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Résumé

Le but de cette méthode est de générer un modèle in vivo de l'angiogenèse tumorale en xénogreffer les cellules tumorales mammifères dans un embryon de poisson zèbre qui a des vaisseaux sanguins fluorescents étiquetés. En imagerie du xénogreffe et des vaisseaux associés, une mesure quantitative de la réponse angiogénique peut être obtenue.

Résumé

L'angiogenèse tumorale est une cible clé de la thérapie anticancéreuse et cette méthode a été développée pour fournir un nouveau modèle pour étudier ce processus in vivo. Un xénogreffe de poisson zèbre est créé en implantant des cellules de tumeur de mammifères dans l'espace périvitelline de deux jours-post-fertilisation des embryons de poisson-zèbre, suivi par mesurer l'ampleur de la réponse angiogénique observée à un point final expérimental jusqu'à deux jours post-implantation. L'avantage clé de cette méthode est la capacité de quantifier avec précision la réponse angiogénique hôte de l'hôte de l'hôte zébré à la greffe. Cela permet un examen détaillé des mécanismes moléculaires ainsi que la contribution hôte vs tumeur à la réponse angiogénique. Les embryons xénogreffes peuvent être soumis à une variété de traitements, tels que l'incubation avec des médicaments anti-angiogenèse potentiels, afin d'étudier les stratégies pour inhiber l'angiogenèse tumorale. La réponse angiogénique peut également être en direct afin d'examiner des processus cellulaires plus dynamiques. La technique expérimentale relativement peu exigeante, les coûts d'entretien bon marché du poisson zèbre et la chronologie expérimentale courte rendent ce modèle particulièrement utile pour le développement de stratégies pour manipuler l'angiogenèse de tumeur.

Introduction

L'angiogenèse est l'une des caractéristiques classiques du cancer et représente une cible de la thérapie anticancéreuse1,2. Pour étudier ce processus, des modèles de xénogreffe du cancer ontété créés en implantant des cellules de tumeur de mammifères dans des animaux tels que des souris 3. Un modèle de xénogreffe de poisson zèbre a également été développé, qui implique l'implantation des cellules de tumeur dans 2 joursaprès la fertilisation (dpi) le poisson zèbre qui a comme conséquence la croissance rapide des vaisseaux sanguins de poissons-zèbres dans le xénogreffe 4.

Ce protocole décrit un modèle in vivo de tumeur d'embryon de poisson-zèbre xénogreffe dans lequel la réponse angiogénique peut être exactement quantite à travers le xénogreffe entier. Cette méthode permet à l'investigateur d'examiner, in vivo, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la réponse angiogénique de tumeur. La tractabilité génétique du poisson zèbre permet d'interroger la contribution de l'hôte, tandis que la sélection de différentes lignées de cellules tumorales permet d'examiner la contribution tumorale à l'angiogenèse5,6,7. En outre, comme les larves de poissons zèbres sont perméables à de petites molécules, des inhibiteurs de voie spécifiques peuvent être utilisés ou les bibliothèques de médicaments peuvent être examinés pour identifier de nouveaux inhibiteurs de l'angiogenèse tumorale8,9,10, 11.

Le modèle de xénogreffe d'embryon de poisson zèbre présente des avantages uniques comparés à d'autres modèles de xénogreffe de mammifères. Les xénogreffes de poisson zèbre sont moins chères et plus faciles à exécuter, un grand nombre d'animaux peuvent être examinés et l'imagerie cellulaire vivante permet un examen détaillé du comportement cellulaire4. Contrairement à d'autres modèles in vivo, qui nécessitent jusqu'à plusieurs semaines pour observer une croissance significative des vaisseaux, l'angiogenèse chez les xénogreffes de poissons zèbres peut être observée dans les 24 h suivant l'implantation3,4. Cependant, l'absence d'un système immunitaire adaptatif chez le poisson zèbre embryonnaire, bien que bénéfique au maintien de la xénogreffe, signifie que la réponse immunitaire adaptative et sa contribution à l'angiogenèse tumorale ne peuvent pas être examinées. En outre, l'absence de cellules stromales tumorales, l'incapacité d'implanter orthotopiquement la tumeur et la différence de température d'entretien entre le poisson zèbre et les cellules mammifères sont des faiblesses potentielles de cette méthode. Néanmoins, l'agréabilité de ce modèle pour la formation image vivante et la capacité de quantifier avec précision la réponse angiogénique le rend particulièrement salutaire pour étudier les processus cellulaires qui règlent l'angiogenèse de tumeur in vivo.

