在氧化应激期间细胞粘附和纤维蛋白扩散动力学

摘要

该方法可用于量化细胞粘附的早期动力学，并将锚固依赖细胞扩散到纤维质。此外，此测定可用于研究改变的氧化还原平衡对细胞扩散和/或细胞粘附相关细胞内信号通路的影响。

摘要

细胞粘附和扩散到细胞外基质（ECM）是有机体发育和成人组织平衡过程中必不可少的细胞过程。有趣的是，氧化应激可以改变这些过程，从而促进转移性癌症等疾病的病理生理学。因此，了解在氧化还原状态扰动期间细胞如何附着和在ECM上传播的机制，可以深入了解正常和疾病状态。下面描述是一个循序式方案，它利用基于免疫荧光的测定来具体量化细胞粘附和在体外纤维素（FN）上传播不朽的成纤维细胞。简单地说，锚固依赖细胞被悬浮，并暴露于ATM激酶抑制剂Ku55933诱导氧化应激。然后，在 FN 涂层表面上镀层，并允许在预定的时间段内附着。仍然附着的细胞是固定的，并标有荧光基抗体标记的附着力（例如，白辛）和扩散（例如，F-actin）。数据采集和分析使用常用的实验室设备进行，包括荧光显微镜和免费提供的斐济软件。此过程用途广泛，可针对各种细胞系、ECM 蛋白或抑制剂进行修改，以检查广泛的生物学问题。

引言

细胞基质粘附（即焦点粘附）是大而动态的多分子蛋白复合物，可调节细胞粘附和扩散。这些过程对于组织发育、维护和生理功能至关重要。焦点粘附由膜结合受体（如整数）以及将细胞骨骼功能素与细胞外基质（ECM）1联系起来的脚手架蛋白组成。这些复合物能够通过激活各种信号转导途径来响应细胞外环境中的物理化学线索。因此，焦点粘附作为信号中心，将细胞外机械线索传播到许多细胞过程，包括定向迁移、细胞周期调节、分化和^{存活1、2。}一组调节焦点粘附并与之相互作用的信号分子包括小GTPases的Rho家族的成员。Rho GTPass是关键的蛋白质，通过它们特定的时空活^化3调节细胞迁移和粘附动力学。毫不奇怪，Rho蛋白功能调节障碍与一些人类病理有关，如转移、血管生成等。特别令人感兴趣的是，细胞氧化还原状态在细胞迁移和粘附的调制中起着主要作用。氧化还原平衡的改变，如活性氧物种（ROS）的增加，已被证明可以调节许多细胞类型和人类疾病中的Rho蛋白活性和附^{着力4、5、6 ，7，8}.例如，患有神经紊乱（A-T），这是由DNA损伤修复丝氨酸/三甲氨酸激酶A-T突变（ATM）的突变引起的，转移性癌症的风险^{增加9， 10}.这些患者和细胞系的ATM激酶活性丧失，无论是通过基因突变还是化学抑制，导致由于磷酸苯甲酸酯通^路7、11的功能障碍而产生高水平的氧化应激。 ¹².此外，实验室最近的研究通过改变细胞骨骼动力学（即粘附和扩散）在A-T中对ROS的病理生理学作用，直接导致^在体外激活Rho家族GTPases。最终，由Rho家族活化引起的细胞骨骼动力学的这些改变可能导致A-T^患者5、13中注意到的转移性癌症风险增加。因此，了解氧化应激期间细胞-基质相互作用之间的相互作用，可以深入了解粘附和扩散的调节。这些研究还可以为进一步调查 Rho 家族 GTPass 在这些信号过程中可能扮演的角色设置舞台。

本文所述是研究ATM激酶活性抑制引起的氧化应激期间粘附组装和扩散的早期细胞动力学的一种方案。此测定基于锚固依赖细胞粘附于 ECM 蛋白纤维蛋白 （FN） 的良好特征机制。当悬浮细胞被镀在FN上时，几个Rho GTPass协调对细胞骨骼重塑^{的控制3，14。}当细胞从外观的圆形和圆形向扁平和膨胀移动时，形态变化被观察。伴随这些观察的是与 ECM 一起开发许多矩阵粘附。这些变化归因于当细胞粘附并^{扩散15、16}时，在1小时内用Rac1对RhoA进行双相激活。

已采用各种方法检查粘附形态和动力学以及细胞扩散。然而，这些方法依赖于复杂的长期实时成像全内反射荧光（TIRF）或共聚焦显微镜系统。因此，用户必须有权访问专用设备和软件。此外，这些生物成像系统所需的设置时间使得捕获早期粘附事件具有挑战性，尤其是在同时测试多种抑制剂或治疗条件时。

