Cuantificación de células CD4+ T específicas de antígenos humanos que utilizan éster de succinidilo de carboxifluoresceína

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para medir las células CD4⁺ T proliferantes en respuesta a proteínas antigénicas o péptidos mediante dilución de tinte. Este ensayo es particularmente sensible a las células T específicas del antígeno poco frecuente y se puede modificar para facilitar la clonación de células específicas del antígeno.

Resumen

Descrito es un método simple, in vitro, basado en la dilución de tinte para medir la proliferación de células CD4⁺ T específicas de antígenos en células mononucleares de sangre periférica humana (PPC). El desarrollo de tintes fluorescentes estables, no tóxicos, como el éster de carboxifluoresceína succinimidyl (CFSE) permite distinguir las células T raras específicas del antígeno de los transeúntes por la disminución de la tinción fluorescente, detectada por la citometría de flujo. Este método tiene las siguientes ventajas sobre los enfoques alternativos: (i) es muy sensible a las células T de baja frecuencia, (ii) no se requiere conocimiento del antígeno o epítopo, (iii) se puede analizar el fenotipo de las células que responden, y (iv) ser viable, responder, respondiendo, respondiendo, respondiendo, respondiendo, respondiendo células se pueden ordenar y utilizar para análisis adicionales, como clonación de células T.

Introducción

La capacidad de detectar y estudiar células T específicas del antígeno es importante en estudios de inmunidad mediada por células. Sin embargo, hacerlo es particularmente difícil para las respuestas CD4⁺ Células T específicas de autoantígenos, que son muy débiles y difíciles de detectar. Un método común utilizado para la detección de la proliferación de linfocitos específicos de antígenos es [3H]-timidina, que es un nucleótido radiomarcado incorporado en el ADN de las células que proliferan. Aunque el ensayo [3H]-timidina puede detectar la síntesis de ADN, este método es una medida indirecta de la división celular, porque la síntesis de ADN puede iniciarse independientemente de la mitosis (es decir, durante la duplicación de genes y la apoptosis¹). Este problema se agrava por el hecho de que la proliferación específicade antígenos de las células puede resultar en una apoptosis considerable 2, lo que conduce a una posible sobreestimación de la proliferación específica de antígenos. Además, el método [3H]-timidina no proporciona información fenotípica para los linfocitos que proliferan, como CD4⁺ o CD8⁺ proliferación de linaje en PMC estimulado con péptidos antigénicos.

En 2003, publicamos el primer ensayo de dilución de colorante utilizando CFSE, denominado ensayo de proliferación basado en CFSE^3,4. CFSE es un tinte fluorescente que se une establemente a las proteínas intracelulares mediante la formación de un enlace covalente a los residuos de lisina intracelular. Dado que las proteínas etiquetadas por CFSE se dividen equitativamente entre las células hijas³, las células que se han dividido se pueden distinguir de las células no divididas por la citometría de flujo, lo que también permite el fenotipado cuantitativo de las poblaciones de linfocitos. De hecho, el número de divisiones a las que ha sufrido una céluladesde el momento de la tinción CFSE se puede medir hasta cierto grado 5. Más recientemente, se han desarrollado muchos tintes similares como CellTrace Violet proliferation dye (VPD)y CytoTrack dye, que funcionan de una manera similar 6. Este protocolo se centra en la CFSE, pero los principios se aplican por igual a otros dedos relacionados.

La tinción de tetramer péptido-MHC es un método ampliamente utilizado para detectar y clonar células CD8⁺ T específicas de antígenos. Este es un método bien establecido^7,8,9,10; sin embargo, la clonación basada en tetrameros requiere el conocimiento existente de la restricción del epítopo/MHC y cada epítopo requiere su propio tetramémero^11,lo que limita el alcance del descubrimiento y clonación de células T nuevas específicas de epítopos. La proliferación basada en CFSE se puede utilizar con péptidos, proteínas o lisados celulares. El protocolo descrito en este documento es simple y robusto, y las células CD4⁺ T que responden se pueden clasificar para su uso en ensayos de caracterización funcional y bioquímica aguas abajo^12,13.

Protocolo

Todos los sujetos dieron su consentimiento informado antes de la recolección de sangre periférica. La aprobación ética para experimentos con PBMC fue dada por St. Vincent's Hosptial (HREC-A 135/08, y HREC-A 161/15).