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Protocole

1. Préparation d'aiguilles à microinjection

  1. Allumez un puller micropipette et définiz les paramètres suivants (calibrés pour le modèle de traction de micropipette énumérés dans table des matériaux) : chaleur, 680 ; Tirez, 75; Vitesse, 40; Temps, 55; Pression: 530.
  2. Fixer un capillaire en verre borosilicate dans le puller micropipette et tirer le capillaire pour faire deux aiguilles. Répétez l'opération pour autant d'aiguilles que désiré.

2. Culture cellulaire pour l'implantation

REMARQUE: Lors de l'utilisation de ce protocole, n'importe quelle lignée de cellules cancéreuses de mammifères peut être employée pour l'implantation dans des embryons de poissons zèbres comme xénogreffes. Cependant, il y a beaucoup de variation dans la réponse angiogénique induite entre différentes lignées cellulaires5,11,12. Les cellules de mélanome murine de B16-F1 ont été montrées pour induire une réponse angiogénique forte dans les embryons de poisson zèbre11 et sont donc appropriées pour l'usage dans ce protocole.

  1. Cultivez des cellules B16-F1 à 37 oC dans un flacon de 75 cm2 à l'aide d'un média MEM-MD complété par du sérum bovin fœtal (SGF) jusqu'à une concentration finale de 10 % (v/v) et de pénicilline/streptomycine, chacune à une concentration finale de 100 g/mL.
  2. Retirez le support d'un confluent de 95 à 100 % 75 cm2 flacons de cellules B16-F1 et lavez les cellules dans 5 ml de salin tamponné par le phosphate (PBS) à température ambiante.
  3. Retirer le PBS de 5 ml, ajouter 2 ml de température ambiante 0,25 % De trypsine/acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) et incuber à 37 oC pour 60 s.
  4. Appuyez sur le côté du flacon pour déterminer si les cellules commencent à perdre leur attachement au fond du flacon.
  5. Ajouter 8 ml de MEM-MD à température ambiante avec 10% de FBS dans le flacon, pipette contre l'intérieur du flacon pour amener toutes les cellules qui restent adhérées au fond du flacon dans la suspension et pipette la suspension de la cellule dans un tube de 15 ml.
  6. Centrifuger la suspension cellulaire à 800 x g, 4-8 oC pendant 5 min, aspirer le support et procéder à l'étiquetage des cellules avec du colorant.

3. Étiquetage des cellules B16-F1 avec colorant fluorescent

REMARQUE: Afin de différencier entre les cellules tumorales implantées et d'autres cellules dans l'embryon, les cellules tumorales doivent être étiquetées avec un colorant fluorescent approprié avant l'implantation. Cette étape peut être ignorée si les cellules expriment déjà des journalistes fluorescents.

  1. Incuber 2 ml de meM-MD sans sérum à 37 oC.
  2. Préparer une solution de stock du colorant choisi et le diluer dans 2 ml pré-incubés de mlacés de meM-MD pour faire une concentration réalisable (des exemples de colorants et de concentrations appropriés pour les cellules B16 F1 sont fournis dans tableau des matériaux).
  3. Pipette 1 ml de la solution de colorant dans la pastille cellulaire (à partir de l'étape 2.6), bien mélanger par pipetting, puis ajouter l'autre 1 ml de solution de colorant et mélanger.
  4. Incuber les cellules et colorer le mélange à 37 oC pendant 40 min, en mélangeant par une secousse douce à 20 min.
  5. Centrifugelant la suspension cellulaire à 800 x g, 4-8 oC pendant 5 min.
  6. Aspirer le supernatant et laver les cellules étiquetées par pipetting avec 5 ml de PBS.
  7. Centrifuger la suspension cellulaire à nouveau à 800 x g, 4-8 oC pendant 5 min, aspirer le supernatant et placer les cellules sur la glace jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à être implantées.
    REMARQUE: La pastille finale de cellules tumorales devrait avoir un volume de 20-40 L.

4. Préparation d'embryons pour l'implantation

REMARQUE: Choisissez une lignée transgénique de poisson zèbre qui a des vaisseaux sanguins étiquetés fluorescents (p. ex. kdrl:RFP, fli1a:EGFP, etc.) 13 (en) , 14.

