בVivo הדמיה וככמת של התגובה המארחת אנגיוגנטית ב-Zebrafish גידול Xenografts

Summary

מטרת שיטה זו היא ליצור מודל vivo של אנגיוגנזה הגידול על ידי תאי גידול של השתלת מיונקים לתוך העובר הזרע כי יש מתויג כלים של כלי דם. על ידי הדמיה של השתל מבע כלים משויכים, מדידה כמותית של תגובת האנגיוגנטית ניתן להשיג.

Abstract

אנגיוגנזה הגידול הוא יעד מפתח של טיפול נגד סרטן ושיטה זו פותחה כדי לספק מודל חדש כדי ללמוד את התהליך הזה vivo. דג זברה מבע נוצר על ידי שתילת תאים סרטניים מהיונקים לתוך החלל perivitelline של יומיים-לאחר הפריה דג זברה עוברים, ואחריו על ידי מדידת היקף התגובה אנגיוגנטית נצפתה בנקודת הקצה ניסיוני עד יומיים אחרי ההשתלה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא היכולת לכמת במדויק את התגובה אנגיוגנטית מארח של דג את השתל. הדבר מאפשר בדיקה מפורטת של המנגנונים המולקולריים, כמו גם את התרומה המארחת לעומת הגידול לתגובה האנגיוגנטית. העוברים יכולים להיות חשופים למגוון טיפולים, כגון דגירה עם תרופות אנטי-אנגיוגנזה פוטנציאליות, כדי לחקור אסטרטגיות למניעת אנגיוגנזה של הגידול. תגובת האנגיוגנטית יכולה להיות גם בעלת התמונה החיה כדי לבחון תהליכים סלולאריים יותר דינמיים. הטכניקה הניסיונית יחסית בלתי תובענית, עלויות תחזוקה זולות של דג דג זברה וזמן ניסיוני קצר להפוך את המודל הזה שימושי במיוחד לפיתוח אסטרטגיות לתמרן אנגיוגנזה הגידול.

Introduction

אנגיוגנזה הוא אחד הסימנים הקלאסיים של סרטן ומייצג יעד של טיפול נגד סרטן^1,2. כדי ללמוד את התהליך הזה, xהשתלת מודלים של סרטן נוצרו על ידי השתלת תאים סרטניים היונקים לתוך בעלי חיים כגון עכברים³. מודל דג זברה מבע יש גם פיתח, אשר כרוך ההשתלה של תאים סרטניים לתוך 2 ימים הפריה לאחר (dpi) דג זברה אשר התוצאה צמיחה מהירה של כלי דם דג זברה לתוך השתל מבע.

פרוטוקול זה מתאר vivo דג זברה העובר גידול מודל מבע שבו התגובה אנגיוגנטית ניתן לכמת במדויק על פני השתל כולו מבע שיטה זו מאפשרת לחוקר לבחון, בvivo, את המנגנונים המולקולריים הממפינים את תגובת הגידול האנטי-אנגיוגנטית. היכולת הגנטית של דג דג זברה מאפשר את התרומה המארחת להיחקר, בעוד הבחירה של קווי הגידול השונים תאים מאפשר את תרומת הגידול לאנגיוגנזה גם להיבדק^5,6,7. בנוסף, כמו הזחלים דג זברה חדירות מולקולות קטנות, מעכבי מסלול ספציפי ניתן להשתמש או ספריות התרופות ניתן להקרנה כדי לזהות מעכבי הרומן של אנגיוגנזה הגידול^8,9,10, . בסדר, ¹¹