本文详细的方法提供了一种简单、经济、定量的方法来评估控制粘附组件和体外扩散的参数。该协议使用常用的实验室设备执行，如荧光显微镜和CCD相机。这种测定涉及在ATM激酶活性化学抑制引起一段时间的氧化应激后，将锚固依赖细胞应用于FN涂层表面，这在之前已经证明了这^一点。电镀后，允许电池在指定的时间长度上附加和粘附。未附着的细胞被冲走，而附着的细胞被固定，并标有荧光基抗体的附着力（例如，帕西林）和扩散（例如，F-actin）2，5 。然后，这些蛋白质使用荧光显微镜进行可视化和记录。随后的数据分析使用免费提供的斐济软件进行。此外，该方法可以适应，以检查粘附动力学在广泛的条件下，包括不同的ECM蛋白，处理各种氧化剂/细胞培养条件或各种锚固依赖细胞系，以解决广泛的范围生物问题。

研究方案

1. 准备工作

注: 下面描述的协议已针对 REF52 细胞和 ATM^+/*或 ATM^-/-人成纤维细胞的使用进行了优化。其他单元格类型可能需要进一步优化，如下面的说明和故障排除部分所述。

1. 为REF52细胞制作500 mL的完整细胞培养基。在含有Dulbeco的改性鹰培养基（DMEM）的500mL中，可添加10%FBS、2 mM L-谷氨酰胺和100单位/mL青霉素-链霉素。
2. 在12mL无菌1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中加入300μL的1mg/mL FN溶液，制备纤维素（FN）的25μg/mL溶液，pH 7.4。混合好。
3. 在无血清DMEM细胞培养基培养基中制备0.5%（w/v）降脂（即不含脂肪酸）牛血清白蛋白（dlBSA）溶液。将0.5克dlBSA添加到100 mL的不含血清的DMEM培养基。混合溶液，但不要涡旋。无菌将溶液过滤到新的无菌容器中，使用前使用0.22 μM注射器过滤器。储存在4°C。
4. 通过在 1x PBS 的 100 mL 中溶解 3.7 克甲醛，使 3.7% 的甲醛溶液。使用温和的热量和搅拌，将甲醛放入溶液中。
   注:甲醛溶液对光敏感，应防止光线照射。当储存在4°C下时，最多可达到一周。
   注意:甲醛有毒、易燃、具有腐蚀性，对健康有害。使用前查看材料安全数据表中甲醛含量。处理时使用适当的个人防护设备，包括护目板、面罩、全脸颗粒呼吸器、手套和实验室涂层。
5. 在1xPBS（v/v）中制备含有0.2%非离子表面活性剂的渗透溶液。对于 100 mL，在搅拌时缓慢添加 0.2 mL 的 Triton X-100 至 100 mL 的 1x PBS。
6. 使含有2.5%BSA、5%山羊血清和0.05%非离子表面活性剂（w/v/v）的免疫荧光阻断缓冲液溶解在1xPBS溶液中。对于100 mL，加入5 mL的山羊血清，2.5克BSA和0.05 mL的Triton X-100在+95 mL 1x PBS，同时搅拌。
7. 在37°C和5%CO₂的细胞培养箱中，在10cm^2（或任何其他血管大小）细胞培养处理的培养板中，在DMEM完整培养基中生长REF52细胞。

2. 用细胞外基质蛋白纤维素涂覆细胞培养板

注:在BSL-2认证层流罩中使用无菌技术和无菌试剂执行本节。有关开始之前的关键步骤的概述，请参阅图 1A。

1. 使用经过组织培养认证的 24 孔板，在每个孔中放置一个玻璃盖玻片（12-Cir-1）。根据图1B标记板。
2. 25 μg/mL FN 溶液的移液器 500 μL，适用于 24 孔板的每个孔。
3. 将溶液移过每个盖玻片几次，以确保均匀涂层和完全浸没。将盖子放回盘子上。
4. 在37°C和5%CO₂的细胞培养箱中孵育板1小时。
   注:或者，在4°C孵育过夜。
5. 1小时后，从培养箱中取出板，并从井中吸出FN溶液。
6. 用 500 μL 的 1x PBS 洗井三次。吸气1x PBS的最后清洗。
7. 在37°C和5%CO₂下，用500μL的0.5%dlBSA溶液堵住油井，至少15分钟。
8. 在下面的步骤 3 中电镀电池之前，吸出 dlBSA 溶液。
   注:如果储存板材，在dlBSA溶液吸入后，在每个盖玻片中加入500 μL的1x PBS。然后，板可以保持在4°C长达一个星期。

