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Resumen

El objetivo de este método es generar un modelo in vivo de angiogénesis tumoral mediante células tumorales de mamíferos xenografting en un embrión de pez cebra que tiene vasos sanguíneos marcados fluorescentemente. Mediante la toma de imágenes del xenoinjerto y los vasos asociados, se puede obtener una medición cuantitativa de la respuesta angiogénica.

Resumen

La angiogénesis tumoral es un objetivo clave de la terapia contra el cáncer y este método ha sido desarrollado para proporcionar un nuevo modelo para estudiar este proceso in vivo. Un xenoinjerto de pez cebra se crea implantando células tumorales de mamíferos en el espacio perivitelina de dos embriones de pez cebra de post-fertilización de días, seguido de medir la extensión de la respuesta angiogénica observada en un punto final experimental de hasta dos días postimplantación. La ventaja clave de este método es la capacidad de cuantificar con precisión la respuesta angiogénica del huésped de pez cebra al injerto. Esto permite un examen detallado de los mecanismos moleculares, así como de la contribución del huésped contra el tumor a la respuesta angiogénica. Los embriones xenoinjerados pueden ser sometidos a una variedad de tratamientos, como la incubación con posibles fármacos anti-angiogénesis, con el fin de investigar estrategias para inhibir la angiogénesis tumoral. La respuesta angiogénica también puede ser imagen en vivo con el fin de examinar procesos celulares más dinámicos. La técnica experimental relativamente poco exigente, los costos de mantenimiento baratos del pez cebra y la breve línea de tiempo experimental hacen que este modelo sea especialmente útil para el desarrollo de estrategias para manipular la angiogénesis tumoral.

Introducción

La angiogénesis es una de las señas de identidadclásicas del cáncer y representa un objetivo de la terapia contra el cáncer 1,2. Para estudiar este proceso, se han creado modelos de xenoinjerto de cáncermediante la implantación de células tumorales de mamíferos en animales como ratones 3. También se ha desarrollado un modelo de xenoinjerto de pez cebra, que implica la implantación de células tumorales en 2 días después de la fertilización (dpi) peces cebra que resulta en el crecimiento rápido de los vasos sanguíneos del pez cebra en el xenoinjerto4.

Este protocolo describe un modelo de xenoinjerto tumoral de embrión de pez cebra in vivo en el que la respuesta angiogénica se puede cuantificar con precisión en todo el xenoinjerto. Este método permite al investigador examinar, in vivo, los mecanismos moleculares que sustentan la respuesta angiogénica tumoral. La traibilidad genética del pez cebra permite interrogar la contribución del huésped, mientras que la selección de diferentes líneas celulares tumorales permite examinar también la contribución tumoral a la angiogénesis5,6,7. Además, como las larvas de pez cebra son permeables a moléculas pequeñas, se pueden utilizar inhibidores de víaespecíficos específicos o se pueden analizar bibliotecas de medicamentos para identificar nuevos inhibidores de la angiogénesis tumoral8,9,10, 11.

El modelo de xenoinjerto de embrión de pez cebra presenta ventajas únicas en comparación con otros modelos de xenoinjerto de mamíferos. Los xenoinjertos de pez cebra son más baratos y fáciles de realizar,se puede examinar un gran número de animales y las imágenes de células vivas permiten un examen detallado del comportamiento celular 4. A diferencia de otros modelos in vivo, que requieren hasta varias semanas para observar un crecimiento significativo de los vasos, se puede observar angiogénesis en xenoinjertos de peces cebra dentro de las 24 horas después de la implantación3,4. Sin embargo, la falta de un sistema inmunitario adaptativo en el pez cebra embrionario, aunque beneficioso para mantener el xenoinjerto, significa que no se puede examinar la respuesta inmune adaptativa y su contribución a la angiogénesis tumoral. Además, la falta de células estromales tumorales, la incapacidad para implantar ortotótopopicamente el tumor y la diferencia en la temperatura de mantenimiento entre el pez cebra y las células de mamíferos son posibles debilidades de este método. Sin embargo, la amenabilidad de este modelo para la toma de imágenes en vivo y la capacidad de cuantificar con precisión la respuesta angiogénica hace que sea excepcionalmente beneficioso para el estudio de los procesos celulares que regulan la angiogénesis tumoral in vivo.

