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摘要

这种方法的目的是通过异种移植哺乳动物肿瘤细胞进入带有荧光标记血管的斑马鱼胚胎,生成肿瘤血管生成体内模型。通过成像异种移植物和相关血管,可以得到血管原反应的定量测量。

摘要

肿瘤血管生成是抗癌治疗的主要目标,该方法的研制为研究体内肿瘤治疗过程提供了新的模型。斑马鱼异种移植是通过将哺乳动物肿瘤细胞植入受精后两天的斑马鱼胚胎的围观空间,然后测量在实验端点观察到的血管生成反应的程度,长达两天植入后。这种方法的主要优点是能够准确量化斑马鱼宿主血管生成反应的移植物。这使得详细的检查分子机制以及宿主与肿瘤对血管生成反应的贡献。异种移植的胚胎可以进行各种治疗,如用潜在的抗血管生成药物孵育,以研究抑制肿瘤血管生成的策略。血管生成反应也可以进行实时成像,以检查更动态的细胞过程。相对不高的实验技术、廉价的斑马鱼维护成本以及较短的实验时间,使得该模型对于开发控制肿瘤血管生成的策略特别有用。

引言

血管生成是癌症的经典特征之一,是抗癌治疗的目标1,2。为了研究这一过程,通过将哺乳动物肿瘤细胞植入小鼠3等动物体内,建立了癌症异种移植模型。还开发了斑马鱼异种移植模型,包括将肿瘤细胞植入受精后2天(dpi)斑马鱼体内,导致斑马鱼血管快速生长到异种移植4中。

该协议描述了一个体内斑马鱼胚胎肿瘤异种移植模型,其中血管生成反应可以在整个异种移植中精确定量。这种方法允许研究者在体内检查支撑肿瘤血管生成反应的分子机制。斑马鱼的遗传可分性允许对宿主的贡献进行询问,而选择不同的肿瘤细胞系允许肿瘤对血管生成的贡献也检查5,6,7。此外,由于斑马鱼幼虫可渗透到小分子中,可以使用特定的通路抑制剂,也可以筛选药物库,以识别肿瘤血管生成8、9、10的新抑制剂。 11.

斑马鱼胚胎异种移植模型与其他哺乳动物异种移植模型相比具有独特的优势。斑马鱼异种移植更便宜,更容易执行,大量的动物可以检查和活细胞成像允许详细检查细胞行为4。不像其他体内模型,需要几个星期来观察显着的血管生长,斑马鱼异种移植的血管生成可以在植入后24小时内观察到植入3,4。然而,胚胎斑马鱼缺乏适应性免疫系统,虽然有利于维持异种移植,但意味着不能检查适应性免疫反应及其对肿瘤血管生成的贡献。此外,缺乏肿瘤基质细胞、无法正射植入肿瘤以及斑马鱼和哺乳动物细胞维持温度的差异是这种方法的潜在弱点。尽管如此,该模型对活成像的可幸存性以及准确定量血管生成反应的能力,使得它对于研究调节体内肿瘤血管生成细胞过程具有独特的益处。

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研究方案

1. 显微注射针的制备

  1. 打开微移液拉拔器并设置以下参数(为材料表中列出的微移液器拉拔器型号校准):热,680;拉, 75;速度, 40;时间, 55;压力: 530.
  2. 将硼硅酸盐玻璃毛细管固定到微移液器拉拔器中,然后拉毛细管,制成两根针。根据需要重复多针。

2. 用于植入的细胞培养

注:当使用该协议时,任何哺乳动物的癌细胞系都可用于将斑马鱼胚胎植入异种移植物。然而,不同细胞系5、11、12之间诱导的血管生成反应差异很大。B16-F1鼠黑色素瘤细胞已被证明在斑马鱼胚胎11中诱导强血管生成反应,因此适用于此协议。

  1. 在75cm2烧瓶中37°C下生长B16-F1细胞,使用MEM-α介质补充胎儿牛血清(FBS),最终浓度为10%(v/v)和青霉素/链霉素,最终浓度为100微克/mL。
  2. 从 95-100% 汇入 75 cm2 B16-F1 细胞瓶中取出介质,并在 5 mL 室温磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中清洗细胞。
  3. 去除5 mL PBS,加入2 mL室温0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA),并在37°C孵育60s。
  4. 点击烧瓶的侧面,确定细胞是否开始失去对烧瓶底部的附着。
  5. 将8 mL的室温MEM---,10%FBS放入烧瓶中,移液器对瓶内,使任何留在烧瓶底部的细胞进入悬浮液,并将电池悬浮液移入15 mL管中。
  6. 将细胞悬浮液在800 x g、4-8°C下离心5分钟,吸出介质,然后用染料给细胞贴上标签。