3. 为粘附测定制备锚固依赖细胞

注:在BSL-2认证层流罩中使用无菌技术和无菌试剂执行本节。

1. 细胞电镀前至少30分钟，预热以下溶液:DMEM完整介质、dlBSA溶液、1x PBS、0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液，以及37°C水浴中的胰蛋白酶中和血清（TNS）。
2. 从10cm²盘中REF52细胞的汇合单层开始，用6mL的暖1x PBS洗涤细胞两次。血清在37°C和5%CO2下，在6 mL的温暖dlBSA溶液中使细胞饿死至少1小时（取决于细胞类型）。
3. 用6 mL加热1x PBS洗涤细胞，吸气PBS，加入1.5 mL的温热0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液。
4. 将细胞置于细胞培养箱中的37°C和5%CO_2，等待±2分钟。
5. 在光学显微镜下观察细胞，以确保分片完成。如果细胞在敲击台面上的板后仍然粘附，则返回到37°C培养箱，再延长2分钟。
6. 移液器 1.5 mL 的温胰蛋白酶中和溶液 （TNS） 到盘中，以停止胰蛋白酶化并收集分离的细胞。多次将溶液上下移在板的底部，以去除所有剩余的粘附细胞。如果细胞出现块状，通过在盘子背面轻轻上下移液，进一步三聚细胞悬浮液。
7. 在光学显微镜下使用锥体蓝色排除和血细胞计对细胞进行计数。或者，使用自动细胞计数器。
8. 在15 mL锥形管中，在5 mL的dlBSA中去除适量的细胞，以产生1.0-3.0 x 10⁴细胞/mL细胞悬浮液。
9. 在台式离心机中使用固定角度转子，在 ±300 x g下使用 5 分钟。
10. 从细胞颗粒中吸出上清液，并在总共7 mL的温dlBSA溶液中重新悬浮细胞。不要让细胞在盖玻片电镀时过度汇入，但均匀分布，很少细胞相互接触。
11. 将细胞悬架均匀地分成两个15 mL锥形管，一个用于车辆单独控制 （DMSO），另一个用于 Ku55933（ATM 激酶抑制剂，氧化剂）⁵。确保每个管包含3.5 mL的细胞悬浮液。
12. 使用管旋转器，在细胞培养箱中旋转管在37°C下90-120分钟。
13. 电镀前30分钟，在每个管中加入10μM Ku55933和DMSO（1:1，000）的最终浓度。将细胞悬架放回旋转器上，等待剩余时间。
14. 在电镀细胞之前，从培养箱中取出24孔板，并吸出dlBSA溶液。
15. 旋转细胞悬浮液90-120分钟后，从每个处理组取出500μL的细胞悬浮液，并从步骤2中加入24孔板中的一个FN涂层盖玻片，如图所示（图1B）。将板返回到 37°C 和 5% CO₂细胞培养箱，并将细胞悬浮回旋转。
16. 在 FN 覆盖唇上电镀细胞悬浮液后，让细胞坚持到所需的时间长度（例如，10 分钟、15 分钟、20 分钟、30 分钟），然后立即进入步骤 4。