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Protocolo

1. Preparación de agujas de microinyección

  1. Encienda un tirador de micropipeta y ajuste los siguientes parámetros (calibrados para el modelo de tirador de micropipeta enumerados en Tabla de materiales:Calor, 680; Tire, 75; Velocidad, 40; Tiempo, 55; Presión: 530.
  2. Asegure un capilar de vidrio borosilicato en el tirador de micropipetas y tire del capilar para hacer dos agujas. Repita el procedimiento para tantas agujas como desee.

2. Cultivo celular para la implantación

NOTA: Cuando se utiliza este protocolo, cualquier línea celular de cáncer de mamífero sin trabajo se puede utilizar para la implantación en embriones de pez cebra como xenoinjertos. Sin embargo, hay mucha variación en larespuesta angiogénica inducida entre las diferentes líneas celulares 5,11,12. Se ha demostrado que las células de melanoma murino B16-F1 inducen una fuerte respuesta angiogénica en los embriones de pez cebra11 y, por lo tanto, son adecuadas para su uso en este protocolo.

  1. Cultivar células B16-F1 a 37 oC en un matraz de 75 cm2 utilizando medios MEM-o complementados con suero bovino fetal (FBS) a una concentración final de 10% (v/v) y penicilina /Estreptomicina, cada una a una concentración final de 100 g/ml.
  2. Retire el medio de un matraz de 75 cm2 de células B16-F1 confluente al 95-100% de las células B16-F1 y lave las células en 5 ml de solución salina con fosfato a temperatura ambiente (PBS).
  3. Retirar el PBS de 5 ml, añadir 2 ml de ácido trypsin/etilendiaminetetraacético a temperatura ambiente (EDTA) e incubar a 37oC durante 60 s.
  4. Toque el lado del matraz para determinar si las células están empezando a perder su fijación a la parte inferior del matraz.
  5. Añadir 8 ml de temperatura ambiente MEM-o con 10% FBS en el matraz, pipeta contra el interior del matraz para llevar las células que permanecen adheridas a la parte inferior del matraz en suspensión y pipeta la suspensión celular en un tubo de 15 ml.
  6. Centrifugar la suspensión celular a 800 x g, 4-8 oC durante 5 min, aspirar el medio y proceder al etiquetado de las células con tinte.

3. Etiquetado de células B16-F1 con tinte fluorescente

NOTA: Para diferenciar entre las células tumorales implantadas y otras células del embrión, las células tumorales deben estar etiquetadas con un tinte fluorescente adecuado antes de la implantación. Este paso se puede omitir si las celdas ya expresan reporteros fluorescentes.

  1. Incubar 2 ml de medios MEM-o libres de suero a 37 oC.
  2. Preparar una solución en stock del tinte elegido y diluirla en 2 ml preincubados de medios MEM-o libres de suero para realizar una concentración viable (ejemplos de tintes y concentraciones apropiadas para las células B16 F1 se proporcionan en la Tabla de Materiales).
  3. Pipetear 1 ml de la solución de tinte en el pellet celular (del paso 2.6), mezclar a fondo mediante pipeteo, luego añadir el otro 1 ml de solución de tinte y mezclar.
  4. Incubar las células y la mezcla de colorante a 37oC durante 40 min, mezclando suavemente agitando a 20 min.
  5. Centrifugar la suspensión celular a 800 x g, 4-8 oC durante 5 min.
  6. Aspirar el sobrenadante y lavar las células etiquetadas pipeteando con 5 ml de PBS.
  7. Centrifugar la suspensión celular de nuevo a 800 x g, 4-8 oC durante 5 min, aspirar el sobrenadante y colocar las células sobre hielo hasta que estén listas para la implantación.
    NOTA: El gránulo celular del tumor final debe tener un volumen de 20-40 l.

4. Preparación de embriones para la implantación

NOTA: Elija una línea transgénica de peces cebra que tenga vasos sanguíneos etiquetados fluorescentemente (por ejemplo, kdrl:RFP, fli1a:EGFP, etc.) 13 , 14.