3. 用荧光染料标记B16-F1细胞

注:为了区分植入的肿瘤细胞和胚胎中的其他细胞,在植入之前,必须用适当的荧光染料标记肿瘤细胞。如果细胞已经表示荧光报告器,则可以跳过此步骤。

  1. 在37°C下孵育2mL无血清MEM-]培养基。
  2. 制备所选染料的库存溶液,并将其稀释至预孵育的2 mL无血清MEM-α培养基中,以产生可行的浓度(染料和适用于B16 F1细胞的浓度示例在材料表中提供)。
  3. 将1mL的染料溶液放入细胞颗粒(从步骤2.6开始),通过移液彻底混合,然后加入其他1 mL的染料溶液并混合。
  4. 在37°C下孵育细胞和染料混合物40分钟,在20分钟内通过轻轻的摇动混合。
  5. 将细胞悬浮液在800 x g,4-8°C下离心5分钟。
  6. 用5 mL的PBS移液吸出上清液并洗涤标记的细胞。
  7. 在800 x g、4-8°C下再次将细胞悬浮液离心5分钟,吸出上清液,并将细胞放在冰上,直到准备植入。
    注:最终肿瘤细胞颗粒的体积应为20-40μL。

4. 准备胚胎植入

注:选择具有荧光标记血管的转基因斑马鱼线(例如kdrl:RFP、fli1a:EGFP等)13,14.

  1. 植入前两天,如前所述产卵斑马鱼,并采集胚胎15。
    注:由于我们不是在早期注射这些鱼,它们不需要在罗森等人15号描述的产卵后20分钟内收集,而是可能在交配几个小时后收集。
  2. 将胚胎放入100毫米培养皿中,密度约为100个胚胎/碟。
  3. 在每个培养皿中加入 50 mL 的 E316(辅以 5 μL 的 1% w/v 水性蓝水质溶液,以防止污染),清除所有死胚胎或碎屑,并将培养皿保存在 28°C 的黑暗培养箱中,直到准备注射。
  4. 在受精后1天(dpf),在每个菜中加入1-苯-2-硫尿(PTU),在E3中产生30mg/L PTU的最终浓度。PTU防止色素沉着,这可能干扰查看肿瘤细胞和血管的能力。
  5. 在 2 dpf 时,使用针头或钳子手动隔离未孵化的任何胚胎。使用荧光显微镜,选择尽可能多的转基因胚胎,以异种移植(50-200)。
  6. 在植入之前,在E3中300μg/mL三合一溶液中麻醉选定的胚胎,以防止注射过程中的运动。
  7. 在E3溶液中将2%的甲基纤维素填充至菜体积的四分之一,将35毫米的菜盘填充。
  8. 使用转移移液器将大约 50 个胚胎(最小化 E3 溶液的体积也转移到甲基纤维素上)。
  9. 使用 Microloader 移液器尖端排列胚胎,使其全部垂直定向,头部朝上,左侧朝上。
    注:步骤4.7-4.9也可以通过将胚胎排列在如前17所述的甘蔗糖块上进行,但根据我们的经验,当胚胎排列在甲基纤维素中时更容易排列。

5. 将哺乳动物癌细胞注射到2个dpf胚胎中

注:为了确保细胞在植入时作为移植物聚集在一起,细胞必须与细胞外基质混合物(ECM)混合在一起。我们已经描述了使用材料表中引用的ECM混合物时制造这种电池/ECM混合物的步骤。如果使用备用矩阵,则应相应地调整步骤。

