i campioni analizzati nel presente documento.

5. Calcolo dell'indice di divisione cellulare per enumerare il CD4 specifico dell'antigene^- proliferazione delle cellule T

NOT: L'indice di divisione cellulare (CDI) si riferisce al numero di celle divise (CD4^-/CFSE^dim) per 5.000 celle indivise (CD4^-CFSE^bright). Quando il numero di celle CD4 indivise non è esattamente 5.000, il numero di celle divise viene corretto per esprimere il numero di celle divise per 5.000 celle indivise. Ad esempio, utilizzando la proliferazione tetanus specifica del toxoid (Figura 2D), sono state presenti 4.930 celle indivise (CFSE^bright) e 3.268 celle divise (CFSE^dim); pertanto, il numero corretto di celle divise è (5.000/4.930) x 3.268 x 3.304,3.

1. Calcolare il CDI (Tabella 1) dividendo il numero di cellule divise / 5.000 cellule indivise dal gruppo stimolato dall'antigene per il numero medio di cellule divise (per 5.000 cellule indivise) dalle cellule coltivate senza antigene (Tabella 2).

Risultati

Stimolazione in vitro dei PMC umani con proteina toxoidte del tetano: i PMC sono stati macchiati con CFSE e stimolati per 7 giorni in presenza di toxoid tetano. Quasi tutti i donatori hanno mostrato una forte risposta delle cellule T al tetano toxoid perché erano stati vaccinati, il che rende il tetano toxoid un utile antigene di controllo positivo. La figura 2 dimostra in triplice copia, che la proliferazione CFSE di CD4^- Le cellule T provenienti...

Discussione

La proliferazione basata su CFSE è un metodo semplice e robusto per rilevare ed enumerare le cellule CD4 umane specifiche dell'antigene e le cellule T. È stato dimostrato in precedenza che l'utilizzo della concentrazione ottimale di CFSE è essenziale per ottenere risultati ottimali⁴. Troppo CFSE abroga la proliferazione, mentre troppo poco non consente di distinguere le cellule divise e indivise. Al contrario, concentrazioni relativamente elevate (5,0 M) di CFSE vengono utilizzate pe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-human CD4-AlexaFluor647	Biolegend	317422	RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	ThermoFisher	C1157
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	71-7167-00
Glutamax (1x)	Gibco	35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1	Sino Biological	40010-V07E
Non-essential amino acids (1x)	Gibco	11140
Penicillin/Streptomycin (1x)	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Pooled human serum	Australian Red Cross	N/A
Proinsulin C-peptide PI33-63	Purar Chemicals	N/A	Custom made synthetic peptide
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Tetanus Toxoid protein	Statens Serum Intitut	N/A