4. 免疫荧光的细胞固定和抗体染色

注:除非另有说明，否则以下步骤在非无菌条件下和室温下执行。

1. 在所需的粘附时间过后，从板中的每个盖玻片中吸出细胞溶液。
2. 使用井的侧面，将 500 μL 的 3.7% 甲醛溶液轻轻涂抹到每个盖玻片上，等待 10-15 分钟。
3. 取出甲醛溶液，用 500 μL 的 1x PBS 清洗每个盖玻片，共两次。
   注:根据该机构的环境健康和安全计划，负责任地处理甲醛废物。
4. 吸气PBS，并在室温下用500μL的Triton X-100在1xPBS（v/v）中渗透每个盖玻片上的细胞10-15分钟。
5. 用 500 μL 的 1x PBS 清洗每个盖玻片三次。
6. 在每个盖玻片上用500μL的免疫荧光阻断缓冲液阻断细胞，其中含有5%山羊血清、2.5%BSA和0.05%Triton X-100溶解在1 x PBS溶液中30-60分钟。
7. 稀释阻塞缓冲液中的原原抗帕西林抗体（1:250）。混合均匀，在每个盖玻片中加入200μL的抗体溶液。在室温下孵育至少1小时。
   注:或者，原抗体溶液可在4°C下孵育过夜。有许多常见的焦距粘附标记可用于染色粘附复合物和随后的 FA 分析。这些包括针对以下蛋白质的抗体:积分亚单位（β1、+5或μV）、塔林或文库^林2。
8. 吸出抗体溶液，用500μL的1x PBS清洗每个盖玻片三次，每次10分钟。从此时向前保护样品免受光线照射。
9. 稀释与红色荧光Alexa 594染料（1:1000）和山羊抗小鼠488荧光二级抗体（1:400）在同一阻断缓冲液中结合的phalloidin F-actin探针。混合均匀，在每个盖玻片中加入200 μL的抗体溶液30分钟。
   注:也可以使用其他物种的荧光结合二级抗体。然而，使用来自其他物种的抗体将需要修改阻塞缓冲血清。
10. 吸出抗体溶液，用500μL的1x PBS清洗每个盖玻片三次，每次10分钟。
11. 吸出 1x PBS，用 500 μL 的 dIH₂O 冲洗一次。
12. 使用含有 DAPI 的防褪色安装介质将盖玻片安装到显微镜幻灯片上。
13. 将显微镜幻灯片放在室温下的黑暗中过夜。
14. 将显微镜滑入4°C的黑暗中，以便长期储存，直至成像。
    注:使用标准免疫荧光技术的图像。建议使用高功率油浸 60x 物镜，以确保有足够的分辨率来注意到电池边缘的焦力粘附和外围褶皱。在每种治疗条件和时间下，获取每个盖玻片在多个视场中的 20-30 个细胞的图像。通过组合复制，这将产生至少60个细胞，以便执行统计分析。保存并导出荧光图像作为 。TIFF 文件，分辨率至少为 300 dpi。

5. 定量应力纤维、细胞循环和焦点附着力形成

注:以下图像分析使用最新版本的开源成像处理包斐济只是图像J（斐济），可以免费下载（http://fiji.sc/）。

1. 一般图像处理
   注:所有图像都需要通过执行下面的步骤 5.1.1-5.1.5 来准备用于计算分析（图 2）。之后，可以选择任何或所有后续量化程序。
   1. 打开 .使用斐济的 TIFF 荧光图像。确保图像为 8 位和灰度。
   2. 选择图像调整窗口/电平并选择"自动"（图2A）。
   3. 选择"过程-减法背景"可减去背景荧光。检查滑动抛物线，并选择 50 像素的滚球半径选项 （图 2B）。
      注: 要验证滚动球半径的正确大小，请选择"线工具"，并在图像中的最大附着力上绘制半径。选择"度量值"可验证所绘制的线的长度。如果半径的值过大，则图像中会丢失包括粘附在内的特征。如果半径太小，则由于背景噪声，将在处理的图像中产生伪影。
   4. 选择图像调整- 亮度/对比度以检查背景上的粘附强度。如有必要，请进行调整。
      注:要优化亮度/对比度并避免信号饱和，请使用图像的查找工具检查其直方图以调整亮度/对比度。
   5. 在"分析集测量"下选择以下参数:面积、平均灰值、形状描述符和集成密度。
2. 应力纤维形成分析
   注:应力纤维可以根据表型多种方式量化。
   1. 将具有应力纤维的细胞数计为细胞总数的百分比。如果在不同的实验条件下形成的应力纤维数量存在视觉差异，则此分析最值得一接受。
   2. 计算横向细胞的应力纤维数。此分析允许比较每个细胞形成的应力纤维的数量。
   3. 测量每^{细胞17、18}的磷化物（例如，F-actin）染色给予的总荧光强度。此方法将突出显示由于 F-actin 染色引起的荧光强度的急剧增加/降低。
      1. 在上面的步骤 5.1.5 中设置测量参数。
      2. 在斐济工具栏中选择"手绘工具"并手动跟踪感兴趣的单元格。选择"分析度量"。将出现一个新窗口，显示选定的测量参数。
      3. 在斐济工具栏中选择"手绘工具"，然后手动跟踪没有单元格的空白空间。选择"分析度量"。此测量将用作背景荧光。
      4. 使用以下公式确定每个细胞的总 F-actin 荧光:
         