מודל העובר של הדג מציג יתרונות ייחודיים בהשוואה למודלים אחרים של היונקים האחרים. Zebrafish xשתלים הם זולים יותר לבצע, מספר גדול של בעלי חיים ניתן לבחון לחיות הדמיה תא מאפשר בדיקה מפורטת של התנהגות התא⁴. שלא כמו אחרים vivo מודלים, אשר דורשים עד כמה שבועות כדי להתבונן צמיחה כלי משמעותי, אנגיוגנזה ב-דג זברה xenografts ניתן לראות בתוך 24 h בעקבות השרשה^3,4. עם זאת, העדר מערכת חיסונית אדפטיבית מתחלקים, בעוד מועיל לשמור על השתל xenograft פירושו התגובה החיסונית אדפטיבית ותרומתו כלפי אנגיוגנזה הגידול לא ניתן לבחון. בנוסף, העדר של תאים סטרומה הגידול, חוסר היכולת להשתיל למריחה על הגידול ואת ההבדל בטמפרטורת התחזוקה בין התאים המרכיניים ותאי היונקים הם חולשות פוטנציאליות של שיטה זו. למרות זאת, היכולת המועלת של מודל זה להדמיה חיה והיכולת לכמת באופן מדויק את תגובת האנגיוגנטית הופכת אותו למועיל בצורה ייחודית ללימוד התהליכים הסלולאריים המייוסתים את האנגיוגנזה של הגידול בvivo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת מחטי מיקרוהזרקה

1. הפעל מיקרופיפטה והגדר את הפרמטרים הבאים (מכויל למודל פולר המיקרופיפטה המופיע ברשימת החומרים): חום, 680; משיכה, 75; מהירות, 40; זמן, 55; לחץ: 530.
2. מאבטח מזכוכית בורוסיליקט לתוך הפולר מיקרופיפטה ומשוך את הנימים כדי ליצור שתי מחטים. חזרו על מחטים רבות ככל הנדרש.

2. תרבית תאים לשרשה

הערה: בעת שימוש בפרוטוקול זה, כל התאים הסרטניים בסרטן יכול לשמש עבור השרשה לתוך עוברי דגים כגון xenografts. עם זאת, יש הרבה וריאציה בתגובה אנגיוגנטית הנגרמת בין קווי תאים שונים^5,11,12. B16-F1 מורטין תאים מלנומה הוכחו כדי לגרום תגובה אנגיוגנטית חזקה בעוברי דג בתוך¹¹ ולכן הם מתאימים לשימוש בפרוטוקול זה.

1. לגדול B16-F1 תאים ב 37 ° c ב 75 ס מ² בקבוקון באמצעות מדיה הגברת α בתוספת סרום שור העוברי (fbs) לריכוז הסופי של 10% (v/v) ו פניצילין/Streptomycin, כל אחד בריכוז הסופי של 100 Μg/mL.
2. הסר את המדיה מ 95-100% confluent 75 ס מ² בקבוקון של תאים B16-F1 ולשטוף את התאים ב 5 מ ל של טמפרטורת החדר פוספט מתכלה באגירה (PBS).
3. להסיר את 5 מ"ל PBS, להוסיף 2 מ ל של טמפרטורת החדר 0.25% טריפסין/ethilen60 37 amiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiis
4. הקש על צד הבקבוקון כדי לקבוע אם התאים מתחילים לאבד את ההחזקה שלהם לתחתית הבקבוקון.
5. הוסף 8 מ ל של טמפרטורת החדר הגברת-α עם 10% FBS לתוך הבקבוקון, פיפטה נגד הפנימי של הבקבוקון כדי להביא את כל התאים נשאר דבק לתחתית הבקבוקון לתוך ההשעיה ופיפטה הבולם התא לתוך 15 מ ל צינור.
6. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 800 x g, 4-8 ° צ' עבור 5 דקות, מתיף את התקשורת ולהמשיך לתוויות את התאים עם צבע.

3. התוויות B16-F1 תאים עם צבען פלורסנט

הערה: כדי להבדיל בין תאים סרטניים מושתל ותאים אחרים העובר, את התאים הסרטניים חייב להיות מתויג עם צבע פלורסנט המתאים לפני השרשה. ניתן לדלג על שלב זה אם התאים כבר מביעים כתבים פלואורסצנט.

