カルボキシフルオレスチンスクシニミジルエステルを用いたヒト抗原特異的CD4+T細胞の増殖の定量化

要約

ここで提示される、色素希釈を用いた抗原タンパク質またはペプチドに応答して増殖CD4+T細胞を測定するためのプロトコルである。このアッセイは、特に希少な抗原特異的T細胞に対して感受性があり、抗原特異的細胞のクローニングを容易にするために改変することができる。

要約

記載されているのは、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)における抗原特異的CD4+T細胞増殖を測定するための簡便な、インビトロ、色素希釈ベースの方法である。カルボキシフルオレセイン・スクハニミジルエステル(CFSE)のような安定した、非毒性の蛍光色素の開発は、フローサイトメトリーによって検出されるような蛍光染色における減少によって、まれな抗原特異的T細胞を傍観者と区別することを可能にする。この方法は、代替アプローチに対して次の利点があります:(i)低周波T細胞に対して非常に敏感であり、(ii)抗原またはエピトープの知識が必要とされない、(iii)応答細胞の表現型を分析することができ、(iv)生存可能な応答セルを並べ替え、T セルのクローニングなどのさらなる分析に使用できます。

概要

抗原特異的T細胞を検出し、研究する能力は、細胞媒介性免疫の研究において重要である。しかし、これを行うことは、非常に弱く、検出が困難な自己抗原特異的CD4+T細胞応答のために特に困難です。抗原特異的リンパ球増殖の検出に使用される一般的な方法は[3H]-チミジンであり、これは増殖細胞のDNAに組み込まれた放射性標識ヌクレオチドである。[3H]-チミジンアッセイはDNA合成を検出できますが、この方法は細胞分裂の間接的な尺度であり、DNA合成は、遺伝子の複製およびアポトーシス1の間に独立して開始することができるので、細胞分裂の間接的な尺度である。この問題は、細胞の抗原特異的増殖がかなりのアポトーシス2をもたらす可能性があるという事実によって悪化し、抗原特異的増殖の潜在的な過大評価につながる。さらに、[3H]-チミジン法は、抗原ペプチドで刺激されたPBMCにおけるCD4+またはCD8+系統増殖などの増殖リンパ球に対する表現型情報を提供しない。

2003年には、CFSEを用いて初めての染料希釈アッセイを発表し、CFSEベースの増殖アッセイ3、4^と呼ばれる。CFSEは、細胞内リジン残渣に対する共生結合を形成することにより、細胞内タンパク質に安定的に結合する蛍光色素です。CFSE標識タンパク質は娘細胞3の間で均等に分かれているので、分裂した細胞はフローサイトメトリーによって未分裂細胞と区別することができ、これはリンパ球集団の定量的表現型を可能にする。確かに、細胞がCFSE染色の時から受けた分裂の数は、ある^程度5まで測定することができる。最近では、CellTraceバイオレット増殖色素(VPD)やCytoTrack色素などの多くの同様の染料が開発されており、同様の方法で動作^{します6。}このプロトコルはCFSEに焦点を当てていますが、原理は他の関連染料にも同様に適用されます。

ペプチド-MHCテトラマー染色は、抗原特異的CD8+T細胞を検出およびクローニングするための広く使用されている方法である。これは、確立された方法7、8、9、10です。しかし、テトラマーベースのクローニングは、エピトープ/MHC制限の既存の知識を必要とし、各エピトープは、新規エピトープ特異的T細胞の発見およびクローニングの範囲を制限する独自のテトラ^マー11を必要とします。CFSEベースの増殖は、ペプチド、タンパク質、または細胞のライサットと使用することができます。ここに記載されるプロトコルは、シンプルかつ堅牢であり、応答CD4+T細胞は、下流の機能性および生化学的特徴付けアッセイ12、13で使用するためにソートすることができる。

プロトコル

すべての被験者は、末梢血の採取前にインフォームド・コンセントを与えた。PBMCを用いた実験の倫理的承認は、セントビンセントのホスプティアル(HREC-A 135/08、HREC-A 161/15)によって与えられた。