  1. Deux jours avant l'implantation, frayer le poisson zèbre tel que décrit précédemment et recueillir les embryons15.
    REMARQUE: Comme nous n'injectons pas ces poissons à un stade précoce, ils n'ont pas besoin d'être recueillis dans les 20 minutes de frai comme décrit par Rosen et al.15, mais peuvent être recueillis après quelques heures d'accouplement.
  2. Placez les embryons dans des plats de culture de 100 mm à une densité d'environ 100 embryons/plat.
  3. Ajouter 50 ml d'E316 (complété par 5 l d'une solution de 1 % w/v de stock aqueux de bleu méthylène pour prévenir la contamination) à chaque plat, nettoyer les embryons ou débris morts et garder le plat dans un incubateur sombre à 28 oC jusqu'à ce qu'il soit prêt à être injecté.
  4. À 1 jour après la fécondation (dpf), ajouter 1-phényl-2-thiourea (PTU) à chaque plat pour produire une concentration finale de 30 mg/L PTU dans E3. PTU empêche la pigmentation, qui peut interférer avec la capacité de voir les cellules tumorales et les vaisseaux sanguins.
  5. À 2 dpf, utilisez des aiguilles ou des pinces pour déchorioiser manuellement tous les embryons qui ne sont pas éclos. À l'aide d'un microscope fluorescent, sélectionnez autant d'embryons transgéniques que nécessaire pour le xénogreffe (50-200).
  6. Avant l'implantation, anesthésiser les embryons sélectionnés dans une solution de 300 'g/mL Tricaine dans L'E3 afin d'empêcher le mouvement pendant la procédure d'injection.
  7. Remplir un plat de 35 mm d'une méthylcellulose de 2 % dans la solution E3 jusqu'à un quart du volume du plat.
  8. Utilisez une pipette de transfert pour placer environ 50 embryons (minimisant le volume de la solution E3 également transférée) sur la méthylcellulose.
  9. Utilisez une pointe de pipette Microloader pour organiser les embryons de sorte qu'ils soient tous orientés verticalement, avec les têtes vers le haut et avec le côté gauche tourné vers le haut.
    REMARQUE: Les étapes 4.7-4.9 peuvent également être effectuées en arrangeant les embryons sur un bloc d'agarose comme décrit précédemment17,mais d'après notre expérience, les embryons sont plus facilement disposés lorsqu'ils sont disposés en méthylcellulose.

5. Injection périvitelline de cellules cancéreuses de mammifères dans 2 embryons dpf

REMARQUE: Pour s'assurer que les cellules s'agglutinent comme une greffe lorsqu'elles sont implantées, les cellules doivent être mélangées avec un mélange de matrice extracellulaire (ECM). Nous avons décrit les étapes de la fabrication d'un tel mélange de cellules/ECM lors de l'utilisation d'un mélange ECM référencé dans le Tableau des Matériaux. Si une matrice alternative est utilisée, les étapes doivent être ajustées en conséquence.