1. דגירה 2 מ ל של מדיה-α ללא סרום ב37 ° c.
2. הכנת פתרון מניות של הצבע הנבחר ולדלל אותו בטרום הדגירה 2 מ ל של סרום-α חינם מדיה לבצע ריכוז מעשי (דוגמאות של צבעים וריכוזים מתאים B16 F1 תאים מסופקים בטבלה של חומרים).
3. פיפטה 1 מ ל של פתרון הצבע לתוך הגלולה התא (משלב 2.6), מערבבים ביסודיות על ידי ליטוף, ולאחר מכן להוסיף 1 מ ל של פתרון צבע ומערבבים.
4. מודיית את התאים ואת התערובת צבע ב 37 ° c עבור 40 דקות, ערבוב על ידי טלטול עדין ב 20 דקות.
5. צנטריפוגה את השעיית התא ב 800 x g, 4-8 ° צ' עבור 5 דקות.
6. ליטוף הסופר ולשטוף את התאים המסומנת על ידי מלטף עם 5 מ ל של PBS.
7. צנטריפוגה את ההשעיה התא שוב ב 800 x g, 4-8 ° צ' עבור 5 דקות, מרוב הסופרנטאנט ומניחים את התאים על הקרח עד מוכן השרשה.
   הערה: את הגלולה הסופית תא הגידול צריך נפח של 20-40 μL.

4. הכנת עוברים לשרשה

הערה: לבחור קו הטרנסגניים מלאה כי יש כלים פלואורוסקופים כלי דם (g. kdrl: RFP, fli1a: EGFP, וכו ') מיכל ^{בן 13 ,} . ^{ארבע עשרה}

1. יומיים לפני השרשה, משריצים את הדגים כפי שתוארו בעבר ואוספים את העוברים¹⁵.
   הערה: כפי שאנו לא מזריקים דגים אלה בשלב מוקדם, הם לא צריכים להיות שנאספו בתוך 20 דקות של השאיפה כפי שמתואר על ידי רוזן ואח '¹⁵, אבל ניתן לאסוף לאחר כמה שעות של הזדווגות.
2. מניחים את העוברים במנות התרבות 100 מ"מ בצפיפות של כ 100 עוברים/צלחת.
3. הוסף 50 mL של E3¹⁶ (בתוספת עם 5 μl של 1% w/v פתרון מניות מימית של מתילן כחול כדי למנוע זיהום) לכל מנה, לנקות את כל העוברים או פסולת מת לשמור את המנה בחממה כהה ב 28 ° צ' עד מוכן להזרקה.
4. ביום 1 פוסט הפריה (dpf), להוסיף 1-פניקסיל-2-thiourea (PTU) לכל מנה כדי לייצר ריכוז סופי של 30 מ"ג/L PTU ב E3. PTU מונע פיגמנטציה, אשר יכול להפריע את היכולת לראות את תאי הגידול ואת כלי הדם.
5. ב-2 dpf, השתמש במחטים או בפינצטה כדי לבטל באופן ידני את כל העוברים שלא בקעו. באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט, בחר כעוברים טרנסגניים רבים ככל הנדרש עבור השתלה (50-200).
6. לפני השרשה, הרדים העוברים שנבחרו בפתרון של 300 μg/mL Tricaine ב-E3 כדי למנוע תנועה במהלך הליך ההזרקה.
7. מילוי צלחת 35 מ"מ עם 2% מתילתאית בפתרון E3 לרבע הנפח של המנה.
8. השתמש בפיפטה העברה למקום כ 50 עוברים (למזער את נפח הפתרון E3 גם הועבר) על מתילתאית.
9. השתמש בעצת מיקרוטוען לסדר את העוברים כך שכולם יהיו מכוונים אנכית, עם הראש למעלה ועם הצד השמאלי הפונה כלפי מעלה.
   הערה: שלבים 4.7-4.9 יכולים גם להתבצע על ידי הסדרת העוברים על בלוק agarose כפי שתוארה בעבר¹⁷, אבל בניסיון שלנו, העוברים מסודרים בקלות רבה יותר כאשר מסודר מתילצלולוזה.

