Quantification de la prolifération des cellules CD4et T spécifiques à l'antigène humain à l'aide de Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Résumé

Présenté ici est un protocole pour mesurer la prolifération des cellules CD4^T en réponse à des protéines antigéniques ou des peptides en utilisant la dilution des colorants. Cet analyse est particulièrement sensible aux rares lymphocytes T spécifiques à l'antigène et peut être modifié pour faciliter le clonage des cellules spécifiques à l'antigène.

Résumé

Décrit est une méthode simple, in vitro, colorant basée sur la dilution pour mesurer la prolifération des cellules CD4^et T spécifiques à l'antigène dans les cellules mononucléaires périphériques humaines (PBMC). Le développement de colorants fluorescents stables, non toxiques, tels que carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) permet de distinguer les lymphocytes T rares et spécifiques à l'antigène des passants par diminution de la coloration fluorescente, telle qu'elle est détectée par la cytométrie du débit. Cette méthode présente les avantages suivants par rapport aux approches alternatives : (i) elle est très sensible aux lymphocytes T à basse fréquence, (ii) aucune connaissance de l'antigène ou de l'épitopie n'est requise, (iii) le phénotype des cellules répondantes peut être analysé, et (iv) viable, répondant les cellules peuvent être triées et utilisées pour une analyse plus approfondie, comme le clonage des lymphocytes T.

Introduction

La capacité de détecter et d'étudier les lymphocytes T spécifiques à l'antigène est importante dans les études de l'immunité à médiation cellulaire. Cependant, cela est particulièrement difficile pour les réponses CD4^et Lymphocellulaires spécifiques à l'autoantigène, qui sont très faibles et difficiles à détecter. Une méthode courante utilisée pour la détection de la prolifération des lymphocytes spécifiques à l'antigène est [3H]-thymidine, qui est un nucléotide radio-étiqueté incorporé dans l'ADN des cellules proliférantes. Bien que l'analyse [3H]-thymidine puisse détecter la synthèse de l'ADN, cette méthode est une mesure indirecte de la division cellulaire, car la synthèse de l'ADN peut initier indépendamment de la mitose (c.-à-d. pendant la duplication génétique et l'apoptose¹). Cette question est aggravée par le fait que la prolifération des cellules spécifique à l'antigène peut entraîner une apoptose considérable², conduisant à une surestimation potentielle de la prolifération spécifique à l'antigène. En outre, la méthode [3H]-thymidine ne fournit pas d'informations phénotypiques pour les lymphocytes proliférants, tels que la prolifération des lignées CD4 ou CD8 dans les PBMC stimulées par des peptides antigéniques.

En 2003, nous avons publié le premier essais de dilution de colorant utilisant CFSE, appelé l'assay de prolifération basé sur CFSE^3,4. CFSE est un colorant fluorescent qui se lie de façon stable aux protéines intracellulaires en formant un lien covalent avec les résidus intracellulaires de lysine. Puisque les protéines labellées CFSE sont divisées également entre les cellules filles³, les cellules qui se sont divisées peuvent être distinguées des cellules indivises par cytométrie de flux, qui permet également le phénotypage quantitatif des populations de lymphocytes. En effet, le nombre de divisions qu'une cellule a subies depuis le moment de la coloration DE la SCEPeut peut être mesuré à un certain degré⁵. Plus récemment, de nombreux colorants similaires tels que CellTrace Violet proliferation dye (VPD) et CytoTrack colorant ont été développés, qui fonctionnent d'une manière similaire⁶. Ce protocole met l'accent sur l'ESFC, mais les principes s'appliquent également à d'autres colorants connexes.

La coloration des tétramères Peptide-MHC est une méthode largement utilisée pour détecter et clonage des cellules CD8^et T spécifiques à l'antigène. Il s'agit d'une méthode bien établie^7,8,9,10; cependant, le clonage à base de tétramères exige une connaissance existante de la restriction de l'épitope/MHC et chaque épitome nécessite son propre tétramer¹¹, ce qui limite la portée de la découverte et du clonage de nouvelles cellules T spécifiques à l'épitopène. La prolifération à base de CFSE peut être utilisée avec des peptides, des protéines ou des lysates cellulaires. Le protocole décrit ci-dessus est à la fois simple et robuste, et les cellules CD4^et T qui répondent peuvent être triées pour être utilisées dans les tests de caractérisation fonctionnelle et biochimique en aval^12,13.

Protocole

Tous les sujets ont donné le consentement informé avant la collecte du sang périphérique. L'approbation éthique des expériences utilisant PBMC a été donnée par St. Vincent's Hosptial (HREC-A 135/08, et HREC-A 161/15).