  1. Diviser un stock d'ECM en 100 aliquots ll dans des tubes de 500 l et les stocker à -20 oC jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires.
  2. Décongeler un aliquot d'ECM et ajouter 100 L de PBS pour diluer le mélange à 50% (v/v).
    REMARQUE: L'ECM dilué de 50 % peut être stocké à 4 oC jusqu'à 1 mois.
  3. Bien mélanger le 50 % d'ECM avec le granule de cellules B16-F1 (à partir de l'étape 3.7) en pipetilage et en remuant, pour produire un mélange de cellules/ECM dans un rapport de 2:1 et entreposer le mélange sur la glace.
  4. À l'aide d'une pipette microcapillaire, prendre 3-10 l de cellules.
  5. Insérez soigneusement la pointe de la pipette dans une aiguille et éjecter le mélange B16-F1/matrice à l'extrémité de l'aiguille.
  6. Insérez l'aiguille dans le porte-aiguille et inclinez-la à un angle de 45 degrés par rapport au plat.
  7. Casser la pointe de l'aiguille à l'aide d'une pince à épiler pour faire un trou assez grand pour que les cellules soient éjectées de l'aiguille sans presser les cellules.
  8. Allumez le cylindre d'air pressurisé attaché à l'appareil d'injection et tournez l'injecteur en mode « continu » momentanément pour pousser les cellules à l'extrémité de l'aiguille.
  9. Retirer l'aiguille du plat et le remplacer par un hémocytomètre.
  10. Placez une goutte d'huile sur l'hémocytomètre et injectez l'aiguille une fois sur cette goutte.
  11. Comptez le nombre de cellules éjectées avec une seule impulsion à l'aide de l'hémocytomètre et calibrez l'aiguille pour éjecter environ 150 cellules par impulsion en ajustant la durée de l'impulsion.
    REMARQUE: L'éjection de cette quantité de cellules par pouls nécessitera plusieurs impulsions afin d'implanter un xénogreffe réussi. Ceci donnera au chercheur plus de contrôle sur la taille finale du xénogreffe de tumeur en lui permettant d'ajuster modérément le nombre/emplacement des impulsions pour rendre chaque xénogreffe plus grand ou plus petit comme bon leur semble.
  12. Pointez l'aiguille vers le sac jaune d'un embryon et poussez-la à travers le sac jaune dans une direction ventrale jusqu'à ce que la pointe de l'aiguille ait émergé du sac jaune et pousse l'épiderme embryonnaire sur le côté ventral de l'embryon juste postérieur au cœur.
    REMARQUE: Placez l'aiguille de sorte qu'elle pénètre dans le sac de jaune embryonnaire antérieur à l'endroit final où les cellules seront éjectées. Cela permettra de s'assurer que les cellules seront éjectées dans une direction éloignée du cœur, diminuant ainsi la probabilité d'injecter les cellules dans la veine cardinale commune.
  13. Poussez soigneusement la pointe de l'aiguille vers l'avant un peu jusqu'à ce qu'elle ait créé un espace (espace périvitelline) entre l'épiderme et la membrane du sac jaune, puis impulsiondez l'injecteur pour éjecter une partie du mélange cellulaire dans l'espace périvitelline.
  14. Répétez les impulsions jusqu'à ce que 500-800 cellules aient été injectées dans l'espace périvitelline, créant un renflement visible qui s'étend au moins la moitié du chemin le long du fond du sac jaune, puis retirez l'aiguille de l'embryon.
    REMARQUE: Si les cellules bloquent l'aiguille ou sont endommagées pendant l'injection, purgez l'aiguille en passant momentanément en mode « continu » puis de nouveau en « impulsion ». Cela devrait débloquer l'aiguille et permettre aux cellules d'être éjectées librement et intactes.
  15. Continuer à faire la même chose pour tous les embryons dans le plat, le chargement d'une nouvelle aiguille avec des cellules tumorales au besoin.
  16. Après l'injection de tous les embryons, retirez l'aiguille et poussez tous les embryons ensemble à l'aide d'une pointe de pipette microcapillaire afin qu'ils puissent être pipetted avec aussi peu de méthylcellulose que possible.
  17. Transférer les embryons dans un plat de récupération contenant de l'E3 (avec PTU et bleu méthylène) et les laver en faisant glisser doucement l'E3 autour des embryons.
    REMARQUE: À ce stade, les embryons xénogreds peuvent être traités avec des médicaments en les séparant en différents plats et en ajoutant une solution médicamentelle à un plat et une solution de contrôle (comme le véhicule médicamenteux) à l'autre plat.
  18. Incuber les embryons à 34 oC et effectuer deux contrôles par jour pour enlever les embryons morts ou œdémiques du plat.
    REMARQUE : 34 oC s'est avéré être la température optimale pour la vascularisation de xénogreffe et a également été employé par d'autres études employant le modèle embryonnaire d'angiogenèse embryonnaire de poisson-zèbre18. Les xénogreffes peuvent être photographiés à tout moment jusqu'à 48 hpi (heures post-implantation).