5. הזרקת פריבילין של תאים סרטניים ממאני לתוך 2 dpf עוברים

הערה: כדי להבטיח את התאים הנמצאים יחד כשתל כאשר מושתל, התאים חייבים להיות מעורבים יחד עם תערובת מטריצה מסחטות (ECM). תיארנו את הצעדים לעשיית כזה תא/ECM תערובת כאשר משתמשים בתערובת ECM בטבלת החומרים. אם נעשה שימוש במטריצה חלופית, יש לכוונן את השלבים בהתאם.

1. לחלק מלאי של ECM לתוך 100 μL האליבטים ב 500 מנורות μL ולאחסן ב-20 ° c עד הצורך.
2. להפשיר את סדרת מחלקים של ecm ולהוסיף 100 μl של PBS כדי לדלל את התערובת ל 50% (v/v).
   הערה: מדולל 50% ECM ניתן לאחסן ב 4 ° צ' עבור עד 1 חודש.
3. לערבב את 50% ECM טוב עם הגלולה B16-F1 (משלב 3.7) על ידי ליטוף וערבוב, כדי לייצר תערובת של תאים/ECM ביחס 2:1 ולאחסן את התערובת על הקרח.
4. באמצעות פיפטה מיקרונימי, קחו את 3-10 μL של תאים.
5. הכנס בזהירות את קצה הפיפטה למחט והוצא את התערובת B16-F1/מטריצה לסוף המחט.
6. הכנס את המחט לתוך המחט מחזיק להטות בזווית 45 ° אל המנה.
7. לשבור את קצה המחט באמצעות מלקחיים לעשות חור גדול מספיק עבור התאים להיות נפלט מן המחט מבלי לסחוט את התאים.
8. הפעל את גליל אוויר הלחץ מוצמד למנגנון ההזרקה ולהפוך את ההזרקה על "רציף" מצב מיד כדי לדחוף את התאים לקצה המחט.
9. להסיר את המחט מתוך המנה ולהחליף את המנה עם הומוציטומטר.
10. מניחים טיפה של שמן על ההטאמציטוטומטר ומזריקים את המחט פעם אחת על הירידה הזאת.
11. לספור את מספר התאים נפלט עם פעימה בודדת באמצעות הומוציטוטומטר ולכייל את המחט כדי להוציא כ 150 תאים לכל פעימה על ידי התאמת משך פעימה.
    הערה: הוצאת כמות זו של תאים לדופק ידרוש מספר פולסים כדי להשתיל השתלת xenograft וצלחת. זה ייתן החוקר יותר שליטה על הגודל הסופי של מבע הגידול על ידי מתן להם בינוני להתאים את מספר/מיקום של פולסים כדי להפוך כל מבע גדול או קטן ככל שהם רואים להתאים.
12. הצבע את המחט לעבר שק החלמון של העובר ולדחוף אותו דרך שק החלמון בכיוון הגחוני עד קצה המחט הגיח מתוך שק החלמון והוא דוחף את האפידרמיס העובריים על הצד הגחוני של העובר רק אחורי הלב.
    הערה: מיקום המחט כך שהוא נכנס שק החלמון עובריים הקדמי למיקום הסופי שבו התאים יוצאו. הדבר יבטיח כי התאים יוצאו בכיוון הרחוק מהלב, והפחתת הסבירות להזרקת התאים לתוך הווריד העיקרי.
13. בזהירות לדחוף את קצה המחט קדימה קצת עד שהוא יצר מרחב (מרחב perivitelline) בין האפידרמיס ואת קרום שק החלמון ולאחר מכן הדופק מזרק להוציא חלק התערובת התא לחלל perivitelline.
14. חזור על הפולסים עד 500-800 תאים הוזרק לחלל perivitelline, יצירת הבליטה גלוי המשתרע לפחות חצי הדרך לאורך החלק התחתון של שק החלמון, ולאחר מכן להסיר את המחט מן העובר.
    הערה: אם התאים לחסום את המחט או פגומים במהלך ההזרקה, לטהר את המחט על ידי החלפת רגע למצב "רציף" ולאחר מכן חזרה "פולס". זה צריך לבטל את חסימת המחט ולאפשר לתאים להיות נפלט בחופשיות ולא ניזוק.
15. להמשיך לעשות את אותו הדבר עבור כל העוברים בצלחת, טעינת מחט חדשה עם תאים סרטניים כאשר נדרש.
16. לאחר הזרקת כל העוברים, להסיר את המחט ולדחוף את כל העוברים יחד באמצעות טיפ מיקרונימים מיקרו, כך שהם יכולים להיות מוזרקים עם כמעט מתילתאית ככל האפשר.
17. להעביר את העוברים לתוך צלחת התאוששות המכילה E3 (עם PTU ו מתילן blue) ולשטוף אותם על ידי בעדינות ללטף E3 סביב העוברים.
    הערה: בשלב זה, ניתן לטפל בעוברים הניתנים לטיפול בסמים על-ידי הפרדתם לכלים שונים והוספת פתרון תרופה למנה אחת ופתרון בקרה (כגון רכב התרופות) למנה השנייה.
18. מודחת העוברים ב 34 ° c ולבצע פעמיים ביום בדיקות כדי להסיר עוברי מתים או מעוחים ממנה.
    הערה: 34 ° c נמצאה להיות הטמפרטורה האופטימלית עבור vascularization השתל והיה גם בשימוש על ידי מחקרים אחרים המעסיקים את הייצור העובזיזציה מתחלקים של מודל¹⁸. שתלי xenografts להיות מופיע בכל זמן עד 48 hpi (שעות שלאחר ההשתלה).

