Imaging in vivo e quantitazione dell'ospite risposta angiogenica in Xenogrfts tumore zebrati

Riepilogo

Lo scopo di questo metodo è quello di generare un modello in vivo di angiogenesi tumorale xenotrapianto di cellule tumorali dei mammiferi in un embrione di pesce zebra che ha vasi sanguigni etichettati fluorescentmente. Esaminando lo xenotrapianto e i vasi associati, è possibile ottenere una misurazione quantitativa della risposta angiogenica.

Abstract

L'angiogenesi tumorale è un obiettivo chiave della terapia anti-cancro e questo metodo è stato sviluppato per fornire un nuovo modello per studiare questo processo in vivo. Uno xenotrapianto di pesce zebra viene creato impiantando cellule tumorali dei mammiferi nello spazio perivitelline di due giorni dopo la fecondazione degli embrioni di pesce zebra, seguito misurando l'entità della risposta angiogenica osservata in un endpoint sperimentale fino a due giorni post-impianto. Il vantaggio principale di questo metodo è la capacità di quantizzare con precisione la risposta angiogenica dell'ospite del pesce zebra all'innesto. Ciò consente un esame dettagliato dei meccanismi molecolari e del contributo ospite vs tumorale alla risposta angiogenica. Gli embrioni xenointrapsi a possono essere sottoposti a una varietà di trattamenti, come l'incubazione con potenziali farmaci anti-angiogenesi, al fine di studiare strategie per inibire l'angiogenesi tumorale. La risposta angiogenica può anche essere live-immagine al fine di esaminare processi cellulari più dinamici. La tecnica sperimentale relativamente poco impegnativa, i costi di manutenzione a basso costo del pesce zebra e la breve linea temporale sperimentale rendono questo modello particolarmente utile per lo sviluppo di strategie per manipolare l'angiogenesi tumorale.

Introduzione

L'angiogenesi è uno dei segni distintivi classici del cancro e rappresenta un obiettivo della terapia anti-cancro^1,2. Per studiare questo processo, sono stati creati modelli di xenotrapianto di cancro impiantando cellule tumorali di mammiferi in animali come i topi³. È stato inoltre sviluppato un modello di xenotrapianto di pesce zebra, che prevede l'impianto di cellule tumorali in 2 giorni dopo la fecondazione (dpi) pesce zebra che si traduce in una rapida crescita dei vasi sanguigni del pesce zebra nello xenotrapianto⁴.

Questo protocollo descrive un modello di xenotrapianto dell'embrione di pesce zebra in vivo in cui la risposta angiogenica può essere quantificata con precisione nell'intero xenotrapianto. Questo metodo consente allo sperimentatore di esaminare, in vivo, i meccanismi molecolari alla base della risposta angiogenica tumorale. La trattatibilità genetica del pesce zebra permette di interrogare il contributo dell'ospite, mentre la selezione didiverse linee cellulari tumorali permette di esaminare anche il contributo del tumore all'angiogenesi 5^,6,7. Inoltre, poiché le larve di pesce zebra sono permeabili a piccole molecole, è possibile utilizzare inibitori specifici della via o vagliare le librerie di farmaci per identificare nuovi inibitori dell'angiogenesi tumorale^{8,9,10, 11}.

Il modello xenotrapianto embrionale di zebra presenta vantaggi unici rispetto ad altri modelli di xenotrapianto mammifero. Gli xenografi di pesce zebra sono più economici e più facili da eseguire, è possibile esaminare un gran numero di animali e l'imaging delle cellule vive consente un esame dettagliato del comportamento cellulare⁴. A differenza di altri modelli in vivo, che richiedono fino a diverse settimane per osservare una crescita significativa del vaso, l'angiogenesi negli xenografi del pesce zebra può essere osservata entro 24 h dopo l'impianto^3,4. Tuttavia, la mancanza di un sistema immunitario adattivo nel pesce zebra embrionale, pur conile nel mantenimento dello xenotrapianto, significa che la risposta immunitaria adattativa e il suo contributo all'angiogenesi tumorale non possono essere esaminati. Inoltre, la mancanza di cellule stromali tumorali, l'incapacità di impiantare ortotopicamente il tumore e la differenza di temperatura di mantenimento tra il pesce zebra e le cellule dei mammiferi sono potenziali punti deboli di questo metodo. Ciò nonostante, l'amenabilità di questo modello per l'imaging dal vivo e la capacità di quantificare con precisione la risposta angiogenica lo rende particolarmente vantaggioso per lo studio dei processi cellulari che regolano l'angiogenesi tumorale in vivo.