  1. 将 ECM 的库存分成 100 μL 等分,放入 500 μL 管中,并储存在 -20°C 下,直到需要为止。
  2. 解冻ECM的等分,加入100μL的PBS,将混合物稀释至50%(v/v)。
    注:稀释的 50% ECM 可在 4°C 下存储长达 1 个月。
  3. 通过移液和搅拌将 50% ECM 与 B16-F1 细胞颗粒(从步骤 3.7 开始)混合,以 2:1 的比例产生细胞/ECM 的混合物,并将混合物储存在冰上。
  4. 使用微毛细管移液器,占用3-10μL的细胞。
  5. 小心地将移液器尖端插入针头,并将 B16-F1/矩阵混合物喷射到针头末端。
  6. 将针头插入针头支架,以 45° 角向培养皿倾斜。
  7. 用钳子打断针头,使一个孔足够大,使细胞从针中弹出,而不会挤压细胞。
  8. 打开连接到喷射装置的加压空气缸,并在"连续"模式下暂时打开喷油器,将细胞推到针头。
  9. 将针头从盘子中取出,用流量计更换。
  10. 在流量计上放置一滴油,一次将针头注射到这个滴上。
  11. 使用血细胞计计算单脉冲喷射的细胞数,并通过调整脉冲持续时间校准针头,以弹出每个脉冲约 150 个细胞。
    注:每个脉冲排出这种数量的细胞需要几个脉冲才能成功植入异种移植。这将使研究人员对肿瘤异种移植的最终大小有更多的控制,允许他们适度调整脉冲的数量/位置,使每个异种移植在他们认为合适时变大或变小。
  12. 将针指向胚胎的蛋黄囊,以腹腔方向将其推入蛋黄囊,直到针尖从蛋黄囊中出现,并将胚胎的胚胎表皮推到胚胎的腹侧,正好后至心脏。
    注:放置针头,使其进入胚胎蛋黄囊前至细胞将弹出的最终位置。这将确保细胞将朝远离心脏的方向喷射,从而降低将细胞注射到共同主静脉的可能性。
  13. 小心地向前推针尖一点,直到它在表皮和蛋黄囊膜之间创造了一个空间(表皮和蛋黄囊膜),然后脉冲注射器将一些细胞混合物喷射到表层空间。
  14. 重复脉冲,直到500-800个细胞被注射到围网空间,产生一个可见的凸起,沿着蛋黄囊的底部延伸至少一半,然后从胚胎中取出针头。
    注:如果细胞在注射过程中阻塞针头或损坏,则通过暂时切换到"连续"模式,然后返回"脉冲"来清除针头。这应该解除针,并允许细胞自由弹出,不受损坏。
  15. 继续对菜中的所有胚胎做同样的事,在需要时用肿瘤细胞装上新的针头。
  16. 注射完所有胚胎后,取出针头,使用微毛细管移液器尖端将所有胚胎推在一起,以便用尽可能少的甲基纤维素移液。
  17. 将胚胎转移到含有E3(带PTU和亚甲蓝)的回收盘中,然后通过轻轻移液胚胎周围的E3清洗。
    注:此时,异种移植的胚胎可以通过将异种胚胎分离到不同的菜肴中,并在一个菜中加入药物溶液,并在另一个菜中加入控制溶液(如药物载体),从而用药物进行治疗。
  18. 在34°C下孵育胚胎,每天进行两次检查,从培养皿中取出死胚胎或水肿胚胎。
    注:34°C是异种移植血管化的最佳温度,也已被其他研究使用,使用斑马鱼胚胎异种血管生成模型18。异种移植物可随时成像高达 48 hpi(植入后数小时)。

6. 实时成像

  1. 在48 hpi,识别3-5个健康胚胎没有水肿。在150μg/mL三合一中麻醉它们,并横向安装在1%的低熔点(LMP)角质中,如前所述19。
    注:由于角胶正在凝固,使用微毛细管移液器尖端保持胚胎横向定位。
  2. 打开共聚焦显微镜、显微镜控制器、激光器和用于控制显微镜的计算机软件。
  3. 将盘子放在共聚焦显微镜上。使用 20 倍放大倍率、水浸物透镜,使用明场成像将异种移植置于场中心。
  4. 选择适合检测用于标记肿瘤细胞的染料和用于标记斑马鱼血管的荧光剂的激励激光器。
  5. 将每个激光的增益调整到允许检测肿瘤细胞和血管的水平。
    注:建立共聚焦设置后,请确保在整个实验中保持这些设置不变,以便在异种移植物之间进行比较。
  6. 使用适合肿瘤细胞的激光通道,确定一个体积,包括异种移植的整个体积,允许移植物两侧至少一个或两个光学部分。使用相距约 5 μm 的剖面间隔创建 z 堆栈。
    注:z 堆栈必须包含异种移植的整个体积。
  7. 使用双通道成像,成像肿瘤异种移植和血管。对要成像的每个幼虫重复步骤 6.6-6.7。

