In vivo Imaging e Quantitation da resposta angiogênica hospedeira em xenoenxertos de tumor de zebrafish

Resumo

O objetivo deste método é gerar um modelo in vivo de angiogênese tumoral por xenoenxertos de células tumorais de mamíferos em um embrião de zebrafish que tem vasos sanguíneos com rótulo fluorescentamente. Por imagem do Xenoenxerto e vasos associados, uma medida quantitativa da resposta angiogênica pode ser obtida.

Resumo

A angiogênese tumoral é um alvo-chave da terapia anticancerígena e este método foi desenvolvido para fornecer um novo modelo para estudar este processo in vivo. Um Xenoenxerto de zebrafish é criado através da implantação de células tumorais de mamíferos no espaço perivitelínico de dois dias-embriões de zebrafish pós-fertilização, seguidos pela mensuração da extensão da resposta angiogênica observada em um desfecho experimental até dois dias pós-implante. A vantagem chave a este método é a habilidade de quantificar exatamente a resposta angiogênica do anfitrião do zebrafish ao enxerto. Isto permite a examinação detalhada dos mecanismos moleculars assim como o anfitrião contra a contribuição do tumor à resposta angiogênica. Os embriões xenografados podem ser submetidos a uma variedade de tratamentos, como a incubação com potenciais fármacos antiangiogénese, a fim de investigar estratégias para inibir a angiogênese tumoral. A resposta angiogênica também pode ser imaged ao vivo, a fim de examinar processos celulares mais dinâmicos. A técnica experimental relativamente pouco exigente, custos de manutenção baratos de zebrafish e curto cronograma experimental tornam este modelo especialmente útil para o desenvolvimento de estratégias para manipular a angiogênese tumoral.

Introdução

A angiogênese é uma das características clássicas do câncer e representa um alvo de terapia anticancerígena^1,2. Para estudar esse processo, foram criados modelos de câncer de Xenoenxerto, implantando células tumorais de mamíferos em animais como camundongos³. Um modelo do xenograft do zebrafish foi desenvolvido igualmente, que envolva a implantação de pilhas do tumor em 2 dias do borne da fertilização (DPI) zebrafish que conduz ao crescimento rápido de vasos sanguíneos do zebrafish no xenograft⁴.

Este protocolo descreve um modelo in vivo do xenograft do tumor do embrião do zebrafish em que a resposta angiogênica pode com precisão ser quantificados através do xenograft inteiro. Este método permite que o investigador examine, in vivo, os mecanismos moleculares que sustentam a resposta angiogênica do tumor. A tractabilidade genética do zebrafish permite que a contribuição do hospedeiro seja interrogada, enquanto a seleção de diferentes linhagens celulares tumorais permite que a contribuição tumoral para a angiogênese também seja examinada^5,6,7. Além disso, como larvas de zebrafish são permeáveis a pequenas moléculas, inibidores de vias específicas podem ser usados ou bibliotecas de drogas podem ser rastreadas para identificar novos inibidores da angiogênese tumoral⁸,^9,10, o ¹¹.

O modelo de Xenoenxerto de embrião zebrafish apresenta vantagens únicas em comparação com outros modelos de xenoenxertos de mamíferos. Os xenoenxertos de zebrafish são mais baratos e mais fáceis de executar, um grande número de animais pode ser examinado e a imagem latente viva da pilha permite a examinação detalhada do comportamento da pilha⁴. Ao contrário de outros modelos in vivo, que requerem até várias semanas para observar o crescimento significativo dos vasos, a angiogênese em xenoenxertos de zebrafish pode ser observada dentro de 24 h após a implantação^3,4. No entanto, a falta de um sistema imunológico adaptativo em zebrafish embrionário, embora benéfica para a manutenção do Xenoenxerto, significa que a resposta imune adaptativa e sua contribuição para a angiogênese tumoral não podem ser examinadas. Além, a falta de pilhas stromal do tumor, a inabilidade ao implante ortotópica o tumor e a diferença na temperatura da manutenção entre zebrafish e pilhas mamífero são fraquezas potenciais deste método. No entanto, a amenabilidade deste modelo para imagens ao vivo e a capacidade de quantitizar com precisão a resposta angiogênica torna-o excepcionalmente benéfico para o estudo dos processos celulares que regulam a angiogênese tumoral in vivo.

