JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada sunulan bir protokol Proliferasyona CD4+ T hücreleri antijenik proteinler veya peptidler boya seyreltme kullanarak yanıt olarak. Bu tahlil nadir antijen özgü T hücrelere özellikle duyarlıdır ve antijen özgü hücrelerin klonlama kolaylaştırmak için değiştirilebilir.

Özet

Açıklanan basit, in vitro, boya seyreltme tabanlı yöntem antijen spesifik CD4+ T hücre proliferasyonu insan periferik kan mononükleer hücrelerde (PBMCs). Karboksfloresan succinimidil Ester (CFSE) gibi istikrarlı, toksik olmayan, floresan boyaların geliştirilmesi, nadir, antijen spesifik T hücrelerinin, Akış sitometrisi tarafından algılandığı gibi floresan renkte azalan şekilde seyircilerden ayırt edilmesini sağlar. Bu yöntem, alternatif yaklaşımlar üzerinde aşağıdaki avantajlara sahiptir: (i) düşük frekanslı T hücrelerine çok duyarlıdır, (ii) antijen veya epitopu bilgisi gerektirmez, (iii) yanıt veren hücrelerin fenotipi analiz edilebilir, ve (iv) uygulanabilir, yanıt hücreler sıralanabilir ve T hücresi klonlama gibi daha fazla analiz için kullanılabilir.

Giriş

Antijen spesifik T hücrelerini tespit etme ve çalışma yeteneği, hücre aracılı bağışıklık çalışmalarında önemlidir. Ancak, bunu yapmak özellikle, çok zayıf ve algılamak zor olan otoantijen spesifik CD4+ T-Cell yanıtları için zordur. Antijen spesifik lenfosit proliferasyonu tespiti için kullanılan ortak bir yöntem, proliferasyon hücrelerinin DNA 'sına dahil edilmiş radyoaktif nüklenotid olan [3H]-thymidine ' dir. Rağmen [3H]-thymidine tahlil DNA sentezini algılayabilir, bu yöntem hücre bölünmesi dolaylı bir ölçüsüdür, çünkü DNA sentezi mitoz bağımsız olarak başlatabilirsiniz (yani, gen çoğaltma ve Apoptozis sırasında1). Bu sorun, hücrelerin antijen spesifik proliferasyonu önemli apoptozis2, antijen spesifik proliferasyon potansiyel aşırı tahminine yol açabileceği gerçeğini tarafından bileşik olduğunu. Ayrıca, [3H]-thymidine yöntemi proliferasyon lenfositler için fenotipik bilgi sağlamaz, gibi CD4+ veya CD8+ Lineage proliferasyonu pbmcs antijenik peptitler ile uyarılmış.

2003 yılında, cfse kullanarak ilk boya seyreltme assay yayımlandı, cfse tabanlı proliferasyon tahlil3,4çağırdı. CFSE, hücre içi lizin kalıntıları için bir kovalent bağ oluşturarak hücre içi proteinlere tutarlı bir şekilde bağlanan bir floresan boydır. Cfse etiketli proteinler, kız hücreleri3' e eşit olarak bölünmüş olduğundan, bölünmüş hücreler bölünmüş hücrelerden akış sitometri tarafından ayırt edilebilir, bu da lenfosit nüfus niceliksel fenotiplemeyi için izin verir. Nitekim, bir hücrenin CFSE-stainıng zamandan gelen bölünmelerin sayısı bir dereceye kadar ölçülebilir5. Daha yakın zamanda, CellTrace Violet proliferasyon boya (VPD) ve CytoTrack boya gibi pek çok benzer boyalar geliştirilmiştir, hangi benzer şekilde çalışır6. Bu protokol CFSE odaklanır, ancak ilkeler diğer ilgili boyalar için eşit olarak geçerlidir.