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Protocollo

1. Preparazione degli aghi di microiniezione

1. Accendere un tiratore di micropipette e impostare i seguenti parametri (calibrato per il modello di espellere micropipette elencato nella Tabella dei materiali): Calore, 680; Tirare, 75; Velocità, 40; Tempo, 55; Pressione: 530.
2. Fissare un capillare di vetro borosilicato nell'eschetto micropipette e tirare il capillare per fare due aghi. Ripetere l'operazione per tutti gli aghi desiderati.

2. Coltura cellulare per l'impianto

NOT: Quando si utilizza questo protocollo, qualsiasi linea cellulare del cancro dei mammiferi può essere utilizzata per l'impianto in embrioni di pesce zebra come xenografi. Tuttavia, c'è molta variazione nella risposta angiogenica indotta tra diverse linee cellulari^5,11,12. È stato dimostrato che le cellule di melanoma murine B16-F1 inducono una forte risposta angiogenica negli embrioni di pesce zebra¹¹ e sono quindi appropriate per l'uso in questo protocollo.

1. Coltivare le cellule B16-F1 a 37 cm in una fiaschetta di 75 cm^{e 2} utilizzando un supporto MEM-z, integrata con siero fetale bovino (FBS) a una concentrazione finale del 10% (v/v) e Penicillin /Streptomycin, ciascuna ad una concentrazione finale di 100 g/mL.
2. Rimuovere il supporto da un flacone 95-100% confluente 75 cm² di cellule B16-F1 e lavare le cellule in 5 mL di salina con buffer fosfato a temperatura ambiente (PBS).
3. Rimuovere il PBS da 5 mL, aggiungere 2 mL di temperatura ambiente 0,25% Trypsin/ acido etilenediaminetracetico (EDTA) e incubare a 37 gradi centigradi per 60 s.
4. Toccare il lato del pallone per determinare se le cellule stanno cominciando a perdere il loro attaccamento alla parte inferiore del pallone.
5. Aggiungere 8 mL di temperatura ambiente MEM-z con 10% FBS nel pallone, pipetta contro l'interno del pallone per portare tutte le cellule che rimangono aderenti al fondo del pallone in sospensione e pipetta la sospensione cellulare in un tubo da 15 mL.
6. Centrifugare la sospensione cellulare a 800 x g, 4-8 s C per 5 min, aspirare il supporto e procedere all'etichettatura delle cellule con colorante.

3. Etichettatura delle celle B16-F1 con colorante fluorescente

NOT: Per distinguere tra le cellule tumorali impiantate e le altre cellule dell'embrione, le cellule tumorali devono essere etichettate con un colore fluorescente appropriato prima dell'impianto. Questo passaggio può essere saltato se le cellule esprimono già giornalisti fluorescenti.

1. Incubare 2 mL di MEM-smaciola senza siero a 37 gradi centigradi.
2. Preparare una soluzione di riserva del colorante scelto e diluirla in mezzi MEM-z senza sciometto pre-incubati per realizzare una concentrazione praticabile (esempi di coloranti e concentrazioni appropriati per le cellule B16 F1 sono forniti nella Tabella dei Materiali).
3. Pipetta 1 mL della soluzione di tintura nel pellet cellulare (dal passaggio 2.6), mescolare accuratamente pipettando, quindi aggiungere l'altro 1 mL di soluzione di tintura e mescolare.
4. Incubare le cellule e la miscela di tintura a 37 gradi centigradi per 40 min, mescolando dolcemente a 20 min.
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 800 x g, 4-8 s C per 5 min.
6. Aspirare il supernatante e lavare le cellule etichettate pipettando con 5 mL di PBS.
7. Centrifugare nuovamente la sospensione cellulare a 800 x g, 4-8 gradi centigradi per 5 min, aspirare il supernatante e posizionare le cellule sul ghiaccio fino a quando non sono pronte per l'impianto.
   NOT: Il pellet finale della cellula tumorale dovrebbe avere un volume di 20-40.L.