6. Imagerie en direct

  1. À 48 hpi, identifiez 3-5 embryons sains sans oedème. Anesthésiez-les en Tricaine de 150 g/mL et montez-les latéralement dans 1 % d'agarose Low Melting Point (LMP) comme décrit précédemment19.
    REMARQUE: Comme l'agarose se solidifie, utilisez une pointe de pipette microcapillaire pour garder les embryons positionnés latéralement.
  2. Allumez le microscope confocal, le contrôleur de microscope, les lasers et le logiciel d'ordinateur pour commander le microscope.
  3. Déposer le plat sur un microscope confocal. À l'aide d'un grossissement de 20x, l'eau plongeant la lentille objective, placez le xénogreffe au centre du champ en utilisant l'imagerie de brightfield.
  4. Sélectionnez les lasers d'excitation qui sont appropriés pour détecter le colorant utilisé pour étiqueter les cellules tumorales et le fluorophore utilisé pour étiqueter les vaisseaux sanguins du poisson zèbre.
  5. Ajuster le gain pour chaque laser à un niveau qui permet la détection des cellules tumorales et les vaisseaux sanguins.
    REMARQUE: Une fois que les paramètres confocals ont été établis, assurez-vous qu'ils restent inchangés tout au long de l'expérience afin que des comparaisons puissent être faites entre les xénogreffes.
  6. En utilisant le canal laser approprié pour les cellules tumorales, déterminer un volume à imager qui comprend le volume entier de la xénogreffe, permettant au moins une ou deux sections optiques de chaque côté de la greffe. Utilisez des intervalles de section distants d'environ 5 m pour créer une pile z.
    REMARQUE: Il est essentiel que la z-pile contienne tout le volume du xénogreffe.
  7. À l'aide de la formation image à deux canaux, imageàz à la fois la xénogreffe tumorale et les vaisseaux sanguins. Répétez les étapes 6.6-6.7 pour chaque larve à imager.

7. Imagerie Time Lapse

REMARQUE: Ce modèle est très adapté à l'imagerie des processus cellulaires dynamiques en raison de sa transparence et de la disponibilité de transgéniques de poissons zèbres qui étiquetent fluorescentement différents types de cellules. Cela fait de l'imagerie en accéléré une application clé de ce modèle.

  1. Allumez la chambre environnementale et fixez-la à 34 oC au moins 2 h avant l'imagerie. Si la chambre n'est pas humidifiée, ajouter des plats d'eau.
  2. Anesthésiez 3 à 5 embryons (en utilisant 120 tricaines g/mL à 2 dpf et 100 g/mL Tricaine à 3 dpf) et montez-les latéralement en agarose LMP de 0,8 % pour l'imagerie en accéléré selon le protocole précédemment décrit19.
    REMARQUE: Comme l'agarose se solidifie, utilisez une pointe de pipette microcapillaire pour garder les embryons positionnés latéralement.
  3. Configurez l'équipement et imagez le xénogreffe tel que décrit dans les étapes 6.2-6.7, acquérant des z-stacks du xénograft à des intervalles de 10 min.
    REMARQUE: L'embryon doit être maintenu à 34 oC car il est photographié et l'E3 au-dessus des larves en agar doit être vérifié et complété à l'occasion pour s'assurer qu'il ne se dessèche pas.

8. Quantitation de la réponse angiogénique au xénogreffe de poisson zèbre

REMARQUE : Les étapes suivantes utilisent un logiciel d'analyse d'image 3D. Les étapes spécifiques varient en fonction du logiciel utilisé.