Protocolo

1. preparação de agulhas de microinjecção

1. Gire sobre um extrator da micropipeta e ajuste os seguintes parâmetros (calibrados para o modelo do extrator da micropipeta alistado na tabela dos materiais): calor, 680; Puxe, 75; Velocidade, 40; Tempo, 55; Pressão: 530.
2. Fixe um capilar de vidro de borosilicato no extrator de micropipeta e puxe o capilar para fazer duas agulhas. Repita o número de agulhas que desejar.

2. cultura celular para implantação

Nota: Ao usar este protocolo, qualquer linha celular de câncer de mamíferos pode ser usada para a implantação em embriões de zebrafish como xenoenxertos. Entretanto, há muita variação na resposta angiogênica induzida entre as diferentes linhagens celulares^5,11,12. As pilhas da melanoma de B16-F1 murino foram mostradas para induzir uma resposta angiogênica forte em embriões do zebrafish¹¹ e são conseqüentemente apropriadas para o uso neste protocolo.

1. Cresça células B16-F1 a 37 ° c em um balão de 75 cm² usando a mídia mem-α suplementada com soro bovino FETAL (FBS) para uma concentração final de 10% (v/v) e penicilina/estreptomicina, cada uma em uma concentração final de 100 μg/ml.
2. Retire a mídia de um 95-100% confluente 75 cm² balão de células B16-F1 e lave as células em 5 ml de temperatura ambiente tampão fosfato salina (PBS).
3. Retire o PBS de 5 mL, adicione 2 mL de temperatura ambiente 0,25% de tripsina/ácido etilenodiaminotraacético (EDTA) e incubar a 37 ° c para 60 s.
4. Toque no lado do balão para determinar se as células estão começando a perder seu apego à parte inferior do balão.
5. Adicionar 8 mL de temperatura ambiente MEM-α com 10% de FBS no balão, pipetar contra o interior do balão para trazer quaisquer células que permaneçam aderidas à parte inferior do balão em suspensão e pipetar a suspensão da célula para um tubo de 15 mL.
6. Centrifugar a suspensão celular a 800 x g, 4-8 ° c por 5 min, aspirar a mídia e proceder à rotulagem das células com corante.

3. rotulagem de células B16-F1 com corante fluorescente

Nota: A fim diferenciar-se entre as pilhas implantadas do tumor e as outras pilhas no embrião, as pilhas do tumor devem ser etiquetadas com um corante fluorescente apropriado antes da implantação. Esta etapa pode ser ignorada se as células já expressam repórteres fluorescentes.

1. Incubar 2 mL de mídia MEM-α sem soro a 37 ° c.
2. Prepare uma solução de estoque do corante escolhido e dilui-o em 2 mL pré-incubados de mídia MEM-α sem soro para fazer uma concentração viável (exemplos de corantes e concentrações apropriadas para células B16 F1 são fornecidos na tabela de materiais).
3. Pipetar 1 mL da solução corante para o pellet celular (a partir do passo 2,6), misture bem com pipetagem, em seguida, adicione os outros 1 mL de solução de corante e misture.
4. Incubar as células e a mistura de corante a 37 ° c por 40 min, misturando por agitação suave a 20 min.
5. Centrifugue a suspensão da pilha em 800 x g, 4-8 ° c por 5 minutos.
6. Aspirar o sobrenadante e lavar as células rotuladas pipetando com 5 mL de PBS.
7. Centrifugue a suspensão da pilha outra vez em 800 x g, 4-8 ° c por 5 minutos, Aspire o sobrenadante e coloc as pilhas no gelo até pronto para a implantação.
   Nota: A pelota final da pilha do tumor deve ter um volume de 20-40 μL.