4. Preparazione di embrioni per l'impianto

NOT: Scegliere una linea di pesci zebra transgenici con vasi sanguigni etichettati fluorescentmente (ad esempio kdrl:RFP, fli1a:EGFP, ecc.) ¹³ del sistema ^{, 14}.

1. Due giorni prima dell'impianto, deporre le uova del pesce zebra come descritto in precedenza e raccogliere gli embrioni¹⁵.
   NOT: Poiché non stiamo iniettando questi pesci in una fase precoce, non hanno bisogno di essere raccolti entro 20 min di deposizione delle uova come descritto da Rosen et al.¹⁵, ma possono essere raccolti dopo poche ore di accoppiamento.
2. Mettere gli embrioni in piatti di coltura da 100 mm ad una densità di circa 100 embrioni/piatto.
3. Aggiungere 50 mL di E3¹⁶ (completati con 5 oluna di una soluzione di riserva di 1% w/v di blu di metilene per evitare la contaminazione) ad ogni piatto, pulire eventuali embrioni o detriti morti e tenere il piatto in un'incubatrice scura a 28 gradi centigradi fino a quando non è pronto per l'iniezione.
4. A 1 giorno dopo la fecondazione (dpf), aggiungere 1-fenil-2-thiourea (PTU) ad ogni piatto per produrre una concentrazione finale di 30 mg/L PTU in E3. PTU previene la pigmentazione, che può interferire con la capacità di visualizzare le cellule tumorali e vasi sanguigni.
5. A 2 dpf, utilizzare aghi o pinzette per dechorionate manualmente tutti gli embrioni che non sono schiusi. Utilizzando un microscopio fluorescente, selezionare tutti gli embrioni transgenici necessari per lo xenotrapianto (50-200).
6. Prima dell'impianto, anatetizzare gli embrioni selezionati in una soluzione di 300 g/mL di Tricaine in E3 al fine di prevenire il movimento durante la procedura di iniezione.
7. Riempire un piatto da 35 mm con un 2% di metilcellulosa in soluzione E3 per un quarto del volume del piatto.
8. Utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare circa 50 embrioni (riducendo al minimo il volume della soluzione E3 anche trasferiti) sulla metilcellulosa.
9. Utilizzare una punta pipetta Microloader per disporre gli embrioni in modo che siano tutti orientati verticalmente, con le teste verso l'alto e con il lato sinistro rivolto verso l'alto.
   NOT: I passi 4.7-4.9 possono essere effettuati anche disponendo gli embrioni su un blocco di agarose come descritto in precedenza¹⁷, ma secondo la nostra esperienza, gli embrioni sono più facilmente disposti quando disposti in metilcellulosa.

5. Iniezione perivitelina delle cellule tumorali dei mammiferi in 2 embrioni dpf

NOT: Per garantire che le cellule si aggregano come un innesto quando impiantate, le cellule devono essere mescolate insieme a una miscela di matrice extracellulare (ECM). Abbiamo descritto i passaggi per fare una tale miscela di cellule / ECM quando si utilizza una miscela ECM a cui si fa riferimento nella Tabella dei Materiali. Se si utilizza una matrice alternativa, i passaggi devono essere regolati di conseguenza.