  1. Transférer les fichiers d'images confocales z-pile d'un xénogreffe tumorale à un nouveau dossier sur le logiciel d'analyse d'image 3D.
    REMARQUE: Afin de quantifier les niveaux de vascularisation tumorale, les protocoles de mesure doivent être créés avec des paramètres calibrés afin qu'ils puissent être utilisés pour mesurer le volume de tumeur ou le volume de navire pour tous les xénogreffes.
  2. Pour créer le protocole "Volume de tumeur" pour mesurer le volume des xénogreffes tumorales, allez à l'onglet "Mesure" sur le menu supérieur, puis faites glisser les protocoles nommés "Trouver des objets" à partir de la liste des protocoles qui apparaît sur le côté gauche de la fenêtre à l'espace qui s'intitule "Drag tasks here to make measurements".
  3. Assurez-vous que ce protocole est réglé pour mesurer les objets dans le canal tumoral, puis faites glisser les protocoles nommés "Clip to ROIs" et "Make ROI from Population" de la liste des protocoles à la "Drag tasks here to make measurements" espace. Assurez-vous que ces deux commandes s'appliquent aux objets identifiés par « Trouver des objets ».
  4. Avant d'étalonner les paramètres de ce protocole, allez dans le menu déroulant au-dessus de l'étiquette "Mode" en haut à gauche de la fenêtre et sélectionnez la vue "Extended Focus".
  5. Désélectionnez les canaux non-tumor dans le volet à l'extrême droite en cliquant sur le cercle noir sous chaque direction de canal, de sorte que seul le canal tumoral peut être vu. Utilisez l'outil "Freehand" en haut de la fenêtre pour dessiner une "région d'intérêt" (ROI) autour de tout le volume tumoral.
    REMARQUE: Prenez soin de s'assurer qu'aucune de la tumeur n'est laissée de côté du retour sur investissement. Cela fournira une région sur laquelle effectuer le protocole que vous étalonnez les paramètres.
  6. Sélectionnez l'étiquette "Résumé" dans le panneau ci-dessous l'image, et définir l'option "Display" pour afficher "Population 2". Pour calibrer, cliquez sur l'astérisque sur la tâche Trouver des objets, qui ouvrira la fenêtre de paramètres. Ajuster le «seuil» en utilisant «Intensité» et de déterminer le seuil «inférieur» jusqu'à ce que seules les cellules tumorales sont sélectionnés et non la fluorescence de fond.
    REMARQUE: Ceci est important de sorte que seule la fluorescence des cellules tumorales dans le roi d'ici sélectionné (tiré en 8,5) est détectée et aucune fluorescence de fond n'est mesurée.
  7. Déterminer la « taille minimale de l'objet » de sorte que seules les cellules intactes sont mesurées par opposition aux petits éléments de débris cellulaires (p. ex. en définissant la « taille minimale de l'objet » de 100 m3). Enregistrez ce protocole en tant que « volume de tumeur » en cliquant sur l'onglet Mesures sur le menu supérieur et en cliquant sur « Enregistrer le protocole », et utilisez les mêmes paramètres pour mesurer tous les xénogreffes.
  8. Pour mesurer le volume des vaisseaux sanguins associés au xénogreffe, vous devrez faire un nouveau protocole. Allez au menu du haut, cliquez sur l'onglet Mesures et cliquez sur "Protocole clair". Faites glisser les tâches «Trouver des objets» et « Clip à ROIs » dans l'espace qui s'intitule « Faites des tâches de drague ici pour effectuer des mesures » pour ce protocole.
  9. Assurez-vous que la première commande est réglé pour mesurer les objets dans le canal des vaisseaux sanguins et que la commande suivante est fixée pour s'appliquer aux objets identifiés par la première commande. Puis désélectionner les canaux non-vaisseaudans le volet d'extrême droite afin que seuls les vaisseaux sanguins peuvent être vus.
  10. Déterminez les paramètres du « volume de navire » de la même manière que pour le protocole « Volume de tumeur » et enregistrez ce protocole comme « Volume de navire » (voir 8.6-8.7).
  11. Effacer le protocole et dessiner un retour sur investissement autour de la xénogreffe, en prenant soin de ne pas inclure toute autofluorescence non-tumorale. Mesurez la somme du volume des objets dans le canal tumoral à l'intérieur de ce retour sur investissement en cliquant sur l'onglet Mesures, en sélectionnant la commande " Protocole de restauration " et en choisissant le protocole "Volume de tumeur".
  12. En utilisant le nouveau retour sur investissement réalisé par le protocole "Volume de tumeur", utilisez le protocole "Volume de navire" pour mesurer le volume total d'objets dans le canal du navire à l'intérieur de ce ROI en cliquant sur l'onglet Mesures, en sélectionnant la commande "Protocole de restauration" et en choisissant le "Navire Volume" protocole.
  13. Divisez le volume du vaisseau par le volume tumoral et multipliez la réponse par 100 pour obtenir une valeur en pourcentage de la vascularisation de greffe.
  14. Répétez les étapes 8.11 à 8.13 pour tous les autres xénogreffes.

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Résultats

En imagerie d'un xénogreffe individuel à 6, 24 et 48 hpi, la réponse angiogénique à différents moments peut être calculée comme indiqué dans la figure 1A-C. La plus grande réponse angiogénique est observée entre 24-48 h après l'implantation, avec les niveaux maximums de vascularisation de greffe vu autour de 2 dpi (Figure 1A-C). Un film en time-lapse d'une réponse angiogénique typi...

