קוונפיקציה של מתרבים אנטיגן אנושי-ספציפי CD4+ T תאים באמצעות Carboxyפלואורומיתאת הדיקן אסתר

Summary

הציגו כאן הוא פרוטוקול למדידת תאים מתרבים CD4⁺ T בתגובה לחלבונים אנטיגניים או פפטידים באמצעות דילול צבען. שיטת הפעולה רגישה במיוחד לתאי T נדירים הספציפיים לאנטיגן וניתן לשנותם כדי להקל על השכפול של תאים ספציפיים לאנטיגן.

Abstract

מתוארים הוא פשוט, באופן מתורבת, לדילול צבען שיטה מבוססת למדידת אנטיגן ספציפי CD4⁺ T התפשטות התא של דם היקפי בתאי מונפינקה (PBMCs). התפתחות יציבה, שאינם רעילים, צבעי פלורסנט כגון carboxyfluorescmidyl באסטר (CFSE) מאפשר נדיר, אנטיגן ספציפיים תאים T להיות נבדל מעוברי אורח על ידי צמצום בצביעת פלורסנט, כפי שזוהה על ידי הזרמת cy try. שיטה זו כוללת את היתרונות הבאים על פני גישות חלופיות: (i) היא רגישה מאוד לתאי T בתדר נמוך, (ii) לא ניתן לנתח את האנטיגן או האפיפי, (iii) הפנוטיפים של התאים המגיבים ניתנים לניתוח, ו-(iv) קיימא, תגובה ניתן למיין ולהשתמש בתאים לצורך ניתוח נוסף, כגון שכפול תא T.

Introduction

היכולת לזהות וללמוד אנטיגן מסוים תאים T חשוב במחקרים של חסינות התא בתיווך. עם זאת, עושה זאת היא מאתגרת במיוחד עבור התגובות autoantigen ספציפי CD4⁺ T-cell תשובות, אשר חלשים מאוד קשה לזהות. שיטה נפוצה המשמשת לזיהוי של הפצת לימפוציטים ספציפיים אנטיגן היא [3H]-thymidine, שהוא נוקלאוטיד הקרינה משולבים ל-DNA של תאים מתרבים. למרות העובדה [3h]-thymidine יכול לזהות סינתזה dna, שיטה זו היא מידה עקיפה של החטיבה התא, משום סינתזה dna יכול ליזום עצמאית של מיטוזה (כלומר, במהלך שכפול גנים ו אפופטוזיס¹). בעיה זו היא מורכבת על ידי העובדה אנטיגן ספציפי התפשטות של תאים יכול לגרום אפופטוזיס ניכרת², המוביל להערכת יתר פוטנציאלי של התפשטות אנטיגן ספציפי. יתר על כן, השיטה [3h]-thymidine אינו מספק מידע פנוטימית עבור לימפוציטים מתרבים, כגון CD4⁺ או CD8⁺ שושלת היוחסין ב pbmcs מגורה עם פפטידים העברה אנטיגנית.

בשנת 2003, פרסמנו את השיטה הראשונה לדילול הצבע באמצעות cfse, שנקרא שיטת ההפצה המבוססת על cfse^3,4. CFSE הוא צבע פלורסנט הנקשר באופן בלתי נשכח חלבונים תאיים על ידי יצירת קשר קוולנטי לשקעי ליזין תאיים. מאז החלבונים CFSE-התווית מחולקים באופן שווה בין תאים ביתי³, תאים אשר מחולקים יכול להיות נבדל מתאים מאוחדת על ידי הזרמת cy, אשר גם מאפשר פנוטיפים כמותיים של אוכלוסיות לימפוציטים. אכן, מספר מחלקות התא עבר מזמן של CFSE-צביעת ניתן למדוד במידה מסוימת⁵. לאחרונה, צבעים דומים רבים כמו CellTrace צבע ויולט התפשטות (VPD) ו-ציטוtrack צבען פותחו, אשר פועלים באופן דומה⁶. פרוטוקול זה מתמקד CFSE, אבל העקרונות חלים באופן שווה על צבעים אחרים הקשורים.

פפטיד-MHC מכתים כתמים היא שיטה נפוצה לגילוי ושיבוט של אנטיגן ספציפי CD8⁺ T תאים. זוהי שיטה מבוססת היטב^7,8,9,10; עם זאת, שיבוט מבוסס הטטרמר דורש ידע קיים של ההגבלה האפירופה/MHC וכל אפירופה דורש את הטטרזה¹¹שלו, אשר מגביל את היקף הגילוי והשכפול של תאי T ספציפיים לספרות. התפשטות CFSE מבוססי ניתן להשתמש עם פפטידים, חלבונים, או lysates תא. הפרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט ויציב, והתאים המגיבים CD4⁺ T יכולים להיות ממוינים לשימוש בתוך האפיון התפקודי והביוכימיים במורד הזרם^12,13.