1. Dividere uno stock di ECM in 100 aliquote in 500 tubi l e conservare a -20 gradi centigradi fino a quando necessario.
2. Scongelare un'aliquota di ECM e aggiungere 100 L di PBS per diluire la miscela al 50% (v/v).
   NOT: Il 50% di diluito ECM può essere immagazzinato a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese.
3. Mescolare bene il 50% ECM con il pellet a cellule B16-F1 (dal punto 3.7) pipettando e mescolando, per produrre una miscela di cellule/ECM in un rapporto 2:1 e conservare la miscela sul ghiaccio.
4. Utilizzando una pipetta microcapillare, occupano 3-10 l. di cellule.
5. Inserire con attenzione la punta della pipetta in un ago ed espellere la miscela B16-F1/matrice all'estremità dell'ago.
6. Inserire l'ago nel portaaago e inclinarlo con un angolo di 45 gradi rispetto al piatto.
7. Rompere la punta dell'ago utilizzando una pinzetta per fare un buco abbastanza grande per le cellule da espellere dall'ago senza spremere le cellule.
8. Accendere il cilindro d'aria pressurizzato collegato all'apparato di iniezione e attivare momentaneamente l'iniettore in modalità "continua" per spingere le cellule sulla punta dell'ago.
9. Togliere l'ago dal piatto e sostituire il piatto con un emocitometro.
10. Mettere una goccia di olio sull'emocitometro e iniettare l'ago una volta su questa goccia.
11. Contare il numero di cellule espulse con un singolo impulso utilizzando l'emocitometro e calibrare l'ago per espellere circa 150 cellule per impulso regolando la durata dell'impulso.
    NOT: L'espulsione di questa quantità di cellule per impulso richiederà diversi impulsi per impiantare con successo uno xenotrapianto. Questo darà al ricercatore un maggiore controllo sulla dimensione finale dello xenotrapianto tumorale permettendo loro di regolare moderatamente il numero / posizione degli impulsi per rendere ogni xenotrapianto più grande o più piccolo come meglio credono.
12. Puntare l'ago verso il sacco del tuorlo di un embrione e spingerlo attraverso il sacco del tuorlo in una direzione ventrale fino a quando la punta dell'ago è emersa dal sacco del tuorlo e sta spingendo l'epidermide embrionale sul lato ventrale dell'embrione appena posteriore al cuore.
    NOT: Posizionare l'ago in modo che entri nel sacco del tuorlo embrionale anteriore alla posizione finale in cui le cellule verranno espulse. Questo farà in modo che le cellule saranno espulse in una direzione lontano dal cuore, diminuendo la probabilità di iniettare le cellule nella vena cardinale comune.
13. Spingere con attenzione la punta dell'ago in avanti un po 'fino a creare uno spazio (spazio perivitelina) tra l'epidermide e la membrana sac del tuorlo e poi pulsare l'iniettore per espellere parte della miscela cellulare nello spazio perivitelina.
14. Ripetere gli impulsi fino a quando 500-800 cellule sono state iniettate nello spazio perivitelina, creando un rigonfiamento visibile che si estende almeno la metà del percorso lungo il fondo del sacco del tuorlo, quindi rimuovere l'ago dall'embrione.
    NOT: Se le cellule bloccano l'ago o sono danneggiate durante l'iniezione, svuotare l'ago passando momentaneamente alla modalità "continua" e quindi di nuovo a "impulso". Questo dovrebbe sbloccare l'ago e consentire alle cellule di essere espulse liberamente e intatte.
15. Continuare a fare lo stesso per tutti gli embrioni nel piatto, caricando un nuovo ago con cellule tumorali quando necessario.
16. Dopo aver iniettato tutti gli embrioni, rimuovere l'ago e spingere tutti gli embrioni insieme utilizzando una punta di pipetta microcapillare in modo che possano essere pipettati con il minor numero possibile di metilcellulososa.
17. Trasferire gli embrioni in un piatto di recupero contenente E3 (con PTU e blu di metilene) e lavarli con il pipificamento dolcemente E3 intorno agli embrioni.
    NOT: A questo punto, gli embrioni xenoinneto possono essere trattati con farmaci separandoli in piatti diversi e aggiungendo una soluzione farmacologica a un piatto e una soluzione di controllo (come il veicolo antidroga) all'altro piatto.
18. Incubare gli embrioni a 34 gradi centigradi ed eseguire due volte i controlli giornalieri per rimuovere gli embrioni morti o adedematosi dal piatto.
    NOTA: è stata ritenuta la temperatura ottimale per la vascolarizzazione dello xenotrapianto ed è stato utilizzato anche da altri studi che utilizzano l'angiogenesi xenotrapianto embrionale del pesce zebra¹⁸. Gli xenogratto possono essere immagine in qualsiasi momento fino a 48 hpi (ore dopo l'impianto).