4. preparação de embriões para implantação

Nota: Escolha uma linha de zebrafish transgênica que tenha rotulado os vasos sanguíneos fluorescentamente (por exemplo, kdrl: RFP, fli1a: EGFP, etc.) ¹³ anos de ^, a ¹⁴.

1. Dois dias antes da implantação, geram o zebrafish como descrito previamente e coletam os embriões¹⁵.
   Nota: Como não estamos injetando esses peixes em uma fase inicial, eles não precisam ser coletados dentro de 20 min de desova, como descrito por Rosen et al.¹⁵, mas podem ser coletadas após algumas horas de acasalamento.
2. Coloc os embriões em pratos da cultura de 100 milímetros em uma densidade de aproximadamente 100 embriões/prato.
3. Adicionar 50 mL de E3¹⁶ (suplementado com 5 μL de um 1% w/v solução aquosa de estoque de azul de metileno para evitar a contaminação) para cada prato, limpe todos os embriões mortos ou detritos e manter o prato em uma incubadora escura a 28 ° c até estar pronto para a injeção.
4. Em 1 dia após a fertilização (DPF), adicionar 1-phenyl-2-thiourea (PTU) para cada prato para produzir uma concentração final de 30 mg/L PTU em E3. PTU previne a pigmentação, que pode interferir com a capacidade de ver as células tumorais e vasos sanguíneos.
5. Em 2 DPF, use agulhas ou pinças para dechorionate manualmente todos os embriões que são unhatched. Usando um microscópio fluorescente, selecione tantos como embriões transgénicos como necessário para o xenotransplantar (50-200).
6. Antes da implantação, anestesiam os embriões selecionados em uma solução de 300 μg/mL de tricaína no E3, a fim de evitar o movimento durante o procedimento de injeção.
7. Encha um prato de 35 milímetros com um metilcelulose de 2% na solução E3 a um quarto do volume do prato.
8. Use uma pipeta de transferência para colocar aproximadamente 50 embriões (minimizando o volume da solução E3 também transferidos) para a metilcelulose.
9. Use uma ponta da pipeta do Microloader para arranjar os embriões de modo que estejam todos orientados verticalmente, com as cabeças à parte superior e com o lado esquerdo virado para cima.
   Nota: As etapas 4.7-4.9 podem igualmente ser executadas arranjando os embriões em um bloco do agarose como descrito previamente¹⁷, mas em nossa experiência, os embriões são arranjados mais facilmente quando vestiu na metilcelulose.

5. injeção perivitelline de células cancerosas de mamíferos em embriões 2 DPF

Nota: Para garantir que as células se amontoam como enxerto quando implantadas, as células devem ser misturadas juntamente com uma mistura de matriz extracelular (ECM). Descrevemos as etapas de fazer uma mistura de célula/ECM ao usar uma mistura ECM referenciada na tabela de materiais. Se uma matriz alternativa for usada, as etapas devem ser ajustadas de acordo.