1. Preparación de reactivos

1. Medios de células T humanas
   1. Preparar medios RP-5 para el cultivo de PBMC, que consiste en RPMI 1640, 1x aminoácidos no esenciales, Dipéptido L-aanyl-L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U/ml)/estreptomicina (0,1 mg/ml) y 5% suero humano agrupado (PHS).
2. Soluciones bursátiles de CFSE
   1. Preparar un stock maestro disolviendo 25 mg de CFSE en 9 ml de DMSO para lograr una solución de stock final con una concentración de 5 mM.
   2. Preparar un stock de trabajo diluyendo el stock maestro en PBS para lograr una concentración de trabajo de 10 m.

2. Preparación de PBL humanos a partir de sangre entera

1. Generalmente hay entre 0.5–1.5 x 10⁶ PBMCs/ml de sangre periférica humana. Por lo tanto, la cantidad de sangre requerida depende del número deseado de PBL. Separe los PWC añadiendo 15 ml de medio de gradiente de densidad a un tubo de 50 ml y, a continuación, superponga 35 ml de sangre entera diluida.
2. Centrífuga a 850 x g durante 15 min sin desaceleración a temperatura ambiente (RT). Esto resultará en tres capas claras: la capa inferior que contiene el pellet de glóbulos rojos, la capa media del medio de gradiente de densidad con glóbulos blancos que recubren su interfaz superior, y la capa plasmática superior^14.
3. Retire aproximadamente 20 ml de la capa de plasma superior. Recoger la capa de glóbulos blancos, teniendo cuidado de evitar el pellet de glóbulos rojos. Lave 3 veces con PBS y cuente las células viables usando la exclusión azul de trippan en un hemocitómetro. Diluir a 1 x 10⁶ PBMCs/mL en PBS.
4. Células no teñidas de CFSE
   1. Estas celdas se utilizan como controles de compensación para la citometría de flujo, que comprende de células sin mancha y CD4⁺ de un solo teñido. Añadir 300 l de cada muestra de control de suspensión PBMC a un tubo de 10 ml, parte superior con PBS, y centrífuga a 550 x g durante 5 min en RT.
   2. Resuspenda 1 x 10⁶ celdas/mL en medios RP-5. Incubar estas células sin etiquetar durante 7 días en una incubadora de CO₂ de 37 oC/5% con las células etiquetadas por CFSE (paso 2.6.1).
5. Células teñidas por CFSE
   1. Transfiera las células del paso 2.3 a un tubo de 50 ml. Añadir 1,0 ml de solución de material de trabajo CFSE (10 m) por 1 ml de suspensión celular al lado del tubo. Mezcle rápidamente invirtiendo el tubo varias veces. La concentración final de CFSE es de 10 nM.
   2. Incubar durante 5 min en una incubadora de CO₂ de 37oC/5%. Para detener la tinción, añadir 5 mL de medios RP-5, pellet las células mediante centrifugación durante 5 min a 550 x g. Resuspenda los PPC a 1 x 10⁶/mL en soportes RP-5.
   3. Añadir 1,0 ml de suspensión celular a un tubo de 10 ml. Utilice un tubo para cada antígeno que se va a probar.
6. Estimulación antigénica de los PBL humanos y el cultivo celular
   1. Cultivo humano sólPC etiquetados cfSE con antígenos en medios RP-5 durante 7 días en una incubadora de CO₂ de 37 oC/5%. Cultivo de 1 x 10⁵ células/pozo (100 l) en una placa de 96 pocillos con 100 l/pozo de medios RP-5 que contienen antígeno diluido.
      NOTA: Los antígenos utilizados, incluidas las concentraciones de trabajo, se resumen en el Cuadro1.