6. Immagini dal vivo

1. A 48 hpi, identificare 3-5 embrioni sani senza edema. Anasthetizzare in 150 g/mL Tricaine e montarli lateralmente in 1% Low Melting Point (LMP) agarose come precedentemente descritto¹⁹.
   NOT: Mentre l'agarose si sta solidificando, utilizzare una punta di pipetta microcapillare per mantenere gli embrioni posizionati lateralmente.
2. Accendere il microscopio confocale, il controllore del microscopio, i laser e il software informatico per il controllo del microscopio.
3. Posizionare il piatto al microscopio confocale. Utilizzando un ingrandimento 20x, l'obiettivo di immersione dell'acqua, posizionare lo xenotrapianto al centro del campo utilizzando l'imaging del campo luminoso.
4. Selezionare i laser di eccitazione appropriati per rilevare il tinrito utilizzato per etichettare le cellule tumorali e il fluoroforo utilizzato per etichettare i vasi sanguigni del pesce zebra.
5. Regolare il guadagno per ogni laser ad un livello che consente il rilevamento di entrambe le cellule tumorali e i vasi sanguigni.
   NOT: Una volta stabilite le impostazioni confocali, assicurarsi che siano mantenute invariate durante l'esperimento in modo da poter fare confronti tra gli xenogrini.
6. Utilizzando il canale laser appropriato per le cellule tumorali, determinare un volume da immaginare che include l'intero volume dello xenotrapianto, consentendo almeno una o due sezioni ottiche su entrambi i lati dell'innesto. Utilizzare intervalli di sezione che si trovano a circa 5 m di distanza per creare uno z-stack.
   NOT: È essenziale che lo z-stack contenga l'intero volume dello xenotrapianto.
7. Utilizzando l'imaging a due canali, immagini sia lo xenotrapianto tumorale che i vasi sanguigni. Ripetere i passaggi da 6.6 a 6.7 per ogni larva da immaginare.

7. Immagine time Lapse

NOT: Questo modello è molto adatto per l'imaging di processi cellulari dinamici grazie alla sua trasparenza e alla disponibilità di transgenici di pesci zebra che etichettano fluorescentmente diversi tipi di cellule. Questo rende l'imaging time-lapse un'applicazione chiave di questo modello.

1. Accendere la camera ambientale e impostare a 34 gradi centigradi almeno 2 h prima dell'imaging. Se la camera non è umidificata, aggiungere piatti d'acqua.
2. Anestesizza 3-5 embrioni (utilizzando 120 Tricaine a 2 dpf e 100 Tricaine a 3 dpf) e montali lateralmente in 0,8% di Agarose per l'imaging time-lapse secondo il protocollo precedentemente descritto¹⁹.
   NOT: Mentre l'agarose si sta solidificando, utilizzare una punta di pipetta microcapillare per mantenere gli embrioni posizionati lateralmente.
3. Impostare l'attrezzatura e l'immagine dello xenotrapianto come descritto nei passaggi 6.2-6.7, acquisendo z-stack s dello xenotrapianto a intervalli di 10 min.
   NOT: L'embrione deve essere mantenuto a 34 gradi centigradi mentre viene immaginato e l'E3 sopra le larve in agar deve essere controllato e integrato occasionalmente per garantire che non si asciughi.

8. Quantitazione della risposta angiogenica al pesce zebra Xenograft

NOTA: i passaggi seguenti utilizzano il software di analisi delle immagini 3D. I passaggi specifici variano a seconda del software utilizzato.