  1. Dos días antes de la implantación, engendrar el pez cebra como se describió anteriormente y recoger los embriones15.
    NOTA: Como no estamos inyectando estos peces en una etapa temprana, no es necesario recogerlos dentro de los 20 minutos de desove como se describe en Rosen et al.15, pero pueden ser recogidos después de unas horas de apareamiento.
  2. Coloque los embriones en platos de cultivo de 100 mm a una densidad de aproximadamente 100 embriones/plato.
  3. Añadir 50 ml de E316 (complementado con 5 ml de una solución acuosa de 1% p/v de azul metileno para evitar la contaminación) a cada plato, limpiar los embriones o desechos muertos y mantener el plato en una incubadora oscura a 28 oC hasta que esté listo para la inyección.
  4. A 1 día después de la fertilización (dpf), añadir 1-fenil-2-tiourea (PTU) a cada plato para producir una concentración final de 30 mg/L PTU en E3. La PTU previene la pigmentación, que puede interferir con la capacidad de ver las células tumorales y los vasos sanguíneos.
  5. A 2 dpf, utilice agujas o pinzas para desenrodar manualmente cualquier embrión que esté desishado. Con un microscopio fluorescente, seleccione tantos embriones transgénicos como sea necesario para la xenografting (50-200).
  6. Antes de la implantación, anestesiar los embriones seleccionados en una solución de 300 g/ml de tricaína en E3 para evitar el movimiento durante el procedimiento de inyección.
  7. Llene un plato de 35 mm con un 2% de metilcelulosa en Solución E3 a una cuarta parte del volumen del plato.
  8. Utilice una pipeta de transferencia para colocar aproximadamente 50 embriones (minimizando el volumen de la solución E3 también transferida) a la metilcelulosa.
  9. Utilice una punta de pipeta Microloader para organizar los embriones de modo que todos estén orientados verticalmente, con las cabezas hacia la parte superior y con el lado izquierdo hacia arriba.
    NOTA: Los pasos 4.7-4.9 también se pueden llevar a cabo organizando los embriones en un bloque de agarosa como se describió anteriormente17,pero en nuestra experiencia, los embriones se organizan más fácilmente cuando se agrupan en metilcelulosa.

5. Inyección de perivelina de células cancerosas de mamíferos en embriones de 2 dpf

NOTA: Para asegurar que las células se agrupen como un injerto cuando se implantan, las células deben mezclarse junto con una mezcla de matriz extracelular (ECM). Hemos descrito los pasos para hacer una mezcla de celda/ECM al utilizar una mezcla de ECM a la que se hace referencia en la Tabla de Materiales. Si se utiliza una matriz alternativa, los pasos deben ajustarse en consecuencia.