7. 延时成像

注:该模型非常适用于成像动态细胞过程,由于其透明度和斑马鱼转基因物的可用性,荧光标记不同的细胞类型。这使得延时成像成为该模型的关键应用。

  1. 打开环境室,在成像前至少 2 小时设置为 34°C。如果腔室未加湿,则加一盘水。
  2. 麻醉3-5个胚胎(在2 dpf下使用120μg/mL三合一,在3dpf使用100μg/mL三合一),并根据上述协议19将其横向安装在0.8%LMP腺玫瑰中,用于延时成像。
    注:由于角胶正在凝固,使用微毛细管移液器尖端保持胚胎横向定位。
  3. 如步骤 6.2-6.7 所述,设置异种移植的设备和图像,每隔 10 分钟获取异种移植的 z 堆栈。
    注:胚胎在成像时必须保持在34°C,并且必须偶尔检查和补充琼脂幼虫顶部的E3,以确保它不干涸。

8. 斑马鱼异种动物血管生成反应的定量

注:以下步骤使用 3D 图像分析软件。具体步骤因所使用的软件而异。

  1. 将肿瘤异种移植的 z-stack 共聚焦图像文件传输到 3D 图像分析软件上的新文件夹。
    注:为了量化肿瘤血管化水平,必须使用校准的设置来创建测量协议,以便它们可用于测量所有异种移植物的肿瘤体积或血管体积。
  2. 要创建用于测量肿瘤异种移植体积的"肿瘤体积"协议,请转到顶部菜单上的"测量"选项卡,然后将名为"查找对象"的协议从窗口左侧显示的协议列表中拖动到空间标题为"在此处拖动任务以进行测量"。
  3. 确保此协议设置为测量肿瘤通道中的对象,然后将名为"Clip 到 ROI"和"从总体进行 ROI"的协议从协议列表中拖动到"在此处拖动任务以进行测量"空间。确保这两个命令应用于"查找对象"标识的对象。
  4. 在校准此协议的设置之前,请转到窗口左上角"模式"标签上方的下拉菜单,然后选择"扩展对焦"视图。
  5. 通过单击每个通道标题下的黑色圆圈,取消选择最右侧窗格中的非肿瘤通道,以便只能看到肿瘤通道。使用窗口顶部的"手绘"工具在所有肿瘤体积周围绘制"感兴趣区域"(ROI)。
    注:小心确保没有肿瘤被排除在ROI。这将提供在校准设置时执行协议的区域。
  6. 选择图像下方面板中的"摘要"标签,并将"显示"选项设置为显示"总体 2"。要进行校准,请单击"查找对象"任务上的星号,该星号将打开设置窗口。使用"强度"调整"阈值"并确定"较低"阈值,直到只选择肿瘤细胞,而不是背景荧光。
    注:这一点很重要,因此只检测到所选 ROI 中肿瘤细胞的荧光(在 8.5 中绘制),并且不测量任何背景荧光。
  7. 确定"最小对象大小",以便仅测量完整的细胞,而不是较小的细胞碎片(例如,通过将"最小对象大小"设置为 100 μm3)。单击顶部菜单上的"测量"选项卡并单击"保存协议",并将此协议保存为"肿瘤体积",并使用相同的设置来测量所有异种移植物。
  8. 要测量异种移植相关血管的体积,您需要制定新的协议。转到顶部菜单,单击"测量"选项卡,然后单击"清除协议"。将"查找对象"和"剪辑到 ROI"任务拖到标题为"在此处拖动任务以进行测量"的空间中。
  9. 确保将第一个命令设置为测量血管通道中的对象,并将以下命令设置为应用于第一个命令标识的对象。然后取消选择极右窗格中的非血管通道,以便只能看到血管。
  10. 以与"存储体积"协议类似的方式确定"存储卷"的设置,并将此协议另存为"存储卷"(参见 8.6-8.7)。
  11. 清除协议并围绕异种移植物绘制 ROI,注意不要包含任何非肿瘤自荧光。通过单击"测量"选项卡、选择"恢复协议"命令并选择"肿瘤体积"协议,测量此 ROI 内肿瘤通道中对象的体积之和。
  12. 使用"Tumor 体积"协议的新 ROI,使用"容器体积"协议通过单击"测量"选项卡、选择"恢复协议"命令并选择"容器体积"来测量此 ROI 内容器通道中的对象总量卷"协议。
  13. 将血管体积除以肿瘤体积,并将答案乘以 100,以获得移植血管化的百分比值。
  14. 对所有其他异种移植重复步骤 8.11 到 8.13。

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结果

通过在 6、24 和 48 hpi 处成像单个异种移植物,可以计算出不同时间点的血管生成反应,如图1A-C所示。最大的血管生成反应是在植入后24-48小时之间观察到的,移植血管的最大水平在2 dpi左右(图1A-C)。在补充电影1中可以看到一个典型的血管生成反应B16-F1异种移植从20.75 hpi到46 hpi的延时电影。这部...