1. Divida um estoque de ECM em 100 μL de alíquotas em tubos de 500 μL e armazene a-20 ° c até que seja necessário.
2. Descongelar uma alíquota de ECM e adicionar 100 μL de PBS para diluir a mistura para 50% (v/v).
   Nota: O ECM 50% diluído pode ser armazenado em 4 ° c por até 1 mês.
3. Misture bem o ECM 50% com a pelota da pilha B16-F1 (da etapa 3,7) introduzindo com pipting e mexendo, para produzir uma mistura de Cells/ECM em uma relação 2:1 e armazene a mistura no gelo.
4. Usando uma pipeta microcapilar, tome acima de 3-10 μL das pilhas.
5. Insira cuidadosamente a ponta da pipeta numa agulha e ejecte a mistura B16-F1/Matrix até ao fim da agulha.
6. Insira a agulha no suporte da agulha e incline-a num ângulo de 45 ° para o prato.
7. Quebre a ponta da agulha usando pinças para fazer um furo grande o suficiente para que as células sejam ejetadas da agulha sem apertar as células.
8. Gire sobre o cilindro de ar pressurizado Unido ao instrumento da injeção e gire o injector no modo "contínuo" momentaneamente para empurrar as pilhas à ponta da agulha.
9. Retire a agulha do prato e substitua o prato por um hemociômetro.
10. Coloque uma gota de óleo no hemocitômetro e injete a agulha uma vez sobre esta gota.
11. Contar o número de células ejetado com um único pulso usando o hemocitômetro e calibrar a agulha para ejetar aproximadamente 150 células por pulso, ajustando a duração do pulso.
    Nota: Ejting esta quantidade de pilhas por o pulso exigirá diversos pulsos a fim implantar um xenograft bem sucedido. Isto dará ao pesquisador mais controle sobre o tamanho final do tumor xenograft, permitindo-lhes ajustar moderadamente o número/localização de pulsos para fazer cada Xenoenxerto maior ou menor como eles vêem o ajuste.
12. Aponte a agulha para o saco de gema de um embrião e empurre-a através do saco de gema em uma direção ventral até que a ponta da agulha emergiu do saco vitelino e está empurrando a epiderme embrionária no lado ventral do embrião apenas posterior ao coração.
    Nota: Posicione a agulha de modo a entrar no saco de gema embrionário anterior ao local final onde as células serão ejetadas. Isso garantirá que as células serão ejetadas em uma direção longe do coração, diminuindo a probabilidade de injetar as células na veia cardinais comum.
13. Empurre com cuidado a ponta da agulha para a frente um pouco até que tenha criado um espaço (espaço do perivitelino) entre a epiderme e a membrana do saco de gema e Pulse então o injector para ejetar alguma da mistura da pilha no espaço do perivitelino.
14. Repita os pulsos até que 500-800 células tenham sido injetadas no espaço perivitelino, criando uma protuberância visível que se estende pelo menos metade do caminho ao longo da parte inferior do saco de gema, em seguida, retire a agulha do embrião.
    Nota: Se as células bloqueiem a agulha ou estiverem danificadas durante a injeção, limpe a agulha momentaneamente alternando para o modo "contínuo" e depois volte para o "pulso". Isto deve desbloquear a agulha e permitir que as células sejam ejetadas livremente e sem danos.
15. Continue a fazer o mesmo para todos os embriões no prato, carregando uma nova agulha com células tumorais quando necessário.
16. Depois de injetar todos os embriões, retire a agulha e empurre todos os embriões em conjunto utilizando uma ponteira de pipeta microcapilar para que possam ser pipetadas com o mais pequeno metilcelulose possível.
17. Transfira os embriões para um prato de recuperação contendo E3 (com PTU e azul de metileno) e lave-os gentilmente introduzindo o E3 em torno dos embriões.
    Nota: Neste ponto, os embriões xenografados podem ser tratados com as drogas separando os em pratos diferentes e adicionando uma solução da droga a um prato e a uma solução do controle (tal como o veículo da droga) ao outro prato.
18. Incubar os embriões a 34 ° c e realizar duas vezes por dia verificações para remover embriões mortos ou oedematous do prato.
    Nota: o ° c 34 foi encontrado para ser a temperatura óptima para o vascularização do xenograft e foi usado igualmente por outros estudos que empregam o modelo embrionário da angiogênese do xenograft de zebrafish¹⁸. Os xenoenxertos podem ser fotografados a qualquer momento até 48 HPI (horas pós-implantação).