1. 試薬の調製

1. ヒトT細胞培養
   1. RPMI 1640、1x非必須アミノ酸、L-アラニル-L-グルタミンジペプチド(2mM)、ペニシリン(100U/mL)/ストレプトマイシン(0.1mg/mL)、および5%プールヒト血清(PHS)から成るPBMCを培養するためのRP-5培地を調製する。
2. CFSEストックソリューション
   1. DMSOの約9mLで25mgのCFSEを溶解してマスターストックを準備し、5mMの濃度で最終ストック溶液を達成します。
   2. PBSのマスターストックを希釈して作業ストックを準備し、10 μMの作業濃度を達成します。

2. 全血からのヒトPBMCの調製

1. ヒト末梢血の0.5〜1.5 x 10⁶ PBMC/mLの間に一般的です。したがって、必要な血液量は、PBMCの所望の数に依存し、PBSを用いてヒト末梢血を少なくとも1:2で希釈する。50 mLチューブに密度勾配媒体の15 mLを追加してPBMCを分離し、希釈された全血の35 mLをオーバーレイします。
2. 室温(RT)で減速することなく15分間850 x gで遠心分離機。これは、赤血球ペレットを含む底層、その上部インターフェースを裏打ちする白血球を有する密度勾配媒体の中間層、およびトップ血漿^層14の3つの明確な層をもたらす。
3. 最上のプラズマ層の約20mLを取り除きます。赤血球ペレットを避けるために注意して、白血球層を収集します。PBSで3倍を洗浄し、血球計でトリパンブルーの除外を使用して生存細胞を数えます。PBS で 1 x 10⁶ PBMC/mL に希釈します。
4. 非CFSE染色細胞
   1. これらの細胞は、無染色およびCD4+単一染色細胞を含むフローサイトメトリーの補償制御として使用される。各制御サンプルPBMCサスペンションの300 μLを10 mLチューブに追加し、PBSを搭載したトップ、およびRTで5分間550 x gの遠心分離機を追加します。
   2. RP-5メディアで1 x 10⁶セル/mLを再中断します。これらの標識されていない細胞をCFSE標識細胞で37°C/5%CO2インキュベーターで7日間インキュベートします(ステップ2.6.1)。
5. CFSE染色細胞
   1. ステップ 2.3 から 50 mL チューブにセルを移します。チューブの側面に1mLのセル懸濁液あたり1.0 μLのCFSEワーキングストックソリューション(10 μM)を追加します。チューブを数回反転して素早く混ぜます。CFSEの最終濃度は10nMです。
   2. 37 °C/5% CO₂インキュベーターで 5 分間インキュベートします。染色を停止するには、RP-5培体の5 mLを追加し、550 x gで5分間遠心分離することにより細胞をペレットする。RP-5 メディアの 1 x 10⁶/mL で PBMC を再中断します。
   3. 10 mLチューブに1.0 mLのセルサスペンションを追加します。テストする各抗原に 1 つのチューブを使用します。
6. ヒトPBMCおよび細胞培養の抗原刺激
   1. 37°C/5%CO₂インキュベーターで7日間RP-5培中の抗原を用いたヒトCFSE標識PBMCを培養した。希釈抗原を含むRP-5培地の100μL/ウェルを有する96ウェルプレート中の培養1x 10⁵細胞/ウェル(100μL)。
      注:作業濃度を含む使用される抗原は、表1に要約されています。