6. הדמיה חיה

1. ב 48 hpi, לזהות 3-5 עוברים בריאים ללא בצקת. הרדים אותם ב-150 μg/mL Tricaine ו הר אותם מתחת לגיל 1% נמוך התכה נקודה (LMP) agarose כפי שתוארה בעבר¹⁹.
   הערה: כאשר הצמח ממשיך להיות מיסודו, השתמש בעצת מיקרוקפילר כדי לשמור על העוברים ממוקמים מתחת לקצה.
2. הפעל את מיקרוסקופ הקונמוקד, בקר המיקרוסקופ, לייזרים ותוכנת המחשב לשליטה על המיקרוסקופ.
3. מניחים את המנה על מיקרוסקופ קונפאני. באמצעות הגדלה 20x, המים המטרה לטבול העדשה, מיקום מבע במרכז השדה באמצעות הדמיה ברייטפילד.
4. לייזרים עירור לבחור כי הם מתאימים לזיהוי הצבע המשמש תווית התאים הסרטניים ואת fluorophore המשמש לתייג את כלי הדם דג זברה.
5. להתאים את הרווח עבור כל לייזר לרמה המאפשרת איתור של תאי הגידול וגם כלי הדם.
   הערה: לאחר שנקבעו הגדרות מיקוד, להבטיח אלה נשמרים ללא שינוי במהלך הניסוי, כך השוואות ניתן לעשות בין השתלות xenografts
6. באמצעות ערוץ הלייזר המתאים לתאי הגידול, לקבוע נפח להיות התמונה הכוללת את כל הנפח של השתל xenograft המאפשר לפחות אחד או שניים מקטעים אופטיים או צד של השתל. השתמש במרווחי מקטע הנמצאים סביב 5 יקרומטר מלבד ליצירת מחסנית z.
   הערה: הכרחי כי מחסנית z צריך להכיל את כל הנפח של השתל xenograft
7. באמצעות שני הדמיה הערוץ, התמונה הן הגידול מבע ואת כלי הדם. חזור על שלבים 6.6-6.7 כדי שניתן יהיה לבצע דימות של כל זחל.