6. imagem latente viva

1. Em 48 HPI, identifique 3-5 embriões saudáveis sem edema. Anestesie-os em 150 μg/mL de tricaína e monte-os lateralmente em 1% de agarose de baixo ponto de fusão (LMP) como descrito anteriormente¹⁹.
   Nota: Como o agarose está solidificando, use uma ponta microcapilar da pipeta para manter os embriões posicionados lateralmente.
2. Gire sobre o microscópio confocal, o controlador do microscópio, os lasers e o software de computador para controlar o microscópio.
3. Coloque o prato em um microscópio confocal. Usando uma ampliação 20x, a água que mergulha a lente objetiva, posiciona o xenograft no centro do campo usando a imagem latente do brightfield.
4. Selecione os lasers da excitação que são apropriados para detectar o corante usado para etiquetar as pilhas do tumor e o fluoróforo usado para etiquetar os vasos sanguíneos do zebrafish.
5. Ajuste o ganho para cada laser a um nível que permita a deteção das pilhas do tumor e dos vasos sanguíneos.
   Nota: Uma vez que os ajustes confocais foram estabelecidos, assegure-se de que estes estejam mantidos inalterados durante todo o experimento de modo que as comparações possam ser feitas entre xenoenxertos.
6. Usando o canal do laser apropriado para as pilhas do tumor, determine um volume a ser imaged que inclua o volume inteiro do xenograft, permitindo pelo menos uma ou dois seções óticas um ou outro lado do enxerto. Use intervalos de seção com cerca de 5 μm de distância para criar uma pilha z.
   Nota: É essencial que o z-Stack deve conter todo o volume do xenograft.
7. Usando duas imagens de canal, imagem tanto o tumor xenograft e os vasos sanguíneos. Repita as etapas 6.6-6.7 para cada larva a ser imaged.

7. imagem de lapso de tempo

Nota: Este modelo é altamente adequado para processos celulares dinâmicos de imagem devido à sua transparência e à disponibilidade de transgênicos zebrafish que rotulam de forma cDNAs diferentes tipos de células. Isso torna a imagem de lapso de tempo uma aplicação chave desse modelo.

1. Gire sobre a câmara ambiental e ajuste a 34 ° c pelo menos 2 h antes da imagem latente. Se a câmara não estiver humidificada, adicione os pratos de água.
2. Anestesie 3-5 embriões (utilizando 120 μg/mL de tricaína a 2 DPF e 100 μg/mL de tricaína a 3 DPF) e monte-os lateralmente em 0,8% de agarose de LMP para a imagem de lapso temporal de acordo com o protocolo previamente descrito¹⁹.
   Nota: Como o agarose está solidificando, use uma ponta microcapilar da pipeta para manter os embriões posicionados lateralmente.
3. Configurar o equipamento e a imagem o xenograft como descrito nas etapas 6.2-6.7, adquirindo z-pilhas do xenograft em intervalos de 10 minutos.
   Nota: O embrião deve ser mantido a 34 ° c à medida que está sendo fotografado e o E3 em cima das larvas em agar deve ser verificado e suplementado ocasionalmente para garantir que não seque.

8. quantitation da resposta angiogênica ao Xenoenxerto de zebrafish

Observação: as etapas a seguir usam software de análise de imagem 3D. As etapas específicas variarão dependendo do software usado.