1. Préparation de réactif

1. Médias de cellule T humains
   1. Préparer rp-5 médias pour la culture PBMC, qui se compose de RPMI 1640, 1x acides aminés non essentiels, L-alanyl-L-glutamine dipeptide (2 mM), pénicilline (100 U/mL)/streptomycine (0,1 mg/mL), et 5% de sérum humain mis en commun (PHS).
2. Solutions d'actions CFSE
   1. Préparer un stock maître en dissolvant 25 mg de CFSE dans 9 ml de DMSO pour obtenir une solution de stock finale avec une concentration de 5 mM.
   2. Préparer un stock de travail en diluant le stock principal en PBS pour atteindre une concentration de travail de 10 M.

2. Préparation des PBMC humains à partir de Sang entier

1. Il y a généralement entre 0.5-1.5 x 10⁶ PBMCs/mL de sang périphérique humain. Par conséquent, la quantité de sang requise dépend du nombre désiré de PBMCs. Diluer le sang périphérique humain avec PBS au moins 1:2. Séparer les PBMC en ajoutant 15 ml de gradient de densité moyen à un tube de 50 ml, puis recouvrir 35 ml de sang entier dilué.
2. Centrifugeuse à 850 x g pendant 15 min sans décélération à température ambiante (RT). Ceci se traduira par trois couches claires: la couche inférieure contenant la pastille de globulerouge rouge, couche moyenne de gradient de densité avec des globules blancs doublant son interface supérieure, et la couche plasmatique supérieure¹⁴.
3. Enlever environ 20 ml de la couche plasmatique supérieure. Recueillir la couche de globules blancs, en prenant soin d'éviter la pastille de globules rouges. Laver 3x avec PBS et compter les cellules viables en utilisant l'exclusion trypan bleu sur un hémocytomètre. Diluer à 1 x 10⁶ PBMCs/mL en PBS.
4. Cellules non tachées de CFSE
   1. Ces cellules sont utilisées comme contrôles de compensation pour la cytométrie du débit, comprenant des cellules non tachées et CD4- single-stained. Ajouter 300 OL de chaque suspension PBMC de l'échantillon de contrôle à un tube de 10 ml, le dessus avec pbS, et la centrifugeuse à 550 x g pendant 5 min à RT.
   2. Resuspendre 1 x 10⁶ cellules/mL dans le support RP-5. Incuber ces cellules non étiquetées pendant 7 jours dans un incubateur de CO₂ de 37 oC/5 % avec les cellules étiquetées CFSE (étape 2.6.1).
5. Cellules tachées de CFSE
   1. Transférer les cellules de l'étape 2.3 dans un tube de 50 ml. Ajouter 1,0 L de solution de bouillon de travail CFSE (10 M) par 1 ml de suspension cellulaire sur le côté du tube. Mélanger rapidement en inversant le tube plusieurs fois. La concentration finale de CFSE est de 10 nM.
   2. Incuber 5 min dans un incubateur co2 de 37 oC/5 %. Pour arrêter la coloration, ajouter 5 ml de support RP-5, granuler les cellules en centrifuge pendant 5 min à 550 x g. Resuspendre les PBMC à 1 x 10⁶/mL dans les médias RP-5.
   3. Ajouter 1,0 ml de suspension cellulaire à un tube de 10 ml. Utilisez un tube pour chaque antigène à tester.
6. Stimulation antigénique des PBMC humains et de la culture cellulaire
   1. Culture humaine étiquetée CFSE PBMc avec des antigènes dans les médias RP-5 pendant 7 jours dans un incubateur de CO₂ de 37 oC/5 %. Culture 1 x 10⁵ cellules/puits (100 l) dans une plaque de puits de 96 avec 100 l/puits de support RP-5 contenant de l'antigène dilué.
      REMARQUE : Les antigènes utilisés, y compris les concentrations de travail, sont résumés au tableau 1.

3. Staining anti-CD4 pour l'analyse FACS

1. Pipette 200 l des cellules cultivées dans des tubes FACS, laver les cellules 1x dans 1,0 ml de PBS contenant 0,1 % de FCS, et centrifugeuse pendant 5 min à 550 x g.
2. Tache avec anti-humain CD4 Alexa Fluor 647 (0.25 mg/mL) dans 100 'L de PBS/0.1% FCS. Gardez de côté un échantillon de cellules étiquetées CFSE, non tachées avec d'autres fluorophores, à utiliser pour fixer la compensation FACS CFSE. Incuber les cellules à 4 oC à l'abri de la lumière pendant 20 min.
3. Laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS/0,1% FCS, centrifugeuse à 550 x g pendant 5 min à RT, et resuspendre dans 100 oL de PBS/0,1% FCS. Immédiatement avant l'analyse DU FACS, ajouter 1 l d'iodure de propidium (PI, 0,1 mg/mL) à tous les tubes pour permettre aux cellules mortes d'être exclues par la cytométrie du débit.