         注: 所得的测量可以归一化，并与其他细胞进行比较，以给出每个细胞的F-actin荧光。
3. 细胞循环分析
   注:有关细胞面积的信息（细胞随时间扩散的指示器），以及循环度也可以记录。此测量以 0 到 1 之间的比率给出，作为量化分别拉长到圆的单元格的方法。
   1. 在斐济工具栏中选择"手绘工具"，然后跟踪单个单元格。选择"图像测量"并记录每个像元的像元面积和周长测量值。对每个单元格重复此过程。
      注:在"设置测量"功能下，循环作为形状描述符测量（步骤 5.1.5）提供。
   2. 如图 3 和图 4所示，手动计算每个细胞中富素的褶皱或突起。
4. 焦点粘附分析
   注:在执行焦点粘附分析之前，请在最新版本的斐济上安装墨西哥帽子过滤器插件。以下协议已由先前的研究19、20、21修改。
   1. 使用块大小为 19、直方图条柱 256 和最大斜率 6（无掩码且不快）选择"过程增强局部对比度 （Clahe）。（图2C）
   2. 选择过程过滤器- 高斯模糊与西格玛（半径）为2.0来过滤图像（图2D）。
   3. 选择半径为 2.0 的插件-墨西哥帽子过滤器 （Mhf）（图 2E）。
   4. 使用Huang或等值数据作为阈值方法运行"阈值"并选择"暗背景"和"过度/下"。选择自动阈值。
      注: 此步骤可确保突出显示粘附，但也彼此不同。
   5. 选择"分析-分析粒子"，选择以下参数:大小=20、像素-无穷大和圆度=0.00-0.99。检查轮廓以确保正确检测和分离焦部粘附。
      注:这些结果生成各个焦点粘附的数量、面积和形状描述。

结果

实验设置的一般架构

图1显示了从REF52细胞血清饥饿开始，以获得荧光图像的计算分析结束的细胞粘附和扩散协议的一般架构。时间线中说明了协议中的关键步骤。值得注意的是，协议的第 2 步描述了 FN 涂层盖玻片的制备，该表应与步骤 3 同时进行:血清饥饿的 REF52 细胞在将其置于悬浮状态之前（图 1A）。在荧光显微镜样品固定之前?...

讨论

此处描述的协议是一种通用且经济的方法，可快速筛选多个与锚固相关的细胞类型，以便在细胞扩散期间进行动态细胞骨架重塑。特别是，当细胞粘附在FN上时，这种方法定量地检查氧化应激期间的应力纤维和焦点粘附形成（图1A）。此外，这些细胞表型可能建议一个监管作用的Rho家族的小GTPases的成员，因为他们有记录的作用，在细胞附件和传播15，16，22。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life Technologies	25300-054	cell dissociation
10 cm2 dishes	Cell Treat	229620	sterile, tissue culture treated
15 mL conical tubes	Fisher Scientific	05-539-5	sterile
1X Phosphate Buffered Saline	Corning Cellgro	21-031-CV	PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+
24-well cell culture treated plates	Fisher Scientific	07-200-740	sterile, tissue culture treated
4°C refrigerator	Fisher Scientific
Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165)	BD Transduction Laboratories	610620	marker of focal adhesions
Aspirator	Argos	EV310
Biosafety cabinet	Nuair	NU-477-400	Class II, Type A, series 5
Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder	Fisher Scientific	BP9704-100	dlBSA
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231-100	organic solvent to dissolve Ku55933
Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose	Fisher Scientific	11965092	REF52 base cell culture medium
Fetal bovine serum	Fisher Scientific	16000044	certified, cell culture medium supplement
Fiji	National Institutes of Health	http://fiji.sc/	image analysis program
Filter syringe	Fisher Scientific	6900-2502	0.2 µM, sterile
Glass coverslips (12-Cir-1.5)	Fisher Scientific	12-545-81	autoclave in foil to sterilize
Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	fluorescent secondary antibody, light sensitive
Goat Serum	Gibco by Life Technologies	16210-064	component of blocking solution for immunofluorescence
Hemocytometer	Fisher Scientific	22-600-107	for cell counting
Human Plasma Fibronectin	Gibco by Life Technologies	33016-015	FN
IX73 Fluorescence Inverted Microscope	Olympus		microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation
Ku55933	Sigma-Aldrich	SML1109-25MG	ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species
L-glutamine	Fisher Scientific	25-030-081	cell culture medium supplement
Monochrome CMOS 16 bit camera	Optimos
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	PFA, fixative for immunofluorescence
Penicillin-streptomycin	Fisher Scientific	15-140-122	P/S, antibiotic solution for culture medium
Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe)	Invitrogen	A12381	marker of F-actin, light sensitive
ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI	Invitrogen	P36941	cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive
REF52 cells			Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018
Stir plate with heat control	Corning Incorporated	PC-420D
Syringe	BD Biosciences	309653	60 mL syringe
Tissue culture incubator	Nuair
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500	detergent used to permeabilize cell membranes
Trypan Blue Solution	Fisher Scientific	15-250-061	for cell counting
Trypsin Neutralizing Solution (1x)	Gibco by Life Technologies	R-002-100	TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum
tube rotator	Fisher Scientific	11-676-341
water bath	Fisher Scientific	FSGPD02