7. פקיעה זמן הדמיה

הערה: מודל זה מתאים מאוד לדימות תהליכים סלולריים דינמיים בשל השקיפות שלה ואת הזמינות של מעבר הדגים דג זברה זה תווית סוגי תאים שונים. זה הופך את מעידה בזמן דימות יישום מפתח של מודל זה.

1. הפעל את החדר הסביבתי והגדר עד 34 ° c לפחות 2 שעות לפני ההדמיה. אם החדר אינו מחולל לחות, הוסיפו מנות מים.
2. הרדים 3-5 עוברים (באמצעות 120 μg/mL Tricaine ב 2 dpf ו 100 μg/mL Tricaine ב 3 dpf) ו הר אותם באופן משני בשנת 0.8% LMP agarose עבור הדמיה זמן לשגות בהתאם לפרוטוקול המתואר בעבר¹⁹.
   הערה: כאשר הצמח ממשיך להיות מיסודו, השתמש בעצת מיקרוקפילר כדי לשמור על העוברים ממוקמים מתחת לקצה.
3. הגדר את הציוד ואת התמונה של מבע כפי שמתואר בשלבים 6.2-6.7, רכישת z-ערימות של השתל מבע מרווחי זמן של 10 דקות.
   הערה: העובר חייב להיות מתוחזק ב 34 ° c כפי שהוא להיות בתמונה ואת E3 על גבי הזחלים באגר חייב להיבדק מדי פעם כדי להבטיח כי זה לא להתייבש.

8. כימות המענה האנטי-אנגיוגנטי לדגי הזייברפיש

הערה: השלבים הבאים משתמשים בתוכנת ניתוח תמונה תלת-ממדית. שלבים ספציפיים ישתנו בהתאם לתוכנה שבשימוש.