Protocol

כל הנושאים העניקו הסכמה מושכלת לפני איסוף הדם ההיקפי. אישור מוסרי לניסויים באמצעות ה-PBMC ניתן על-ידי וינסנט הקדוש (HREC-A 135/08 ו-HREC-A 161/15).

1. הכנה מגיב

1. מדיה סלולרית אנושית
   1. להכין RP-5 מדיה עבור culturing PBMC, אשר מורכב RPMI 1640, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, L-alanyl-L-גלוטמין דיפפטיד (2 מ"מ), פניצילין (100 U/mL)/streptomycin (0.1 mg/mL), ו 5% סרום אנושי במאגר (מאלפים).
2. CFSE פתרונות מניות
   1. להכין מלאי הורים על ידי המסת 25 מ"ג של CFSE ב ~ 9 מ ל של DMSO כדי להשיג פתרון מניות סופי עם ריכוז של 5 מ"מ.
   2. הכינו מלאי עבודה על ידי דילול המניה הראשית ב-PBS כדי להשיג ריכוז עובד של 10 μM.

2. הכנת PBMCs של בני אדם מכל דם

1. יש בדרך כלל בין 0.5 – 1.5 x 10⁶ pbmcs/mL של דם היקפי אנושי. לכן, כמות הדם הנדרשת תלויה במספר הרצוי של PBMCs. לדלל דם היקפי אנושי עם PBS לפחות 1:2. הפרד את PBMCs על-ידי הוספת 15 mL של צפיפות מעבר הצבע לצינור 50 mL, ואז שכבת-על 35 mL של דם שלם מדולל.
2. צנטריפוגה ב 850 x g עבור 15 דקות ללא האטה בטמפרטורת החדר (RT). זה יגרום שלוש שכבות ברורות: השכבה התחתונה המכילה את הגלולה תא דם אדום, השכבה האמצעית של בינוני מעבר הדרגתי עם כדוריות הדם הלבנות בטנת הממשק העליון שלה, ושכבת פלזמה העליון¹⁴.
3. הסר כ-20 מ ל של שכבת הפלזמה העליונה. לאסוף את שכבת התאים הלבנים דם, להיות זהיר כדי למנוע את הגלולה תא דם אדום. לשטוף את 3x עם PBS ולספור תאים קיימא באמצעות טריקון כחול הדרה על החולה החולה. דלל ל 1 x 10⁶ pbmcs/mL ב-PBS.
4. תאים שאינם מוכתמים CFSE
   1. תאים אלה משמשים כפקדי פיצוי לזרימה cy, המורכב מCD4⁺ תאים בודדים ומוכתם. הוסף 300 μL של כל מדגם שליטה הבולם PBMC לצינור 10 mL, למעלה עם PBS, ו צנטריפוגה ב 550 x g עבור 5 דקות ב-RT.
   2. השהה מחדש 1 x 10⁶ תאים/ML ב RP-5 מדיה. דגירה אלה תאים ללא תווית עבור 7 ימים ב 37 ° c/5% החממה CO₂ עם התאים המסומנים cfse (שלב 2.6.1).
5. תאים מוכתמים CFSE
   1. העבר את התאים משלב 2.3 לתוך צינור 50 mL. הוסף 1.0 μL של פתרון מלאי העבודה CFSE (10 μM) עבור 1 mL של השעיית תא לצד הצינור. מערבבים במהירות על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. הריכוז הסופי של CFSE הוא 10 ננומטר.
   2. דגירה עבור 5 דקות ב 37 ° c/5% החממה CO₂ . כדי לעצור את ההכתמים, להוסיף 5 מ ל של RP-5 מדיה, גלולה את התאים על ידי תפרידו עבור 5 דקות ב 550 x g. השהה מחדש את ה-PBMCs ב-1 x 10⁶/mL במדיית RP-5.
   3. הוסף 1.0 mL של השעיית תא לצינור 10 מ ל. השתמש בצינור אחד עבור כל אנטיגן להיבדק.
6. הגירוי האנטי-הגניים של התרבות והתאים האנושיים
   1. התרבות האנושית CFSE מתויג PBMCs עם אנטיגנים ב RP-5 מדיה עבור 7 ימים ב 37 ° c/5% החממה CO₂ . תרבות 1 x 10⁵ תאים/גם (100 μl) ב 96 צלחת באר עם 100 μl/טוב של RP-5 מדיה המכילה אנטיגן מדולל.
      הערה: אנטיגנים המשמשים, כולל ריכוזי עבודה, מסוכמים בטבלה 1.