Peptid-MHC tetramer boyama antijen spesifik CD8+ T hücrelerini tespit etmek ve klonlamak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu iyi kurulan bir yöntem7,8,9,10; Ancak tetramer tabanlı klonlama, epitopu/MHC kısıtlamasının mevcut bilgisini gerektirir ve her epitopu, epitopu spesifik T hücrelerinin yeni keşfi ve klonlaması kapsamını sınırlayan kendi tetramer11' i gerektirir. CFSE tabanlı proliferasyon peptidler, proteinler veya hücre Lysates ile kullanılabilir. Burada açıklanan protokol hem basit hem de sağlam olup, yanıt veren CD4+ T hücrelerinin aşağı akım fonksiyonel ve biyokimyasal karakterizasyon olarak kullanılmak üzere sıralanması12,13.

Protokol

Tüm konularda periferik kan toplanması önce bilgilendirilmiş onay verdi. PBMC kullanarak deneyler için etik onay St Vincent 's Hosptial (HREC-A 135/08 ve HREC-A 161/15) tarafından verildi.

1. reakajın hazırlanması

  1. İnsan T hücreli medya
    1. Hazırlamak RP-5 medya PBMC için, hangi RPMI 1640 oluşur, 1x olmayan esansiyel amino asitler, L-alanil-L-glutamin dipeptid (2 mM), penisilin (100 U/mL)/streptomisin (0,1 mg/mL), ve 5% havuz insan serumu (PHS).
  2. CFSE hisse senedi çözümleri
    1. 5 mM konsantrasyonu ile son bir stok çözümü elde etmek için ~ 9 mL DMSO 'da 25 mg CFSE çözünerek bir Master Stock hazırlayın.
    2. 10 μM çalışma konsantrasyonu elde etmek için PBS 'deki ana stokları seyreltilerek bir çalışma stoğu hazırlayın.

2. tüm kan gelen ınsan PBMCs hazırlanması

  1. Genellikle 0.5 – 1,5 x 106 pbmcs/ml insan periferik kan arasındadır. Bu nedenle, gerekli kan miktarı PBMCs istenen sayısına bağlıdır. en az 1:2 PBS ile insan periferik kan seyreltilen. 50 mL tüpüne 15 mL yoğunluk degrade orta ekleyerek PBMCs 'yi ayırın, ardından 35 mL seyreltilmiş bütün kanı bindirin.
  2. Oda sıcaklığında (RT) yavaşlama yapmadan 15 dakika boyunca 850 x g 'de Santrifüjü. Bu üç net katmanlar sonuçlanır: kırmızı kan hücresi Pellet içeren alt katman, üst arayüzü astar beyaz kan hücreleri ile yoğunluk degrade orta orta tabaka, ve üst plazma katmanı14.
  3. Üst plazma tabakasının yaklaşık 20 mL kaldırın. Beyaz kan hücresi tabakası toplamak, kırmızı kan hücresi Pelet önlemek için dikkatli olmak. PBS ile 3x yıkayın ve bir hemocytometer üzerinde tripan mavi dışlama kullanarak uygun hücreleri saymak. PBS 'de 1 x 106 pbmcs/ml seyreltmeli.
  4. CFSE olmayan-lekeli hücreler
    1. Bu hücreler, lekelenmiş ve CD4+ tek lekeli hücrelerden oluşan akış sitometri için tazminat kontrolleri olarak kullanılır. Her kontrol örneği PBMC süspansiyonunun 300 μL 'yi 10 mL 'Lik bir tüpe, PBS ile üst üste ve 550 x g 'de 5 dk. RT 'de Santrifüjüne ekleyin.
    2. RP-5 medyada 1 x 106 hücre/ml resuspend. CFSE etiketli hücreler (adım 2.6.1) ile 37 °C/5% CO2 inkükode 7 gün boyunca bu etiketsiz hücreleri kuluçat.
  5. CFSE-lekeli hücreler
    1. Hücreleri adım 2,3 bir 50 mL tüpüne aktarın. 1,0 μL CFSE çalışma stok çözeltisi (10 μM) için 1 mL hücre süspansiyon başına tüp tarafına ekleyin. Tüpün birkaç kez tersine çevirerek hızla karıştırın. CFSE 'nin son konsantrasyonu 10 nM dir.
    2. 37 °C/5% CO2 inküvatör içinde 5 dakika boyunca kuluçat. Boyama durdurmak için, RP-5 medya 5 ml ekleyin, 550 x g'de 5 dakika santrifüpleme hücreleri Pelet. RP-5 medyada 1 x 106/ml 'de PBMCs 'yi resuspend.
    3. 1,0 ml 'Lik hücre süspansiyonunu 10 mL tüpüne ekleyin. Test edilecek her antijen için bir tüp kullanın.
  6. İnsan PBMCs ve hücre kültürünün antijenik stimülasyon
    1. 37 °C/5% CO2 inkübatör ile 7 gün boyunca RP-5 medyasında antijenlerle ınsan Cfse etiketli PBMCs kültürü. Kültür 1 x 105 hücreler/kuyu (100 μL), 100 μL/kuyu, seyreltilmiş ANTIJEN içeren RP-5 medyası ile 96 iyi bir plakaya sahiptir.
      Not: çalışma konsantrasyonları da dahil olmak üzere kullanılan antijenler Tablo 1' de özetlenmiştir.