3. Tinción anti-CD4 para el análisis FACS

1. Pipetear 200 l de las células cultivadas en tubos FACS, lavar las células 1x en 1,0 ml de PBS que contiene 0,1% de FCS y centrifugar durante 5 min a 550 x g.
2. Mancha con CD4 antihumano Alexa Fluor 647 (0,25 mg/ml) en 100 oL de PBS/0.1% FCS. Mantenga a un lado una muestra de células etiquetadas cfSE, sin mancha rinde con otros fluoróforos, para utilizar para establecer la compensación FACS CFSE. Incubar las células a 4oC protegidas de la luz durante 20 min.
3. Lave las células agregando 1 ml de PBS/0.1% FCS, centrífuga a 550 x g durante 5 min en RT, y resuspende en 100 sde PBS/0.1% FCS. Inmediatamente antes del análisis facS, agregue 1 l de yoduro de propidium (PI, 0,1 mg/ml) a todos los tubos para permitir que las células muertas sean excluidas por citometría de flujo.

4. Configuración citométrica de flujo y estrategia de gating

NOTA: La Figura 1 muestra la configuración FACS incluyendo los controles de compensación y la estrategia de gating.

1. Gate the forward scatter (FSC) vs. side scatter (SSC) (Figura1A)población para incluir todos los linfocitos.
2. Forme la población FSC frente a PI (Figura1B)en células negativas de PI para excluir las células apoptoticas.
3. Utilice celdas no retenidas para establecer una línea base de tensión para las celdas no fluorescentes. Ajuste los voltajes para CD4-A647 y CFSE de modo que la señal de fluorescencia sea inferior a 1.000 para cada uno (Figura1C). Utilice los controles de color único CFSE (Figura 1D) y CD4-A647 (Figura1E) para confirmar señales fluorescentes positivas (10.000 euros) para cada color, utilizando los voltajes establecidos con celdas no manchadas.
4. CFSE y PI tienen cierta superposición espectral; ajustar la compensación para restar PI fluoresence de fluoresencia CFSE hasta que la muestra sólo CFSE no produzca una señal en el canal PI.
   NOTA: Estas puertas se aplicaron a todas las muestras analizadas en este documento.

5. Cálculo del índice de división celular para enumerar la proliferación de células T + CD4 específica sin antígenos

NOTA: El índice de división de celdas (CDI) se refiere al número de celdas divididas (CD4⁺/CFSE^dim) por 5.000 celdas no divididas (CD4⁺/ CFSE^bright). Cuando el número de células CD4⁺ no divididas no es exactamente 5.000, el número de celdas divididas se corrige para expresar el número de celdas divididas por 5.000 celdas no divididas. Por ejemplo, utilizando la proliferación específica de toxoides de tétanos (Figura2D),había 4.930 células no divididas (CFSE^brillante)y 3.268 células divididas (CFSE^dim); por lo tanto, el número corregido de celdas divididas es (5.000/4.930) x 3.268 a 3.304,3.

1. Calcular el CDI (Tabla1) dividiendo el número de celdas divididas/5.000 celdas no divididas del grupo estimulada por antígenos por el número medio de células divididas (por 5.000 células no divididas) de las células cultivadas sin antígeno (Tabla 2).

Resultados

Estimulación in vitro de PASTRO humanos con proteína toxoide del tétanos: los PBMU se mancharon con CFSE y se estimularon durante 7 días en presencia de toxoide de tétanos. Casi todos los donantes mostraron una fuerte respuesta de células T al toxoide del tétanos porque habían sido vacunados, lo que hace que el toxoide del tétanos sea un antígeno de control positivo útil. La Figura 2 demuestra en triplicado, que la proliferación CFSE de células C...

Discusión

La proliferación basada en CFSE es un método simple y robusto para detectar y enumerar células CD4⁺ T humanas específicas del antígeno. Se ha demostrado previamente que el uso de la concentración óptima de CFSE es esencial para obtener resultados óptimos⁴. Demasiada CFSE abroga la proliferación, mientras que muy poco no permite distinguir las células divididas e indivisas. Por el contrario, se utilizan concentraciones relativamente altas (5,0 m)de CFSE ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-human CD4-AlexaFluor647	Biolegend	317422	RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	ThermoFisher	C1157
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	71-7167-00
Glutamax (1x)	Gibco	35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1	Sino Biological	40010-V07E
Non-essential amino acids (1x)	Gibco	11140
Penicillin/Streptomycin (1x)	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Pooled human serum	Australian Red Cross	N/A
Proinsulin C-peptide PI33-63	Purar Chemicals	N/A	Custom made synthetic peptide
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Tetanus Toxoid protein	Statens Serum Intitut	N/A