1. העבר את מחסנית z קבצי תמונה מוקד של מבע הגידול לתיקייה חדשה בתוכנת ניתוח תמונה תלת-ממדית.
   הערה: על מנת לכמת את רמות הגידול של גידולים, פרוטוקולי מדידה חייב להיווצר עם הגדרות מכויל כך שניתן להשתמש בהם כדי למדוד את נפח הגידול או נפח הספינה עבור כל שתלי xenografts
2. כדי ליצור את "נפח הגידול" פרוטוקול למדידת נפח של xenografts תלי הגידול, ללכת על הכרטיסייה "מדידה" בתפריט העליון ולאחר מכן לגרור את הפרוטוקולים בשם "מצא אובייקטים" מתוך רשימת הפרוטוקולים המופיעה בצד שמאל של החלון לחלל שכותרתו "גרור משימות כאן כדי לבצע מדידות".
3. ודא שפרוטוקול זה מוגדר למדוד אובייקטים בערוץ הגידול, ולאחר מכן גרור את הפרוטוקולים הנקראים "קליפ ל-ROIs" ו-"הפוך את ROI מהאוכלוסייה" מרשימת הפרוטוקולים אל "גרור פעילויות כאן כדי להפוך את המידות" למרחב. ודא ששתי פקודות אלה חלות על האובייקטים שזוהו על-ידי "חיפוש אובייקטים".
4. לפני כיול ההגדרות של פרוטוקול זה, עבור אל התפריט הנפתח מעל לתווית "Mode" שמשמאל לקצה החלון ובחר בתצוגה "מוקד מורחב".
5. בטל את הבחירה בערוצים שאינם סרטניים בחלונית בקצה הימני על-ידי לחיצה על העיגול השחור שמתחת לכל כותרת הערוץ, כך שרק ערוץ הגידול יכול להיראות. השתמש בכלי "ביד חופשית" בחלק העליון של החלון כדי לצייר "אזור של עניין" (ROI) סביב כל נפח הגידול.
   הערה: לדאוג להבטיח כי אף אחד מהגידול לא נשאר מתוך ההחזר. פעולה זו תספק אזור לביצוע הפרוטוקול בעת כיול ההגדרות.
6. בחרו בתווית ' תקציר ' בחלונית שמתחת לתמונה, וקבעו את האפשרות ' הצג ' כדי להציג ' אוכלוסייה 2 '. כדי לכייל, לחץ על הכוכבית במשימה חפש אובייקטים, שתפתח את חלון ההגדרות. כוונן את "הסף" באמצעות "עוצמה" וקביעת הסף "התחתון" עד שרק תאי הגידול ייבחרו ולא את הזריחה ברקע.
   הערה: זה חשוב כך שרק את הזריחה מן התאים הסרטניים ב ROI הנבחר (שצויר ב-8.5) מזוהה ואף אחד לא הזריחה הרקע נמדד.
7. קבע את "גודל האובייקט המינימלי" כך שרק תאים שלמים נמדדים בניגוד לפריטים קטנים יותר של פסולת תא (לדוגמה, על-ידי הגדרת "גודל האובייקט המינימלי" כ-100 יקרומטר³). שמור פרוטוקול זה כמו "נפח גידול" על-ידי לחיצה על הכרטיסיה מדידות בתפריט העליון ולחיצה על "שמור פרוטוקול", ולהשתמש באותן הגדרות למדידת כל שתלי xenografts
8. כדי למדוד את עוצמת הקול של כלי הדם הקשורים xenograft, יהיה עליך ליצור פרוטוקול חדש. עבור אל התפריט העליון, לחץ על הכרטיסיה מדידות ולחץ על "נקה פרוטוקול". גרור את המשימות "חפש אובייקטים" ו-"קליפ אל ROIs" לתוך השטח הנקרא "גרור משימות כאן כדי לבצע מדידות" עבור פרוטוקול זה.
9. ודא שהפקודה הראשונה מוגדרת למדידת אובייקטים בערוץ כלי הדם ושהפקודה הבאה מוגדרת להחלה על האובייקטים שזוהו על-ידי הפקודה הראשונה. לאחר מכן בטלו את הבחירה בערוצים שאינם כלי קיבול בחלונית השמאלית הרחוקה, כך שרק כלי הדם יכולים להיראות.
10. קבע את ההגדרות עבור "עוצמת הקיבול" באופן דומה לפרוטוקול "עוצמת הגידול" ושמור פרוטוקול זה כ"אמצעי אחסון" (ראה 8.6-8.7).
11. נקה את הפרוטוקול וצייר ROI סביב השתל xenograft לוקח לדאוג לא לכלול את כל הגידול האוטומטי שאינם סרטניים. מדוד את סכום הנפח של האובייקטים בערוץ הגידול בתוך ROI זה על ידי לחיצה על הכרטיסיה מדידות, בחירת הפקודה "שחזור פרוטוקול" ובחירה בפרוטוקול "נפח גידול".
12. באמצעות התשואה החדשה שבוצעו על-ידי פרוטוקול "נפח גידול", השתמש בפרוטוקול "נפח קיבול" כדי למדוד את הנפח הכולל של אובייקטים בערוץ כלי בתוך ROI זה על ידי לחיצה על הכרטיסיה מדידות, בחירת הפקודה "שחזור פרוטוקול" ובחירה "כלי פרוטוקול.
13. לחלק את נפח הספינה על ידי נפח הגידול ולהכפיל את התשובה על ידי 100 כדי לקבל ערך באחוזים של השתל שכפול.
14. חזור על שלבים 8.11 כדי 8.13 עבור כל שתלי xenografts.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