  1. Divida un stock de ECM en alícuotas de 100 ol en tubos de 500 ml y guárdelo a -20 oC hasta que sea necesario.
  2. Descongelar una alícuota de ECM y añadir 100 l de PBS para diluir la mezcla al 50% (v/v).
    NOTA: El 50% ECM diluido se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 mes.
  3. Mezclar el 50% de ECM bien con el pellet celular B16-F1 (del paso 3.7) pipeteando y revolviendo, para producir una mezcla de células / ECM en una proporción de 2:1 y almacenar la mezcla en hielo.
  4. Con una pipeta microcapilar, tome una toma de 3-10 ml de células.
  5. Inserte cuidadosamente la punta de la pipeta en una aguja y expulse la mezcla B16-F1/matriz en el extremo de la aguja.
  6. Inserte la aguja en el porta agujas e incline en un ángulo de 45o con respecto al plato.
  7. Romper la punta de la aguja usando pinzas para hacer un agujero lo suficientemente grande como para que las células sean expulsadas de la aguja sin apretar las células.
  8. Encienda el cilindro de aire presurizado conectado al aparato de inyección y gire el inyector en modo "continuo" momentáneamente para empujar las células a la punta de la aguja.
  9. Retire la aguja del plato y sustituya el plato por un hemocitómetro.
  10. Coloque una gota de aceite en el hemocitómetro e inyecte la aguja una vez en esta gota.
  11. Cuente el número de células expulsadas con un solo pulso utilizando el hemocitómetro y calibre la aguja para expulsar aproximadamente 150 células por pulso ajustando la duración del pulso.
    NOTA: La expulsión de esta cantidad de células por pulso requerirá varios pulsos para implantar un xenoinjerto exitoso. Esto le dará al investigador un mayor control sobre el tamaño final del xenoinjerto tumoral al permitirle ajustar moderadamente el número/ubicación de pulsos para hacer cada xenoinjerto más grande o más pequeño como lo considere conveniente.
  12. Apunte la aguja hacia el saco de yema de un embrión y empújelo a través del saco de yema en dirección ventral hasta que la punta de la aguja haya salido del saco de yema y esté empujando la epidermis embrionaria en el lado ventral del embrión justo después del corazón.
    NOTA: Coloque la aguja de modo que entre en el saco de yema embrionaria anterior a la ubicación final donde se expulsarán las células. Esto asegurará que las células serán expulsadas en una dirección lejos del corazón, disminuyendo la probabilidad de inyectar las células en la vena cardinal común.
  13. Empuje cuidadosamente la punta de la aguja hacia adelante un poco hasta que haya creado un espacio (espacio perivielino) entre la epidermis y la membrana del saco de yema y luego presione el inyector para expulsar parte de la mezcla celular en el espacio perivielline.
  14. Repita los pulsos hasta que se hayan inyectado 500-800 células en el espacio perivelinal, creando una protuberancia visible que se extiende al menos la mitad del camino a lo largo de la parte inferior del saco de yema, luego retire la aguja del embrión.
    NOTA: Si las células bloquean la aguja o están dañadas durante la inyección, purgue la aguja cambiando momentáneamente al modo "continuo" y luego de nuevo al "pulso". Esto debe desbloquear la aguja y permitir que las células se expulsen libremente y sin daños.
  15. Continúe haciendo lo mismo para todos los embriones en el plato, cargando una nueva aguja con células tumorales cuando sea necesario.
  16. Después de inyectar todos los embriones, retire la aguja y empuje todos los embriones juntos usando una punta de pipeta microcapilar para que puedan ser pipetados con la menor metilcelulosa posible.
  17. Transfiera los embriones a un plato de recuperación que contenga E3 (con PTU y azul de metileno) y lávelos pipeteando suavemente E3 alrededor de los embriones.
    NOTA: En este punto, los embriones xenoinjerados pueden ser tratados con medicamentos separándolos en diferentes platos y añadiendo una solución de medicamentos a un plato y una solución de control (como el vehículo de drogas) al otro plato.
  18. Incubar los embriones a 34 oC y realizar controles dos veces al día para eliminar embriones muertos o edemasos del plato.
    NOTA: Se encontró que 34 oC era la temperatura óptima para la vascularización de xenoinjertos y también ha sido utilizado por otros estudios que emplean el modelo18de angiogénesis de xenoinjerto embrionario de peces cebra. Los xenoinjertos se pueden tomar imágenes en cualquier momento hasta 48 hpi (horas después de la implantación).

6. Imágenes en vivo

  1. A 48 hpi, identifique 3-5 embriones sanos sin edema. Anestetizarlos en 150 g/ml de tricaína y montarlos lateralmente en agarosa 1% Bajo Punto de Fusión (LMP) como se describió anteriormente19.
    NOTA: Como la agarosa se solidifica, utilice una punta de pipeta microcapilar para mantener los embriones posicionados lateralmente.
  2. Encienda el microscopio confocal, el controlador del microscopio, los láseres y el software informático para controlar el microscopio.
  3. Coloque el plato en un microscopio confocal. Usando un aumento de 20x, lente objetivo de inmersión de agua, coloque el xenoinjerto en el centro del campo usando imágenes de campo brillante.
  4. Seleccione los láseres de excitación que sean apropiados para detectar el tinte utilizado para etiquetar las células tumorales y el fluoróforo utilizado para etiquetar los vasos sanguíneos del pez cebra.
  5. Ajuste la ganancia de cada láser a un nivel que permita la detección de las células tumorales y los vasos sanguíneos.
    NOTA: Una vez establecidos los ajustes confocales, asegúrese de que se mantengan inalterados durante todo el experimento para que se puedan hacer comparaciones entre xenoinjertos.
  6. Usando el canal láser apropiado para las células tumorales, determine un volumen a fotorgarse que incluya todo el volumen del xenoinjerto, permitiendo al menos una o dos secciones ópticas a ambos lados del injerto. Utilice intervalos de sección que se encuentran a unos 5 m de distancia para crear una pila z.
    NOTA: Es esencial que la pila z contenga todo el volumen del xenoinjerto.
  7. Usando imágenes de dos canales, imagenide tanto el xenoinjerto tumoral como los vasos sanguíneos. Repita los pasos 6.6-6.7 para cada larva que se va a tomar una imagen.