3. אנטי CD4 צביעת לניתוח FACS

1. פיפטה 200 μL של תאים מתורבתים לצינורות FACS, לשטוף את התאים 1x ב 1.0 mL של PBS המכיל 0.1% FCS, ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 550 x g.
2. כתם עם אנטי אדם CD4 אלקסה Fluor 647 (0.25 mg/mL) ב 100 μL של PBS/0.1% FCS. לשמור הצידה מדגם של תאים CFSE-מתויג, ללא המוכתמת עם כל fluorophores אחרים, כדי להשתמש עבור הגדרת פיצוי CFSE cfc. מודגנת את התאים ב 4 ° צ' מוגן מפני אור עבור 20 דקות.
3. לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 mL של PBS/0.1% FCS, צנטריפוגה ב 550 x g עבור 5 דקות ב-RT, ו להשעות מחדש ב 100 μl של PBS/0.1% fcs. מיד לפני ניתוח FACS, להוסיף 1 μL של propidium יודיד (PI, 0.1 mg/mL) על כל הצינורות כדי לאפשר את התאים מתים להיות נשלל על-ידי cy, לנסות הזרימה.

4. הגדרת התצורה והאסטרטגיה של הזרימה

הערה: איור 1 מציג את תצורת ה-facs כולל שולטת פיצוי והערכת אסטרטגיה.

1. שער האוכלוסיה העברה (FSC) לעומת פיזור בצד (מתחת לפני המטה) (איור 1a) שתכלול את כל לימפוציטים.
2. השער את האוכלוסיה של FSC vs. PI (איור 1B) בתאים שליליים של pi כדי שלא יכללו תאים אפוטוטיים.
3. השתמש בתאים שאינם מוכתמים כדי לקבוע בסיס מתח עבור תאים שאינם פלורסנט. הגדר את המתח עבור CD4-A647 ו CFSE כך את האות הפלואורסצנטית הוא מתחת 1,000 עבור כל (איור 1C). השתמש בפקדי צבע יחיד CFSE (איור 1D) ו-CD4-A647 (איור 1d) כדי לאשר אותות פלורסנט חיוביים (~ 10,000) לכל צבע, תוך שימוש במתח הקבוע עם תאים לא מוכתמים.
4. CFSE ו-PI יש חפיפה ספקטרלית; להתאים את הפיצוי כדי להחסיר הפחתה של PI fluoresence מתוך CFSE fluoresence עד שמדגם CFSE בלבד אינו מהניב אות בערוץ ה-PI.
   הערה: השערים הללו הוחלו על כל. הדגימות שנותחו במסמך זה

5. חישוב של מדד החטיבה תא לספירת אנטיגן ספציפי CD4⁺ T הפצת תאים

הערה: מדד חלוקת תאים (CDI) מתייחס למספר התאים המחולקים (CD4⁺/cfse^dim5,000) לתאים מאוחדת (CD4⁺/cfse בהיר). כאשר מספר התאים CD4⁺ מחולקת אינו בדיוק 5,000, מספר התאים המחולקים מתוקן כדי לבטא את מספר התאים המחולקים ל-5,000 תאים לא מאוחדת. לדוגמה, שימוש בהתפשטות הספציפית של טטנוס (איור 2D), היו 4,930 תאים מאוחדת (cfse^בהירים) ו-3,268 תאים מחולקים (cfse^dim); לפיכך, המספר המתוקן של תאים מחולקים הוא (5000/4930) x 3,268 = 3,304.3.

1. לחשב את CDI (טבלה 1) על ידי חלוקת מספר תאים מחולקים/5000 תאים מחולקת מהקבוצה אנטיגן-מגורה על-ידי מספר ממוצע של תאים מחולקים (לכל 5,000 תאים מאוחדת) מן התאים התרבותי ללא אנטיגן (שולחן2).

תוצאות

בגירוי מתורבת של PBMCs האדם עם חלבון טוקאיד טטנוס: PBMCs היו מוכתמים CFSE ו מגורה עבור 7 ימים בנוכחות של טטנוס רעלים. כמעט כל התורמים הראו תגובה תא T חזקה לרעלים טטנוס בגלל שהם חוסנו, מה שהופך את הטטנוס טוקסין שימושי אנטיגן שליטה חיובית. איור 2 מדגים בטרילקאט, כי התפ...

Discussion

התפשטות CFSE מבוססת היא שיטה פשוטה ואיתנה לזיהוי ולספירה של תאים אנושיים ספציפיים CD4⁺ T. זה כבר הוכיחה בעבר כי באמצעות ריכוז אופטימלי של CFSE חיוני עבור תוצאות אופטימליות⁴. יותר מדי CFSE abrogates התפשטות, בעוד מעט מדי אינו מאפשר לתאים מחולקים ומחולקת להיות מכובד. לעומת זאת, ריכוזים ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-human CD4-AlexaFluor647	Biolegend	317422	RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	ThermoFisher	C1157
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	71-7167-00
Glutamax (1x)	Gibco	35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1	Sino Biological	40010-V07E
Non-essential amino acids (1x)	Gibco	11140
Penicillin/Streptomycin (1x)	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Pooled human serum	Australian Red Cross	N/A
Proinsulin C-peptide PI33-63	Purar Chemicals	N/A	Custom made synthetic peptide
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Tetanus Toxoid protein	Statens Serum Intitut	N/A