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Discussion

La première étape critique du protocole est l'implantation de cellules tumorales. Il est essentiel que les cellules soient injectées dans un endroit qui permettra au xénogreffe de s'implanter avec succès dans l'embryon sans rendre l'embryon edematous. Une injection trop antérieure peut permettre aux cellules de se déplacer vers le cœur, bloquant la circulation sanguine et conduisant à l'œdème, tandis qu'une injection trop postérieure entraînera un xénogreffe mal implanté. Une injection antérieure est pré...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous remercions M. Alhad Mahagaonkar d'avoir géré l'installation de poisson zèbre de l'Université d'Auckland et l'Unité de recherche en imagerie biomédicale de l'École des sciences médicales de l'Université d'Auckland pour leur aide en microscopie confocale en accéléré. Ces travaux ont été soutenus par une subvention de projet du Health Research Council of New Zealand (14/105), une subvention de projet du Fonds Marsden de la Royal Society of New Zealand (UOA1602) et une subvention de projet de la Fondation de recherche médicale d'Auckland (1116012) accordée à J.W.A.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Air cylinderBOC011GXenotransplantation
B16-F1 cellsATCCCell culture
BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture)Corning356235Xenotransplantation
Borosillicate glass capillariesWarner InstrumentsG100T-4OD = 1.00 mm, ID = 0.78 mm, Length = 10 cm Cell injection
Cell culture dish 35 mm diameterThermofisher NZNUN153066Fish husbandry
Cell culture dish 100 mm diameterSigma-AldrichCLS430167-500EAFish husbandry
Cell culture flask 75 cm2In Vitro TechnologiesCOR430641Cell culture
CellTracker GreenInvitrogenC2925Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media)
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418Drug treatment, Cell labelling
E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl

1.6 g KCl

5.8 g CaCl2·2H2O

9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH		In house [1]Fish husbandry
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)Sigma-AldrichE10521Xenotransplantation, Imaging
Filter tip 1,000 μLVWR732-1491Used during multiple steps
Filter tip 200 μLVWR732-1489Used during multiple steps
Filter tip 10 μLVWR732-1487Used during multiple steps
Fluorescence microscopeLeicaMZ16FAPreparation of embryos
FBS (NZ origin)Thermofisher Scientific10091148Cell culture
GlovesAny commercial brandUsed during multiple steps
Haemocytometer cell counting chamber Improved NeubauerHawksleyVetAC1000Xenotransplantation
Heraeus Multifuge X3R CentrifugeThermofisher Scientific75004500Cell culture, Cell labelling
Hoechst 33342Thermofisher Scientific62249Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media)
Low Melting Point, UltraPure AgaroseThermofisher Scientific16520050Imaging
MethycelluloseSigma-Aldrich9004 67 5Xenotransplantation
Methylene bluesigma-AldrichM9140Fish husbandry
Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillariesEppendorf5242956003Xenotransplantation
MicropipettesAny commercial brandUsed during multiple steps
Micropipette puller P 87Sutter InstrumentsXenotransplantation
Microscope cage incubatorOkolabTime-lapse imaging
MicrowaveAny commercial brandImaging
Mineral oilSigma-AldrichM3516Xenotransplantation
Minimal Essential Media (MEM) - alphaThermofisher Scientfic12561056Cell Culture
MPPI-2 Pressure InjectorApplied Scientific InstrumentationXenotransplantation
Narishige micromanipulatorNarishige GroupXenotransplantation
Nikon D Eclipse C1 Confocal MicroscopeNikonImaging
N-Phenylthiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629Fish husbandry
PBSGibco10010023Cell culture
Penicillin StreptomycinLife Technologies15140122Cell culture
S1 pipet fillerThermoscientific9501Cell culture
Serological stripette 10 mLCorning4488Cell culture
Serological stripette 25 mLCorning4489Cell culture
Serological stripette 5 mLCorning4485Cell culture
Serological stripette 2 mLCorning4486Cell culture
Terumo Needle 22 GAmtechSH 182Fish husbandry
Tissue culture incubatorThermofisher ScientficHeraCell 150iCell culture
Tivozanib (AV951)AVEO PharmaceuticalsDrug treatment
Transfer pipette 3 mLMedirayRL200CFish husbandry
Trypsin/EDTA (0.25%)Life TechnologiesT4049Cell culture
TweezersFine Science Tools11295-10Fish husbandry
Volocity Software (v6.3)Improvision/Perkin ElmerImage analysis

Références

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