7. Imágenes de lapso de tiempo

NOTA: Este modelo es muy adecuado para la creación de imágenes de procesos celulares dinámicos debido a su transparencia y la disponibilidad de transgénicos de pez cebra que etiquetan fluorescentemente diferentes tipos de células. Esto hace que la creación de imágenes de lapso de tiempo sea una aplicación clave de este modelo.

  1. Encienda la cámara ambiental y establézquela a 34 oC al menos 2 h antes de la toma de imágenes. Si la cámara no está humidificada, agregue platos de agua.
  2. Anestetiza 3-5 embriones (usando 120 g/ml de tricaína a 2 dpf y 100 g/mL de tricaína a 3 dpf) y embistelos lateralmente en un 0,8% de agarosa LMP para imágenes de lapso de tiempo según el protocolo descrito anteriormente19.
    NOTA: Como la agarosa se solidifica, utilice una punta de pipeta microcapilar para mantener los embriones posicionados lateralmente.
  3. Configure el equipo y la imagen del xenoinjerto como se describe en los pasos 6.2-6.7, adquiriendo pilas z del xenoinjerto a intervalos de 10 minutos.
    NOTA: El embrión debe mantenerse a 34 oC, ya que se está realizando la imagen, y el E3 en la parte superior de las larvas del agar debe comprobarse y complementarse ocasionalmente para asegurarse de que no se seque.

8. Cantidad de la respuesta angiogénica al xenoinjerto de pez cebra

NOTA: Los pasos siguientes utilizan el software de análisis de imágenes 3D. Los pasos específicos variarán dependiendo del software utilizado.