על-ידי הדמיה של השתלת מניות בודדות ב-6, 24 ו-48 hpi, ניתן לחשב את תגובת האנגיוגנטי בנקודות זמן שונות כמוצג באיור 1A-C. התגובה הגדולה ביותר של אנגיוגנטי נצפתה בין 24-48 h השתלת פוסט, עם רמות מקסימלית של השתל vascularization לראות סביב 2 dpi (איור 1A-C...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הצעד הקריטי הראשון בפרוטוקול הוא השרשה של תאי הגידול. חיוני כי התאים מוזרק לתוך מיקום שיאפשר מבע להשתיל בהצלחה העובר מבלי להפוך את העובר מתרפס. זריקה הקדמי מדי יכול לאפשר לתאים לנוע לעבר הלב, חסימת הדם והמוביל בצקת, בעוד הזרקה כי הוא האחורי יותר מדי יגרום מושתל לקוי xenograft. הזרקה קדמית היא הט...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air cylinder	BOC	011G	Xenotransplantation
B16-F1 cells	ATCC		Cell culture
BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture)	Corning	356235	Xenotransplantation
Borosillicate glass capillaries	Warner Instruments	G100T-4	OD = 1.00 mm, ID = 0.78 mm, Length = 10 cm Cell injection
Cell culture dish 35 mm diameter	Thermofisher NZ	NUN153066	Fish husbandry
Cell culture dish 100 mm diameter	Sigma-Aldrich	CLS430167-500EA	Fish husbandry
Cell culture flask 75 cm2	In Vitro Technologies	COR430641	Cell culture
CellTracker Green	Invitrogen	C2925	Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media)
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418	Drug treatment, Cell labelling
E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH	In house [1]		Fish husbandry
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521	Xenotransplantation, Imaging
Filter tip 1,000 μL	VWR	732-1491	Used during multiple steps
Filter tip 200 μL	VWR	732-1489	Used during multiple steps
Filter tip 10 μL	VWR	732-1487	Used during multiple steps
Fluorescence microscope	Leica	MZ16FA	Preparation of embryos
FBS (NZ origin)	Thermofisher Scientific	10091148	Cell culture
Gloves	Any commercial brand		Used during multiple steps
Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer	HawksleyVet	AC1000	Xenotransplantation
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge	Thermofisher Scientific	75004500	Cell culture, Cell labelling
Hoechst 33342	Thermofisher Scientific	62249	Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media)
Low Melting Point, UltraPure Agarose	Thermofisher Scientific	16520050	Imaging
Methycellulose	Sigma-Aldrich	9004 67 5	Xenotransplantation
Methylene blue	sigma-Aldrich	M9140	Fish husbandry
Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries	Eppendorf	5242956003	Xenotransplantation
Micropipettes	Any commercial brand		Used during multiple steps
Micropipette puller P 87	Sutter Instruments		Xenotransplantation
Microscope cage incubator	Okolab		Time-lapse imaging
Microwave	Any commercial brand		Imaging
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M3516	Xenotransplantation
Minimal Essential Media (MEM) - alpha	Thermofisher Scientfic	12561056	Cell Culture
MPPI-2 Pressure Injector	Applied Scientific Instrumentation		Xenotransplantation
Narishige micromanipulator	Narishige Group		Xenotransplantation
Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope	Nikon		Imaging
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	Fish husbandry
PBS	Gibco	10010023	Cell culture
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	Cell culture
S1 pipet filler	Thermoscientific	9501	Cell culture
Serological stripette 10 mL	Corning	4488	Cell culture
Serological stripette 25 mL	Corning	4489	Cell culture
Serological stripette 5 mL	Corning	4485	Cell culture
Serological stripette 2 mL	Corning	4486	Cell culture
Terumo Needle 22 G	Amtech	SH 182	Fish husbandry
Tissue culture incubator	Thermofisher Scientfic	HeraCell 150i	Cell culture
Tivozanib (AV951)	AVEO Pharmaceuticals		Drug treatment
Transfer pipette 3 mL	Mediray	RL200C	Fish husbandry
Trypsin/EDTA (0.25%)	Life Technologies	T4049	Cell culture
Tweezers	Fine Science Tools	11295-10	Fish husbandry
Volocity Software (v6.3)	Improvision/Perkin Elmer		Image analysis