1. Trasferire i file di immagine confocale z-stack di uno xenotrapianto tumorale in una nuova cartella sul software 3D Image Analysis.
   NOT: Per quantificare i livelli di vascolarizzazione del tumore, i Protocolli di misurazione devono essere creati con impostazioni calibrate in modo che possano essere utilizzati per misurare il volume del tumore o il volume del vaso per tutti gli xenotraptanti.
2. Per creare il protocollo "Volume tumorale" per misurare il volume degli xenopifti tumorali, vai alla scheda "Misurazione" nel menu in alto e trascina i protocolli denominati "Trova oggetti" dall'elenco dei protocolli che appare sul lato sinistro della finestra verso lo spazio che si intitola "Trascinare le attività qui per effettuare le misurazioni".
3. Assicurarsi che questo protocollo sia impostato per misurare gli oggetti nel canale del tumore, quindi trascinare i protocolli denominati "Clip to ROIs" e "Make ROI from Population" dall'elenco dei protocolli allo spazio "Drag tasks here to make measurements". Assicurarsi che questi due comandi si applichino agli oggetti identificati da "Trova oggetti".
4. Prima di calibrare le impostazioni di questo protocollo, vai al menu a discesa sopra l'etichetta "Mode" in alto a sinistra della finestra e seleziona la vista "Extended Focus".
5. Deselezionare i canali non tumorali nel riquadro all'estrema destra facendo clic sul cerchio nero sotto ogni intestazione del canale, in modo che solo il canale tumorale può essere visto. Utilizzare lo strumento "Mano libera" nella parte superiore della finestra per disegnare una "regione di interesse" (ROI) intorno a tutto il volume del tumore.
   NOT: Fare attenzione a garantire che nessuno del tumore è lasciato fuori dal ROI. Questo fornirà un'area su cui eseguire il protocollo durante la calibrazione delle impostazioni.
6. Selezionare l'etichetta "Riepilogo" nel pannello sotto l'immagine e impostare l'opzione "Visualizza" per visualizzare "Popolazione 2". Per calibrare, fare clic sull'asterisco nell'attività Trova oggetti, che si aprirà la finestra delle impostazioni. Regolare la "Soglia" utilizzando "Intensità" e determinando la soglia "Inferiore" fino a quando non vengono selezionate solo le cellule tumorali e non la fluorescenza di fondo.
   NOT: Questo è importante in modo che venga rilevata solo la fluorescenza delle cellule tumorali nel ROI selezionato (estratto in 8.5) e non viene misurata alcuna fluorescenza di fondo.
7. Determinare la "Dimensione minima dell'oggetto" in modo che solo le celle intatte vengano misurate rispetto agli elementipiù piccoli di detriti cellulari (ad esempio impostando "Dimensione minima dell'oggetto" su 100 m 3). Salvare questo protocollo come "Volume del tumore" facendo clic sulla scheda Misure nel menu in alto e facendo clic su "Salva protocollo" e utilizzare le stesse impostazioni per misurare tutti gli xenotrapianto.
8. Per misurare il volume dei vasi sanguigni associati allo xenotrapianto, è necessario creare un nuovo protocollo. Vai al menu in alto, fai clic sulla scheda Misure e fai clic su "Cancella protocollo". Trascinare le attività "Trova oggetti" e "Ritaglia in ROI" nello spazio intitolato "Trascina le attività qui per effettuare misurazioni" per questo protocollo.
9. Assicurarsi che il primo comando sia impostato per misurare gli oggetti nel canale del vaso sanguigno e che il seguente comando sia impostato per applicare agli oggetti identificati dal primo comando. Quindi deselezionare i canali non-nave nel riquadro di estrema destra in modo che solo i vasi sanguigni possono essere visti.
10. Determinare le impostazioni per il "Volume del vaso" in modo simile al protocollo "Volume del tumore" e salvare questo protocollo come "Volume del vaso" (vedere 8.6-8.7).
11. Cancellare il protocollo e disegnare un ROI intorno allo xenotrapianto, avendo cura di non includere alcuna autofluorescenza non-tumorale. Misurare la somma del volume degli oggetti nel canale tumorale all'interno di questo ROI facendo clic sulla scheda Misure, selezionando il comando "Ripristina protocollo" e scegliendo il protocollo "Volume tumorale".
12. Utilizzando il nuovo ROI realizzato dal protocollo "Volume del tumore", utilizzare il protocollo "Volume del vaso" per misurare il volume totale degli oggetti nel canale del vaso all'interno di questo ROI facendo clic sulla scheda Misure, selezionando il comando "Ripristina protocollo" e scegliendo il pulsante "Vessel Volume" protocollo.
13. Dividere il volume del vaso per il volume del tumore e moltiplicare la risposta per 100 per ottenere un valore percentuale di vascolarizzazione dell'innesto.
14. Ripetere i passaggi da 8.11 a 8.13 per tutti gli altri xenogri.