  1. Transfiera los archivos de imagen confocal z-stack de un xenoinjerto tumoral a una nueva carpeta en el software de análisis de imágenes 3D.
    NOTA: Con el fin de cuantificar los niveles de vascularización tumoral, los protocolos de medición deben crearse con ajustes calibrados para que puedan utilizarse para medir el volumen del tumor o el volumen del recipiente para todos los xenoinjertos.
  2. Para crear el protocolo "Tumor Volume" para medir el volumen de los xenoinjertos tumorales, vaya a la pestaña "Medida" en el menú superior y, a continuación, arrastre los protocolos denominados "Buscar objetos" de la lista de protocolos que aparece en el lado izquierdo de la ventana hasta el espacio que se titula "Arrastrar tareas aquí para hacer mediciones".
  3. Asegúrese de que este protocolo está configurado para medir objetos en el canal del tumor y, a continuación, arrastre los protocolos denominados "Clip to ROIs" y "Make ROI from Population" de la lista de protocolos al espacio "Arrastrar tareas aquí para realizar mediciones". Asegúrese de que estos dos comandos se aplican a los objetos identificados por "Buscar objetos."
  4. Antes de calibrar la configuración de este protocolo, vaya al menú desplegable situado encima de la etiqueta "Modo" en la parte superior izquierda de la ventana y seleccione la vista "Enfoque extendido".
  5. Anule la selección de los canales no tumorales en el panel del extremo derecho haciendo clic en el círculo negro debajo de cada encabezado de canal, de modo que solo se pueda ver el canal tumoral. Utilice la herramienta "Mano a mano alzada" en la parte superior de la ventana para dibujar una "región de interés" (ROI) alrededor de todo el volumen del tumor.
    NOTA: Tenga cuidado de asegurarse de que ninguno de los tumores se quede fuera del ROI. Esto proporcionará una región en la que realizar el protocolo mientras calibra la configuración.
  6. Seleccione la etiqueta "Resumen" en el panel debajo de la imagen y establezca la opción "Mostrar" para mostrar "Población 2". Para calibrar, haga clic en el asterisco en la tarea Buscar objetos, que abrirá la ventana de configuración. Ajuste el "Umbral" usando "Intensidad" y determinando el umbral "Inferior" hasta que solo se seleccionen las células tumorales y no la fluorescencia de fondo.
    NOTA: Esto es importante para que sólo se detecte la fluorescencia de las células tumorales en el ROI seleccionado (dibujado en 8.5) y no se mida ninguna de las fluorescencias de fondo.
  7. Determine el "Tamaño mínimo del objeto" de modo que solo se midan las celdas intactas en lugar de los elementos más pequeños de los desechos de celda (por ejemplo, estableciendo el "Tamaño mínimo del objeto" como 100 m3). Guarde este protocolo como "Volumen de tumor" haciendo clic en la pestaña Medidas en el menú superior y haciendo clic en "Guardar protocolo", y utilice la misma configuración para medir todos los xenoinjertos.
  8. Para medir el volumen de los vasos sanguíneos asociados al xenoinjerto, tendrá que crear un nuevo protocolo. Vaya al menú superior, haga clic en la pestaña Dimensiones y haga clic en "Borrar protocolo". Arrastre las tareas "Buscar objetos" y "Recortar a ROI" al espacio que se titula "Arrastrar tareas aquí para realizar mediciones" para este protocolo.
  9. Asegúrese de que el primer comando está configurado para medir objetos en el canal de los vasos sanguíneos y que el siguiente comando está configurado para aplicarse a los objetos identificados por el primer comando. A continuación, anule la selección de los canales no vasculares en el panel derecho para que solo se puedan ver los vasos sanguíneos.
  10. Determine la configuración del "Volumen del buque" de manera similar a la del protocolo "Volumen del tumor" y guarde este protocolo como "Volumen del buque" (véase 8.6-8.7).
  11. Despeje el protocolo y dibuje un ROI alrededor del xenoinjerto, teniendo cuidado de no incluir ninguna autofluorescencia no tumoral. Mida la suma del volumen de los objetos en el canal tumoral dentro de este ROI haciendo clic en la pestaña Dimensiones, seleccionando el comando "Restaurar protocolo" y eligiendo el protocolo "Tumor Volume".
  12. Usando el nuevo ROI hecho por el protocolo "Tumor Volume", utilice el protocolo "Vessel Volume" para medir el volumen total de objetos en el canal del buque dentro de este ROI haciendo clic en la pestaña Medidas, seleccionando el comando "Restaurar Protocolo" y eligiendo el comando "Recipiente" Volume".
  13. Divida el volumen del vaso por el volumen del tumor y multiplique la respuesta por 100 para obtener un valor porcentual de la vascularización del injerto.
  14. Repita los pasos 8.11 a 8.13 para todos los demás xenoinjertos.

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Resultados

Mediante la toma de imágenes de un xenoinjerto individual a 6, 24 y 48 hpi, la respuesta angiogénica en diferentes puntos de tiempo se puede calcular como se muestra en la Figura 1A-C. La respuesta angiogénica más grande se observa entre 24-48 h después de la implantación, con los niveles máximos de vascularización del injerto observados alrededor de 2 dpi (Figura1A-C). Una película de l...