3. FACS分析用アンチCD4染色

1. 培養細胞のピペット200μLをFACSチューブに、0.1%FCSを含むPBSの1.0mLで細胞を1x洗浄し、550xgで5分間遠心分離機を洗浄する。
2. PBS/0.1%FCSの100 μLで抗ヒトCD4アレクサフルー647(0.25 mg/mL)で汚れ。他の蛍色素に染色されていないCFSE標識細胞のサンプルは脇に置き、FACS CFSE補正の設定に使用してください。光から保護された4°Cで細胞を20分間インキュベートします。
3. PBS/0.1%FCSの1 mLを加え、RTで5分間550xgの遠心分離機を加え、100 μLのPBS/0.1%FCSで再懸濁して細胞を洗浄する。FACS分析の直前に、すべてのチューブにヨウ化プロピジウム(PI、0.1 mg/mL)の1 μLを加え、死んだ細胞をフローサイトメトリーで排除できるようにします。

4. フローサイトメトリック構成とゲーティング戦略

注:図 1は、報酬制御とゲーティング戦略を含む FACS 構成を示しています。

1. 前方散乱(FSC)対側散乱(SSC)(図1A)集団をゲートして、すべてのリンパ球を含む。
2. Pi陰性細胞のFSCとPI(図1B)の集団をゲートして、アポトーシス細胞を除外する。
3. 無染色細胞を使用して、非蛍光細胞の電圧ベースラインを設定します。CD4-A647およびCFSEの電圧を設定して、蛍光信号がそれぞれ1,000以下に設定します(図1C)。単一色制御CFSE(図1D)とCD4-A647(図1E)を使用して、染色されていないセルで設定された電圧を使用して、各色の正の蛍光信号(約10,000)を確認します。
4. CFSE と PI にはスペクトルの重なりがあります。CFSEのみのサンプルがPIチャネルで信号を得なくなるまで、CFSE蛍風からPI蛍を減算する補正を調整します。
   注:これらのゲートは、ここで分析されたすべてのサンプルに適用した。

5. 抗原特異的CD4+T細胞増殖を列挙するための細胞分裂指数の計算

注:細胞分裂指数(CDI)は、5,000個の未分割細胞当たりの分割細胞数(CD4+/CFSE^明るい)を指す。分割されていないCD4+細胞の数が正確に5,000ではない場合、分割された細胞の数は、5,000個の未分割細胞あたりの分割細胞数を表すために補正される。例えば、破傷風トキソイド特異的増殖(図2D)を用いて、4,930個の未分割細胞(CFSE^明るい)と3,268個の分割細胞(CFSE dim)があった。したがって、分割されたセルの補正数は (5,000/4,930) x 3,268 = 3,304.3 です。

1. 抗原を含まない細胞から分断された細胞の数/5,000の未分割細胞の数を、抗原を含まない細胞から分断された細胞の平均数(5,000非分割細胞当たり)で割って計算する(表2)。

結果

破傷風トキソイドタンパク質を用いたヒトPBMCのインビトロ刺激:PBMCをCFSEで染色し、破傷風トキソイドの存在下で7日間刺激した。ほとんどすべてのドナーは、彼らがワクチン接種されたので、破傷風トキソイドに強いT細胞応答を示した, 破傷風トキソイドは有用な陽性対照抗原になります.図2は、非刺激PBMCからのCD4+T細胞のCFSE増殖が最小...

ディスカッション

CFSEベースの増殖は、抗原特異的ヒトCD4+T細胞を検出および列挙するためのシンプルで堅牢な方法です。CFSEの最適な濃度を使用することは、最適な結果4のために不可欠であることを以前に実証されています。あまりにも多くのCFSEは増殖をアブローしますが、あまりにも少なすぎると、分割された細胞と分割されていない細胞を区別することはできません。対照的に?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-human CD4-AlexaFluor647	Biolegend	317422	RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	ThermoFisher	C1157
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	71-7167-00
Glutamax (1x)	Gibco	35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1	Sino Biological	40010-V07E
Non-essential amino acids (1x)	Gibco	11140
Penicillin/Streptomycin (1x)	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Pooled human serum	Australian Red Cross	N/A
Proinsulin C-peptide PI33-63	Purar Chemicals	N/A	Custom made synthetic peptide
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Tetanus Toxoid protein	Statens Serum Intitut	N/A