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Risultati

Esaminando un singolo xenotrapianto a 6, 24 e 48 hpi, la risposta angiogenica a diversi orari può essere calcolata come mostrato nella Figura 1A-C. La più grande risposta angiogenica si osserva tra 24-48 h dopo l'impianto, con i livelli massimi di vascolarizzazione del trapianto osservati intorno ai 2 dpi (Figura 1A-C). Un filmato time-lapse di una tipica risposta angiogenica a un B16-F1 xenotr...

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Discussione

Il primo passo critico nel protocollo è l'impianto delle cellule tumorali. È essenziale che le cellule vengano iniettate in un luogo che consenta allo xenotrapianto di impiantare con successo nell'embrione senza rendere l'embrione edematoso. Un'iniezione troppo anteriore può permettere alle cellule di muoversi verso il cuore, bloccando il flusso sanguigno e portando all'edema, mentre un'iniezione troppo posteriore si tradurrà in uno xenotrapianto impiantato male. Un'iniezione anteriore è meglio evitare inserendo l'a...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air cylinder	BOC	011G	Xenotransplantation
B16-F1 cells	ATCC		Cell culture
BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture)	Corning	356235	Xenotransplantation
Borosillicate glass capillaries	Warner Instruments	G100T-4	OD = 1.00 mm, ID = 0.78 mm, Length = 10 cm Cell injection
Cell culture dish 35 mm diameter	Thermofisher NZ	NUN153066	Fish husbandry
Cell culture dish 100 mm diameter	Sigma-Aldrich	CLS430167-500EA	Fish husbandry
Cell culture flask 75 cm2	In Vitro Technologies	COR430641	Cell culture
CellTracker Green	Invitrogen	C2925	Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media)
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418	Drug treatment, Cell labelling
E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH	In house [1]		Fish husbandry
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521	Xenotransplantation, Imaging
Filter tip 1,000 μL	VWR	732-1491	Used during multiple steps
Filter tip 200 μL	VWR	732-1489	Used during multiple steps
Filter tip 10 μL	VWR	732-1487	Used during multiple steps
Fluorescence microscope	Leica	MZ16FA	Preparation of embryos
FBS (NZ origin)	Thermofisher Scientific	10091148	Cell culture
Gloves	Any commercial brand		Used during multiple steps
Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer	HawksleyVet	AC1000	Xenotransplantation
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge	Thermofisher Scientific	75004500	Cell culture, Cell labelling
Hoechst 33342	Thermofisher Scientific	62249	Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media)
Low Melting Point, UltraPure Agarose	Thermofisher Scientific	16520050	Imaging
Methycellulose	Sigma-Aldrich	9004 67 5	Xenotransplantation
Methylene blue	sigma-Aldrich	M9140	Fish husbandry
Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries	Eppendorf	5242956003	Xenotransplantation
Micropipettes	Any commercial brand		Used during multiple steps
Micropipette puller P 87	Sutter Instruments		Xenotransplantation
Microscope cage incubator	Okolab		Time-lapse imaging
Microwave	Any commercial brand		Imaging
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M3516	Xenotransplantation
Minimal Essential Media (MEM) - alpha	Thermofisher Scientfic	12561056	Cell Culture
MPPI-2 Pressure Injector	Applied Scientific Instrumentation		Xenotransplantation
Narishige micromanipulator	Narishige Group		Xenotransplantation
Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope	Nikon		Imaging
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	Fish husbandry
PBS	Gibco	10010023	Cell culture
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	Cell culture
S1 pipet filler	Thermoscientific	9501	Cell culture
Serological stripette 10 mL	Corning	4488	Cell culture
Serological stripette 25 mL	Corning	4489	Cell culture
Serological stripette 5 mL	Corning	4485	Cell culture
Serological stripette 2 mL	Corning	4486	Cell culture
Terumo Needle 22 G	Amtech	SH 182	Fish husbandry
Tissue culture incubator	Thermofisher Scientfic	HeraCell 150i	Cell culture
Tivozanib (AV951)	AVEO Pharmaceuticals		Drug treatment
Transfer pipette 3 mL	Mediray	RL200C	Fish husbandry
Trypsin/EDTA (0.25%)	Life Technologies	T4049	Cell culture
Tweezers	Fine Science Tools	11295-10	Fish husbandry
Volocity Software (v6.3)	Improvision/Perkin Elmer		Image analysis