3. Anti-CD4 boyama FACS analizi için

  1. Pipet 200 μL kültürlü hücrelerin FACS tüpler içine,% 0,1 FCS içeren PBS 1,0 mL 1x yıkama hücreleri, ve 5 dk için santrifüjler içinde 550 x g.
  2. Anti-human CD4 Alexa Fluor ile leke 647 (0,25 mg/mL) içinde 100 μL PBS/0.1% FCS. FACS CFSE telafisi ayarlamak için kullanmak için, diğer fluorophores ile lekelenmeli, CFSE etiketli hücrelerin bir örnek kenara tutun. Hücrelerde 4 °C ' de 20 dakika boyunca ışıktan korunuyor.
  3. 1 ml PBS/0,1% FCS ekleyerek hücreleri yıkayın, 550 x g 'de RT 'de 5 dakika santrifüjler ve 100 μL PBS/0.1% FCS içinde pelletini. FACS analizinden hemen önce, ölü hücrelerin Akış sitometrisi tarafından dışlanmasına izin vermek için tüm tüplere 1 μL propidium iyodide (PI, 0,1 mg/mL) ekleyin.

4. akış Cytometrik yapılandırma ve gating stratejisi

Not: Şekil 1 , tazminat kontrolleri ve gating stratejisi dahil olmak üzere FACS yapılandırmasını gösterir.

  1. Tüm lenfositleri dahil etmek için ileri dağılım (FSC) ile yan dağılım (SSC) (Şekil 1a) popülasyon kapısı.
  2. Apoptotik hücreleri dışlamak için PI negatif hücrelerde FSC vs. PI (Şekil 1B) nüfusunu kaplayın.
  3. Floresan olmayan hücreler için voltaj temeli ayarlamak üzere lekesiz hücreler kullanın. Her biri için floresan sinyalinin 1.000 altında olması için CD4-A647 ve CFSE gerilimleri ayarlayın (Şekil 1C). Tek renk kontrolleri CFSE kullanın (Şekil 1D) ve CD4-A647 (Şekil 1e) pozitif floresan sinyalleri onaylamak için (~ 10.000) her renk için, lekelenmiş hücrelerle ayarlanan voltajları kullanarak.
  4. CFSE ve PI bazı spektral örtüşme vardır; CFSE-Only örnek PI kanalında bir sinyal vermezse kadar PI floresan CFSE floresan çıkarmak için tazminat ayarlayın.
    Not: Bu kapılar burada analiz edilen tüm örneklere uygulanmıştır.