1. Transfira os arquivos de imagem Confocal da pilha z de um xenograft do tumor a uma pasta nova no software da análise de imagem 3D.
   Nota: A fim de quantificar os níveis de vascularização tumoral, os protocolos de medição devem ser criados com ajustes calibrados para que possam ser usados para medir o volume tumoral ou volume do vaso para todos os xenoenxertos.
2. Para criar o protocolo "volume tumoral" para medir o volume dos xenoenxertos tumorais, vá para a guia "medição" no menu superior e, em seguida, arraste os protocolos nomeados "Find Objects" da lista de protocolos que aparece no lado esquerdo da janela para o espaço que é intitulado "arraste tarefas aqui para fazer medições".
3. Assegure-se de que este protocolo esteja ajustado para medir objetos no canal do tumor, e arraste então os protocolos nomeados "grampo a ROIs" e "faça o ROI da população" da lista de protocolos ao espaço do "arraste tarefas aqui para fazer medidas". Assegure-se de que esses dois comandos se apliquem aos objetos identificados por "Find Objects".
4. Antes de calibrar as configurações deste protocolo, vá para o menu suspenso acima do rótulo "modo" no canto superior esquerdo da janela e selecione a visualização "foco estendido".
5. Desmarque os canais não tumorais no painel na extrema direita clicando no círculo preto em cada direção do canal, para que apenas o canal do tumor possa ser visto. Use a ferramenta "mão livre" na parte superior da janela para desenhar uma "região de interesse" (ROI) em torno de todo o volume tumoral.
   Nota: Tome cuidado para garantir que nenhum do tumor é deixado de fora do ROI. Isso fornecerá uma região na qual executar o protocolo conforme você está calibrando as configurações.
6. Selecione o rótulo "Resumo" no painel abaixo da imagem e defina a opção "exibir" para mostrar "população 2". Para calibrar, clique no asterisco na tarefa localizar objetos, que abrirá a janela de configurações. Ajuste o "limiar" usando "intensidade" e determinando o limiar "inferior" até que apenas as células tumorais sejam selecionadas e não a fluorescência de fundo.
   Nota: Isto é importante de modo que somente a fluorescência das pilhas do tumor no ROI selecionado (extraído em 8,5) esteja detectada e nenhuma da fluorescência do fundo esteja medida.
7. Determine o "tamanho mínimo do objeto" para que apenas as células intactas sejam medidas em oposição a itens menores de detritos celulares (por exemplo, definindo o "tamanho mínimo do objeto" como 100 μm³). Salve este protocolo como "volume tumoral" clicando na guia medições no menu superior e clicando em "Save Protocol", e use as mesmas configurações para medir todos os xenoenxertos.
8. Para medir o volume dos vasos sanguíneos associados ao Xenoenxerto, terá de fazer um novo protocolo. Vá para o menu superior, clique na guia medições e clique em "Clear Protocol". Arraste as tarefas "localizar objectos" e "clip para ROIs" para o espaço que é intitulado "arrastar tarefas aqui para efectuar medições" para este protocolo.
9. Assegure-se de que o primeiro comando esteja ajustado para medir objetos no canal do vaso sanguíneo e que o seguinte comando esteja ajustado para aplicar-se aos objetos identificados pelo primeiro comando. Em seguida, desmarque os canais não-vasos no painel da extrema direita para que apenas os vasos sanguíneos podem ser vistos.
10. Determine as configurações para o "volume do vaso" de forma semelhante ao protocolo "volume tumoral" e salve este protocolo como "volume do vaso" (ver 8.6-8.7).
11. Limpe o protocolo e desenhe um ROI em torno do xenograft, tomando cuidado para não incluir qualquer autofluorescência não tumoral. Meça a soma do volume dos objetos no canal tumoral dentro deste ROI clicando na guia medições, selecionando o comando "Restore Protocol" e escolhendo o protocolo "volume tumoral".
12. Usando o novo ROI feito pelo protocolo "volume tumoral", use o protocolo "volume do navio" para medir o volume total de objetos no canal do navio dentro deste ROI clicando na guia medições, selecionando o comando "Restore Protocol" e escolhendo o "navio Volume "protocolo.
13. Divida o volume do vaso pelo volume tumoral e multiplique a resposta por 100 para obter um valor percentual de vascularização do enxerto.
14. Repita as etapas 8,11 a 8,13 para todos os outros xenoenxertos.

Resultados

Por meio da imagem de um Xenoenxerto individual em 6, 24 e 48 HPI, a resposta angiogênica em diferentes temporais pode ser calculada como mostrado na Figura 1a-C. A maior resposta angiogênica é observada entre 24-48 h pós-implante, com os níveis máximos de vascularização do enxerto observados em torno de 2 DPI (Figura 1a-C). Um filme de lapso de tempo de uma resposta angiogênica típica ...