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讨论

该协议的第一个关键步骤是肿瘤细胞的植入。至关重要的是,细胞被注射到一个位置,将允许异种移植成功植入胚胎,而不使胚胎水肿。过于前导的注射可以让细胞向心脏移动,阻塞血液并导致水肿,而太后注射将导致植入不良的异种移植。最好避免前注射,将针头插入蛋黄囊,使其在注射时指向远离心脏。最好通过在蛋黄囊圆部分的前半部分注射细胞来避免后注射。此外,细胞必须注射到蛋黄囊的腹腔,而?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们感谢Alhad Mahagaonkar先生管理奥克兰大学斑马鱼设施和奥克兰大学医学院生物医学成像研究股,在延时共聚焦显微镜方面提供协助。这项工作得到了新西兰卫生研究理事会项目赠款(14/105)、新西兰皇家学会马斯登基金项目赠款(UOA1602)和奥克兰医学研究基金会项目赠款(1116012)给予J.W.A.的支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Air cylinderBOC011GXenotransplantation
B16-F1 cellsATCCCell culture
BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture)Corning356235Xenotransplantation
Borosillicate glass capillariesWarner InstrumentsG100T-4OD = 1.00 mm, ID = 0.78 mm, Length = 10 cm Cell injection
Cell culture dish 35 mm diameterThermofisher NZNUN153066Fish husbandry
Cell culture dish 100 mm diameterSigma-AldrichCLS430167-500EAFish husbandry
Cell culture flask 75 cm2In Vitro TechnologiesCOR430641Cell culture
CellTracker GreenInvitrogenC2925Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media)
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418Drug treatment, Cell labelling
E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl

1.6 g KCl

5.8 g CaCl2·2H2O

9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH		In house [1]Fish husbandry
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)Sigma-AldrichE10521Xenotransplantation, Imaging
Filter tip 1,000 μLVWR732-1491Used during multiple steps
Filter tip 200 μLVWR732-1489Used during multiple steps
Filter tip 10 μLVWR732-1487Used during multiple steps
Fluorescence microscopeLeicaMZ16FAPreparation of embryos
FBS (NZ origin)Thermofisher Scientific10091148Cell culture
GlovesAny commercial brandUsed during multiple steps
Haemocytometer cell counting chamber Improved NeubauerHawksleyVetAC1000Xenotransplantation
Heraeus Multifuge X3R CentrifugeThermofisher Scientific75004500Cell culture, Cell labelling
Hoechst 33342Thermofisher Scientific62249Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media)
Low Melting Point, UltraPure AgaroseThermofisher Scientific16520050Imaging
MethycelluloseSigma-Aldrich9004 67 5Xenotransplantation
Methylene bluesigma-AldrichM9140Fish husbandry
Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillariesEppendorf5242956003Xenotransplantation
MicropipettesAny commercial brandUsed during multiple steps
Micropipette puller P 87Sutter InstrumentsXenotransplantation
Microscope cage incubatorOkolabTime-lapse imaging
MicrowaveAny commercial brandImaging
Mineral oilSigma-AldrichM3516Xenotransplantation
Minimal Essential Media (MEM) - alphaThermofisher Scientfic12561056Cell Culture
MPPI-2 Pressure InjectorApplied Scientific InstrumentationXenotransplantation
Narishige micromanipulatorNarishige GroupXenotransplantation
Nikon D Eclipse C1 Confocal MicroscopeNikonImaging
N-Phenylthiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629Fish husbandry
PBSGibco10010023Cell culture
Penicillin StreptomycinLife Technologies15140122Cell culture
S1 pipet fillerThermoscientific9501Cell culture
Serological stripette 10 mLCorning4488Cell culture
Serological stripette 25 mLCorning4489Cell culture
Serological stripette 5 mLCorning4485Cell culture
Serological stripette 2 mLCorning4486Cell culture
Terumo Needle 22 GAmtechSH 182Fish husbandry
Tissue culture incubatorThermofisher ScientficHeraCell 150iCell culture
Tivozanib (AV951)AVEO PharmaceuticalsDrug treatment
Transfer pipette 3 mLMedirayRL200CFish husbandry
Trypsin/EDTA (0.25%)Life TechnologiesT4049Cell culture
TweezersFine Science Tools11295-10Fish husbandry
Volocity Software (v6.3)Improvision/Perkin ElmerImage analysis

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