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Discusión

El primer paso crítico en el protocolo es la implantación de células tumorales. Es esencial que las células se inyecten en un lugar que permita que el xenoinjerto se implante con éxito en el embrión sin hacer que el embrión sea edematoso. Una inyección demasiado anterior puede permitir que las células se muevan hacia el corazón, bloqueando el torrente sanguíneo y provocando edema, mientras que una inyección demasiado posterior dará lugar a un xenoinjerto mal implantado. Una inyección anterior se evita mejor...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al Sr. Alhad Mahagaonkar por administrar las instalaciones de peces cebra de la Universidad de Auckland y la Unidad de Investigación de Imágenes Biomédicas de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Auckland, por su asistencia en la microscopía confocal de lapso de tiempo. Este trabajo fue apoyado por una subvención del proyecto del Consejo de Investigación Sanitaria de Nueva Zelanda (14/105), una Beca de Proyecto del Fondo Marsden de la Royal Society of New Zealand (UOA1602) y una Beca de Proyecto de la Fundación de Investigación Médica de Auckland (1116012) otorgada a J.W.A.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Air cylinderBOC011GXenotransplantation
B16-F1 cellsATCCCell culture
BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture)Corning356235Xenotransplantation
Borosillicate glass capillariesWarner InstrumentsG100T-4OD = 1.00 mm, ID = 0.78 mm, Length = 10 cm Cell injection
Cell culture dish 35 mm diameterThermofisher NZNUN153066Fish husbandry
Cell culture dish 100 mm diameterSigma-AldrichCLS430167-500EAFish husbandry
Cell culture flask 75 cm2In Vitro TechnologiesCOR430641Cell culture
CellTracker GreenInvitrogenC2925Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media)
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418Drug treatment, Cell labelling
E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl

1.6 g KCl

5.8 g CaCl2·2H2O

9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH		In house [1]Fish husbandry
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)Sigma-AldrichE10521Xenotransplantation, Imaging
Filter tip 1,000 μLVWR732-1491Used during multiple steps
Filter tip 200 μLVWR732-1489Used during multiple steps
Filter tip 10 μLVWR732-1487Used during multiple steps
Fluorescence microscopeLeicaMZ16FAPreparation of embryos
FBS (NZ origin)Thermofisher Scientific10091148Cell culture
GlovesAny commercial brandUsed during multiple steps
Haemocytometer cell counting chamber Improved NeubauerHawksleyVetAC1000Xenotransplantation
Heraeus Multifuge X3R CentrifugeThermofisher Scientific75004500Cell culture, Cell labelling
Hoechst 33342Thermofisher Scientific62249Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media)
Low Melting Point, UltraPure AgaroseThermofisher Scientific16520050Imaging
MethycelluloseSigma-Aldrich9004 67 5Xenotransplantation
Methylene bluesigma-AldrichM9140Fish husbandry
Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillariesEppendorf5242956003Xenotransplantation
MicropipettesAny commercial brandUsed during multiple steps
Micropipette puller P 87Sutter InstrumentsXenotransplantation
Microscope cage incubatorOkolabTime-lapse imaging
MicrowaveAny commercial brandImaging
Mineral oilSigma-AldrichM3516Xenotransplantation
Minimal Essential Media (MEM) - alphaThermofisher Scientfic12561056Cell Culture
MPPI-2 Pressure InjectorApplied Scientific InstrumentationXenotransplantation
Narishige micromanipulatorNarishige GroupXenotransplantation
Nikon D Eclipse C1 Confocal MicroscopeNikonImaging
N-Phenylthiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629Fish husbandry
PBSGibco10010023Cell culture
Penicillin StreptomycinLife Technologies15140122Cell culture
S1 pipet fillerThermoscientific9501Cell culture
Serological stripette 10 mLCorning4488Cell culture
Serological stripette 25 mLCorning4489Cell culture
Serological stripette 5 mLCorning4485Cell culture
Serological stripette 2 mLCorning4486Cell culture
Terumo Needle 22 GAmtechSH 182Fish husbandry
Tissue culture incubatorThermofisher ScientficHeraCell 150iCell culture
Tivozanib (AV951)AVEO PharmaceuticalsDrug treatment
Transfer pipette 3 mLMedirayRL200CFish husbandry
Trypsin/EDTA (0.25%)Life TechnologiesT4049Cell culture
TweezersFine Science Tools11295-10Fish husbandry
Volocity Software (v6.3)Improvision/Perkin ElmerImage analysis

Referencias

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).
  3. Ribatti, D. Tumor Angiogenesis Assays. , 1st. edn, Humana Press. (2016).
  4. Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).
  5. He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).
  6. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  7. Astin, J. W., et al. Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting. Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).
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