Discussão

O primeiro passo crítico no protocolo é a implantação de células tumorais. É essencial que as células são injetadas em um local que permitirá que o xenograft implante com sucesso no embrião sem fazer o embrião edematoso. Uma injeção que é muito anterior pode permitir que as células se movam em direção ao coração, bloqueando a corrente sanguínea e levando ao edema, enquanto uma injeção que é muito posterior resultará em um Xenoenxerto mal implantado. Uma injeção anterior é melhor evitada introdu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air cylinder	BOC	011G	Xenotransplantation
B16-F1 cells	ATCC		Cell culture
BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture)	Corning	356235	Xenotransplantation
Borosillicate glass capillaries	Warner Instruments	G100T-4	OD = 1.00 mm, ID = 0.78 mm, Length = 10 cm Cell injection
Cell culture dish 35 mm diameter	Thermofisher NZ	NUN153066	Fish husbandry
Cell culture dish 100 mm diameter	Sigma-Aldrich	CLS430167-500EA	Fish husbandry
Cell culture flask 75 cm2	In Vitro Technologies	COR430641	Cell culture
CellTracker Green	Invitrogen	C2925	Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media)
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418	Drug treatment, Cell labelling
E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH	In house [1]		Fish husbandry
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521	Xenotransplantation, Imaging
Filter tip 1,000 μL	VWR	732-1491	Used during multiple steps
Filter tip 200 μL	VWR	732-1489	Used during multiple steps
Filter tip 10 μL	VWR	732-1487	Used during multiple steps
Fluorescence microscope	Leica	MZ16FA	Preparation of embryos
FBS (NZ origin)	Thermofisher Scientific	10091148	Cell culture
Gloves	Any commercial brand		Used during multiple steps
Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer	HawksleyVet	AC1000	Xenotransplantation
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge	Thermofisher Scientific	75004500	Cell culture, Cell labelling
Hoechst 33342	Thermofisher Scientific	62249	Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media)
Low Melting Point, UltraPure Agarose	Thermofisher Scientific	16520050	Imaging
Methycellulose	Sigma-Aldrich	9004 67 5	Xenotransplantation
Methylene blue	sigma-Aldrich	M9140	Fish husbandry
Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries	Eppendorf	5242956003	Xenotransplantation
Micropipettes	Any commercial brand		Used during multiple steps
Micropipette puller P 87	Sutter Instruments		Xenotransplantation
Microscope cage incubator	Okolab		Time-lapse imaging
Microwave	Any commercial brand		Imaging
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M3516	Xenotransplantation
Minimal Essential Media (MEM) - alpha	Thermofisher Scientfic	12561056	Cell Culture
MPPI-2 Pressure Injector	Applied Scientific Instrumentation		Xenotransplantation
Narishige micromanipulator	Narishige Group		Xenotransplantation
Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope	Nikon		Imaging
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	Fish husbandry
PBS	Gibco	10010023	Cell culture
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	Cell culture
S1 pipet filler	Thermoscientific	9501	Cell culture
Serological stripette 10 mL	Corning	4488	Cell culture
Serological stripette 25 mL	Corning	4489	Cell culture
Serological stripette 5 mL	Corning	4485	Cell culture
Serological stripette 2 mL	Corning	4486	Cell culture
Terumo Needle 22 G	Amtech	SH 182	Fish husbandry
Tissue culture incubator	Thermofisher Scientfic	HeraCell 150i	Cell culture
Tivozanib (AV951)	AVEO Pharmaceuticals		Drug treatment
Transfer pipette 3 mL	Mediray	RL200C	Fish husbandry
Trypsin/EDTA (0.25%)	Life Technologies	T4049	Cell culture
Tweezers	Fine Science Tools	11295-10	Fish husbandry
Volocity Software (v6.3)	Improvision/Perkin Elmer		Image analysis