4. Configuration cytométrique de flux et stratégie de gating

REMARQUE: La figure 1 montre la configuration du FACS, y compris les contrôles de rémunération et la stratégie de gating.

1. Portez la dispersion vers l'avant (FSC) par rapport à la dispersion latérale (SSC) (figure 1A) pour inclure tous les lymphocytes.
2. Portez la population FSC vs PI (Figure 1B) sur les cellules négatives PI pour exclure les cellules apoptotiques.
3. Utilisez des cellules non tachées pour définir une ligne de base de tension pour les cellules non fluorescentes. Définir les tensions pour le CD4-A647 et le CFSE de sorte que le signal de fluorescence soit inférieur à 1 000 pour chaque (figure1C). Utilisez les commandes de couleur unique CFSE (Figure 1D) et CD4-A647 (Figure 1E) pour confirmer les signaux fluorescents positifs (10 000 euros) pour chaque couleur, en utilisant les tensions fixées avec des cellules non tachées.
4. CFSE et PI ont un certain chevauchement spectral; ajuster la compensation pour soustraire la fluorence de l'IP de la fluoresence de l'ESFC jusqu'à ce que l'échantillon de L'ESFC seulement ne donne pas de signal dans le canal DE l'IP.
   REMARQUE: Ces portes ont été appliquées à tous les échantillons analysés ci-contre.

5. Calcul de l'indice de division cellulaire pour énumérer le CD4 spécifique à l'antigène^et la prolifération des lymphocytes T

REMARQUE: L'indice de division cellulaire (CDI) se réfère au nombre de cellules divisées (CD4^et/CFSE^dim) pour 5 000 cellules non divisées (CD4^etCFSE^lumineux). Lorsque le nombre de cellules CD4^et cellules indivises n'est pas exactement de 5 000, le nombre de cellules divisées est corrigé pour exprimer le nombre de cellules divisées par 5 000 cellules non divisées. Par exemple, en utilisant la prolifération toxiale-spécifique du tétanos (figure2D),il y avait 4 930 cellules non divisées (CFSE^bright) et 3 268 cellules divisées (CFSE^dim); par conséquent, le nombre corrigé de cellules divisées est (5 000/4 930) x 3 268 et 3 304,3.

1. Calculer l'ICD (tableau1) en divisant le nombre de cellules divisées/5 000 cellules non divisées du groupe stimulé par l'antigène par le nombre moyen de cellules divisées (pour 5 000 cellules non divisées) des cellules cultivées sans antigène (tableau 2).

Résultats

Stimulation in vitro des PBMC humains avec la protéine toxicoïde de tétanos : LES PBMC ont été souillés avec CFSE et stimulés pendant 7 jours en présence du toxioïde de tétanos. Presque tous les donneurs ont montré une forte réponse des lymphocytes T au tétanos toxioïde parce qu'ils avaient été vaccinés, ce qui rend le tétanos toxicoïde un antigène de contrôle positif utile. La figure 2 démontre dans le triplicate que la prolifération d...

Discussion

La prolifération à base de CFSE est une méthode simple et robuste pour détecter et énumérer les cellules CD4^et T humaines spécifiques à l'antigène. Il a déjà été démontré que l'utilisation de la concentration optimale de CFSE est essentielle pour des résultats optimaux⁴. Trop de CFSE abroge la prolifération, alors que trop peu ne permet pas de distinguer les cellules divisées et indivises. En revanche, des concentrations relativement élevées (5,0 M) de CFSE sont util...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-human CD4-AlexaFluor647	Biolegend	317422	RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	ThermoFisher	C1157
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	71-7167-00
Glutamax (1x)	Gibco	35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1	Sino Biological	40010-V07E
Non-essential amino acids (1x)	Gibco	11140
Penicillin/Streptomycin (1x)	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Pooled human serum	Australian Red Cross	N/A
Proinsulin C-peptide PI33-63	Purar Chemicals	N/A	Custom made synthetic peptide
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Tetanus Toxoid protein	Statens Serum Intitut	N/A