5. Antigen özel CD4+ T hücre proliferasyonu numaralandırmak Için hücre bölme indeksi hesaplanması

Not: Hücre bölme indeksi (CDı) bölünmemiş hücreler (CD4 +/cfseparlak) 5.000 başına bölünmüş hücreler (CD4+/cfseDim) sayısını ifade eder. Ne zaman bölünmüş sayısı CD4+ hücreler tam olarak 5.000 değil, bölünmüş hücrelerin sayısı 5.000 bölünmemiş hücreler başına bölünmüş hücrelerin sayısını ifade etmek için düzeltildi. Örneğin, tetanoz toksinoid spesifik proliferasyonu kullanarak (Şekil 2D), 4.930 bölünmüş hücreler (cfsebright) ve 3.268 bölünmüş hücreler (cfseDIM) vardı; Bu nedenle, bölünmüş hücrelerin sayısı düzeltilmiş (5000/4930) x 3.268 = 3.304,3.

  1. CDı hesaplayın (Tablo 1) bölünmüş hücrelerin sayısını bölerek/5000 antijen uyarılmış gruptan bölünmüş hücrelerin ortalama sayısı tarafından (başına 5.000 bölünmüş hücreler) antijen olmadan kültürlü hücrelerden (Tablo 2).

Sonuçlar

İnsan pbmcs 'lerin tetanoz toksinoid proteine sahip in vitro stimülasyon: pbmcs, cfse ile lekelenmiş ve tetanoz toksoid varlığında 7 gün boyunca uyarıldı. Neredeyse tüm bağışçılar tetanoz toksoid için güçlü bir T hücresi tepkisi gösterdi, çünkü aşı olmuştur, hangi tetanoz toksoid yararlı bir pozitif kontrol antijeni yapar. Şekil 2 , üç hücrelerde, CD4+ T hücrelerinin Unstimüle edilmemiş pbmcs 'den cfse proliferasy...

Tartışmalar

CFSE tabanlı proliferasyon tespit ve antijen özgü insan CD4+ T hücreleri numaralandırılması için basit ve sağlam bir yöntemdir. Daha önce en iyi sonuçlar için CFSE optimum konsantrasyon kullanarak gerekli olduğunu göstermiştir4. Çok fazla cfse CPAP proliferasyon, çok az bölünmüş ve bölünmüş hücreleri ayırt etmek için izin vermez ancak. Aksine, CFSE nispeten yüksek konsantrasyonlarda (5,0 μM) arıtılmış murine T hücreleri etiket için kullanılır

Açıklamalar

Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.

Teşekkürler

Bu çalışma tarafından desteklenmektedir: juvenil diyabet araştırma Vakfı [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). Ulusal Sağlık ve Tıp Araştırma Konseyi (NHMRC GNT123586) (S. M.), diyabet Avustralya araştırma güven Milenyum Ödülü (Y17M1-MANS) (S. M.), Viktorya hükümeti 'nin operasyonel altyapı destek programı (S. M., A. D., E. T., M. S.) ve NHMRC Lisansüstü Burs APP1094337 ve JDRF doktora Top-Up burs (M. S.).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-human CD4-AlexaFluor647Biolegend317422RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)ThermoFisherC1157
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare71-7167-00
Glutamax (1x)Gibco35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1Sino Biological40010-V07E
Non-essential amino acids (1x)Gibco11140
Penicillin/Streptomycin (1x)Gibco15070063
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
Pooled human serumAustralian Red CrossN/A
Proinsulin C-peptide PI33-63Purar ChemicalsN/ACustom made synthetic peptide
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758
Tetanus Toxoid proteinStatens Serum IntitutN/A

Referanslar

  1. Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
  2. Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
  3. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
  4. Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
  5. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
  6. Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
  7. Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
  8. Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
  9. Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
  10. Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
  11. Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
  12. Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
  13. So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
  14. Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
  15. Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve enfeksiyonSay 148insanCD4proliferasyonCFSEhassasotoantijenklonlamaPBMC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır