세포 부착의 역학 을 검사 하 고 산화 스트레스 동안 Fibronectin에 상피 세포의 확산

요약

이 방법은 세포 부착의 초기 역학을 정량화하고 앵커리지 의존적 세포를 섬유넥틴상으로 확산시키는 데 유용하다. 더욱이, 이 분석은 세포 확산 및/또는 세포 부착 관련 세포 내 신호 경로에 변경된 산화배 항상성의 효력을 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

초록

세포 외 매트릭스 (ECM)에 세포의 접착 그리고 퍼짐은 유기체 발달 도중 및 성인 조직의 항상성에 대한 필수적인 세포 과정입니다. 흥미롭게도, 산화 스트레스는 이러한 과정을 변경할 수 있습니다., 따라서 전이성 암 같은 질병의 병 리 생리학에 기여. 따라서, 세포가 산화되는 동안 ECM에 부착되고 퍼지는 방법의 메커니즘을 이해하면 정상 및 질병 상태에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 아래에 기재된 단계별 프로토콜은 면역형광계 분석기를 사용하여 시험관내 섬유넥틴(FN)에 불멸의 섬유아세포 세포의 세포 부착 및 확산을 구체적으로 정량화하는 것이다. 간략하게, 앵커리지 의존성 세포는 산성 스트레스를 유도하기 위해 ATM 키나제 억제제 Ku55933에 노출되고 현탁액에 보유된다. 세포는 FN 코팅 된 표면에 도금되고 소정의 기간 동안 부착 할 수 있습니다. 부착된 상태로 남아 있는 세포는 부착(예를 들어, paxillin) 및 확산(예를 들어, F-액틴)의 형광 계 항체 마커로 고정및 표지된다. 데이터 수집 및 분석은 epifluorescence 현미경 및 자유롭게 사용할 수 있는 피지 소프트웨어를 포함하여 일반적으로 이용 가능한 실험실 장비를 사용하여 수행됩니다. 이 절차는 매우 다재다능하고 다양한 세포주, ECM 단백질, 또는 억제제에 대해 광범위한 생물학적 질문을 검사하기 위해 변형될 수 있다.

서문

세포 매트릭스 접착 (즉, 초점 접착)은 세포 접착 및 확산을 중재하는 크고 역동적 인 다분자 단백질 복합체입니다. 이러한 프로세스는 조직 개발에 대 한 중요 한, 유지 보수, 그리고 생리 기능. 국소 유착은 세포외 기질 (ECM)에 세포골격 액틴을 연결하는 스캐폴딩 단백질뿐만 아니라 인테그린과 같은 막 결합 수용체로 구성된다^1. 이러한 복합체는 다양한 신호 전달 경로의 활성화를 통해 세포 외 환경에 존재하는 물리 화학 적 단서에 반응 할 수있다. 이와 같이, 초점 유착은 지시된 이동, 세포 주기 규칙, 분화 및^생존을포함하는 다수의 세포 과정으로 세포 외 기계적 단서를 전파하는 신호 센터로서 역할을 한다^1,2. 초점 유착을 조절하고 상호 작용하는 신호 분자의 한 그룹은 작은 GTPases의 Rho 가족의 구성원을 포함합니다. Rho GTPases는 그들의 특정 spatiotemporal 활성화3를 통해 세포 이동 및접착 역학을 통제하는 중요한 단백질입니다. 당연히, Rho 단백질 기능의 dysregulation는 전이, 혈관 신생 및 그 외와 같은 인간적인 병리의 수에서 연루되었습니다. 특히, 세포 산화 상태는 세포 이동 및 접착의 변조에 지배적 인 역할을한다. 반응성 산소 종(ROS)의 증가와 같은 레독스 항상성의 변화는 다수의 세포 유형 및 인간 질병에서 로단백질 활성뿐만 아니라 유착을 조절하는 것으로 입증되었다^{4,5,6 ,7},^8. 예를 들어, DNA 손상 수리 세린/트레오닌 키나아제 A-T 돌연변이(ATM)의 돌연변이에 의해 야기되는 신경장애 운동실조-말실증(A-T)을 앓고 있는 개인은 전이성 암의 위험이 증가합니다^{9. 10}. 이러한 환자와 세포주에서 ATM 키나아제 활성의 손실은 유전적 돌연변이 또는 화학적 억제를 통해, 펜토스 인산통로의 기능 장애로 인한 높은 수준의 산화 스트레스를 초래한다^{7,11, 12}. 더욱이, 실험실에서 최근 연구는 시험관에서 Rho 가족 GTPases를 활성화의 직접적인 결과로 세포골격 역학 (즉, 접착 및 확산)을 변경하여 A-T에서 ROS에 대한 병리생리학적 역할을 강조했다^5. 궁극적으로, 로가족 활성화에 의한 세포골격역학의 이러한 변화는 A-T 환자^5,13에서언급한 전이성 암의 위험 증가로 이어질 수 있다. 따라서 산화 스트레스 동안 세포 매트릭스 상호 작용 간의 상호 작용을 이해하면 접착 및 확산 의 조절에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이러한 연구는 또한 이러한 신호 프로세스에서 Rho 가족 GTPases에 대 한 가능한 역할에 대 한 추가 조사를 위한 무대를 설정할 수 있습니다.

본원에 기재된 프로토콜은 ATM 키나아제 활성의 억제에 의해 야기된 산화 스트레스 동안 유착 어셈블리 및 확산의 초기 세포 역학을 연구하는 프로토콜이다. 이러한 분석은 ECM 단백질 피브로넥틴(FN)에 대한 앵커리지 의존성 세포의 잘 특성화된 기전을 기반으로 한다. 현탁액에서 유지되는 세포가 FN 상에 도금되면, 몇몇 Rho GTPases는 액틴 시토스켈레탈 리모델링^3,14의제어를 조정한다. 형태학적 변화는 세포가 원형과 원형의 원형에서 평평해지고 팽창하는 것으로 이동함에 따라 관찰됩니다. 이러한 관찰과 수반되는 것은 ECM과 수많은 매트릭스 유착의 개발이다. 이러한 변화는 세포가 ^15,16을부착하고 확산함에 따라 첫 번째 시간 동안 Rac1을 가진 RhoA의 양면 활성화에 기인합니다.

세포 확산뿐만 아니라 접착 형태및 역학을 검사하기 위해 다양한 방법이 활용되었습니다. 그러나, 이 방법은 정교한 장기, 살아있는 화상 진찰 총 내부 반사 형광 (TIRF) 또는 공초점 현미경 검사법에 의존합니다. 따라서 사용자는 특수 장비 및 소프트웨어에 액세스할 수 있어야 합니다. 또한, 이러한 바이오 이미징 시스템에 필요한 설정 시간은 특히 여러 억제제 또는 치료 조건을 동시에 테스트할 때 초기 접착 이벤트를 포착하는 데 어려움을 겪고 있습니다.

본 명세서에서 상세한 방법은, 접착 어셈블리및 시험관 내 확산을 제어하는 파라미터를 평가하는 간단하고 경제적이면서도 정량적인 방법을 제공한다. 프로토콜은 상피 현미경 및 CCD 카메라와 같은 일반적으로 이용 가능한 실험실 장비를 사용하여 수행됩니다. 이 분석법은 ATM 키나아제 활성의 화학적 억제에 의한 산화 스트레스의 기간 후에 FN 코팅 된 표면에 앵커리지 의존 세포를 적용하는 것을 포함하며, 이는 이전에 입증된^5. 도금 후, 셀은 지정된 시간 동안 부착및 부착할 수 있습니다. 부착되지 않은 세포는 부착된 세포가 부착의 마커(예를 들어, paxillin) 및 확산(예를 들어, F-액틴)에 형광계 항체로 고정및 표지되는 동안^2,5. 이 단백질은 그 때 epifluorescence 현미경을 사용하여 구상되고 기록됩니다. 후속 데이터 분석은 자유롭게 사용할 수있는 피지 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 더욱이, 이 방법은 다양한 ECM 단백질, 다양한 산화제/세포 배양 조건 또는 다양한 앵커리지 의존성 세포주를 포함하는 광범위한 조건 하에서 접착 역학을 검사하는 데 적용될 수 있다. 생물학적 질문.

프로토콜

1. 준비

참고: 아래에 설명된 프로토콜은 REF52 세포 및 ATM^+/+ 또는^ATM-/- 인간 섬유아세포와 함께 사용하기 위해 최적화되었습니다. 다른 세포 유형은 아래 노트 및 문제 해결 섹션에 설명된 대로 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.

1. REF52 세포에 대한 완전한 세포 배양 배지의 500 mL를 만드십시오. Dulbecco의 수정 된 독수리 배지 (DMEM)를 포함하는 고혈당 500 mL에 10 % FBS, 2 mM L-글루타민 및 100 단위 / mL 페니실린 스트렙 토마이신을 추가합니다.
2. 멸균 1x 인산완충 식염수(PBS), pH 7.4의 12 mL에 1 mg/mL FN 용액 300 μL을 추가하여 피브로넥틴(FN)의 25 μg/mL 용액을 준비합니다. 잘 섞으세요.
3. 혈청 프리 DMEM 세포 배양 배지에서 0.5% (w/v) 탈립(즉, 지방산 불포함) 소 혈청 알부민(dlBSA) 용액을 준비한다. 0.5 g의 dlBSA를 100 mL의 혈청 프리 DMEM 배지에 추가합니다. 용액을 잘 섞지 만 소용돌이를하지 마십시오. 사용하기 전에 0.22 μM 주사기 필터를 사용하여 용액을 새로운 멸균 용기에 걸링합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
4. 1x PBS의 100 mL에 파라포름 알데히드 3.7 g을 용해시킴으로써 3.7 % 파라 포름 알데히드 용액을 만듭니다. 부드러운 열과 교반을 사용하여 파라포름알데히드를 용액으로 넣습니다.
   참고: 파라포름 알데히드 용액은 빛에 민감하며 빛으로부터 보호되어야 합니다. 4 °C에서 보관하면 최대 1 주일 동안 좋습니다.
   주의: 파라포름알데히드는 독성, 인화성, 부식성 및 건강상의 위험이 있습니다. 사용하기 전에 파라포름알데히드에 대한 재료 안전 데이터 시트를 검토하십시오. 아이 쉴드, 페이스 쉴드, 전면 입자 호흡보호구, 장갑 및 실험실 코트를 포함하여 취급할 때 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오.
5. 1x PBS (v /v)에서 0.2 % 비 이온 계면 활성제를 함유하는 투과 솔루션을준비하십시오. 100 mL의 경우, 교반하면서 트리톤 X-100 ~ 100 mL의 0.2 mL를 천천히 추가합니다.
6. 1x PBS 용액에 용해된 2.5% BSA, 5% 염소 혈청 및 0.05% 비이온 계면활성제(w/v/v)를 함유하는 면역형 광차단 완충제를 만든다. 100 mL의 경우, 교반하면서 염소 세럼 5 mL, BSA 2.5 g, 트리톤 X-100 0.05 mL을 95 mL 1x PBS에 넣습니다.
7. 37°C 및 5%_CO2에서세포 배양 인큐베이터에서 10^cm2(또는 임의의 다른 용기 크기) 세포 배양 플레이트에서 DMEM 완전 배양 배지에서 REF52 세포를 성장시다.

2. 세포 외 매트릭스 단백질 피브로넥틴으로 세포 배양 판을 코팅

참고: BSL-2 인증 층류 후드에서 무균 기술과 멸균 시약을 사용하여 이 섹션을 수행합니다. 시작하기 전에 주요 단계에 대한 개요는 그림 1A를 참조하십시오.

1. 조직 배양 인증 24웰 플레이트를 사용하여, 각 우물에 유리 커버슬립 1개(12-Cir-1)를 놓습니다. 그림 1B에따라 플레이트에 라벨을 붙입니다.
2. 25 μg/mL FN 용액의 피펫 500 μL을 24웰 플레이트의 각 웰에.
3. 코팅과 완전한 침수를 보장하기 위해 각 커버에 용액을 몇 번 슬립합니다. 뚜껑을 접시에 다시 놓습니다.
4. 플레이트를 37°C 및 5%_CO2에서 1시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 배양한다.
   참고: 또는 4°C에서 밤새 배양하십시오.
5. 1 시간 후, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 우물에서 FN 용액을 흡인한다.
6. 1x PBS의 500 μL로 우물을 세 번 씻으소서. 1x PBS의 최종 세척을 흡인합니다.
7. 37°C 및 5%_CO2에서최소 15분 동안 0.5% dlBSA 용액의 500 μL로 웰을 차단합니다.
8. 아래 3단계에서 도금 전지를 하기 전에 dlBSA 용액을 흡인한다.
   참고: 플레이트를 보관하는 경우 dlBSA 용액을 포위한 후 각 커버슬립에 500 μL의 1x PBS를 추가하십시오. 플레이트는 최대 1주일 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.

3. 부착 분석에 대한 앵커리지 의존적 세포 준비

참고: BSL-2 인증 층류 후드에서 무균 기술과 멸균 시약을 사용하여 이 섹션을 수행합니다.

1. 셀 도금 전에 적어도 30 분, 다음 솔루션을 미리 따뜻하게 : DMEM 완전한 매체, dlBSA 용액, 1 x PBS, 0.5 % 트립신 - EDTA 솔루션, 37 ° C 수조에서 트립신 중화 혈청 (TNS).
2. 10cm² 접시에 REF52 세포의 결합 단층으로 시작하여 따뜻한 1x PBS 6 mL로 세포를 두 번 씻으하십시오. 혈청은 37°C 및 5%_CO2에서6 mL의 따뜻한 dlBSA 용액에서 적어도 1 시간 동안 (세포 유형에 따라 다름) 세포를 굶어.
3. 6 mL의 따뜻하게 한 1x PBS로 세포를 세척하고 PBS를 흡인하고 따뜻한 0.5 % 트립신 -EDTA 용액 1.5 mL을 추가하십시오.
4. 세포를 37°C및 5%_CO2에서 ~2분 동안 세포 배양 인큐베이터에 놓는다.
5. 가벼운 현미경으로 세포를 관찰하여 분리가 완료되었는지 확인합니다. 세포가 벤치 상판에 플레이트를 두드린 후에도 여전히 부착되어 있는 경우, 37°C 인큐베이터로 되돌려 추가로 2분 간. 필요에 따라 적은 시간 동안 세포를 트립시니화한다.
6. 파이펫 1.5 mL의 따뜻한 트립신 중화 용액 (TNS)을 접시에 트립시니화를 중지하고 분리 된 세포를 수집합니다. 용액을 플레이트 바닥상에서 여러 번 파이펫하여 남은 모든 부착 셀을 제거합니다. 세포가 덩어리로 나타나면 접시 뒤쪽에서 부드럽게 위아래로 파이펫팅하여 셀 현탁액을 삼각화하십시오.
7. 경현미경으로 트립판 블루 배제 및 혈세포계를 사용하여 세포를 카운트합니다. 또는 자동화된 셀 카운터를 사용합니다.
8. 15 mL 원엽 튜브에서 dlBSA의 5 mL에서 1.0 - 3.0 x 10⁴ 세포 /mL 세포 현탁액을 생성하기 위해 적절한 양의 세포를 제거합니다.
9. ~ 300 x g에서 5 분 동안 테이블 탑 원심 분리기에서 고정 각도 로터를 사용하여 원심 분리기 세포.
10. 세포 펠릿으로부터 상월체를 흡인하고, 총 7 mL의 따뜻한 dlBSA 용액에서 세포를 재중단시켰다. 커버슬립 도금 시 세포가 지나치게 동조되는 것을 허용하지 말고, 서로 접촉하는 세포가 거의 없는 균등하게 분포한다.
11. 세포 현탁액을 2개의 15 mL 원뿔형 튜브로 균등하게 나누고, 하나는 비히클 단독 제어(DMSO)와 Ku55933(ATM 키나제 억제제, 산화제)에 대해 하나^5. 각 튜브에 3.5 mL의 셀 현탁액이 포함되어 있는지 확인하십시오.
12. 튜브 회전기를 사용하여, 세포 배양 인큐베이터에서 90-120분 동안 37°C에서 튜브를 회전한다.
13. 도금 30분 전에 각 튜브에 10 μM Ku55933 및 DMSO(1:1,000)의 최종 농도를 추가합니다. 셀 서스펜션을 남은 시간 동안 회전자 위에 다시 놓습니다.
14. 세포를 도금하기 직전에, 인큐베이터로부터 24웰 플레이트를 회수하고 dlBSA 용액을 흡인한다.
15. 세포 현탁액을 90-120분 동안 회전한 후, 각 처리군으로부터 500 μL의 세포 현탁액을 제거하고 24-웰 플레이트에서 1개의 FN 코팅 커버슬립을 2단계로부터 첨가하였다(도1B). 플레이트를 37°C 및 5%_CO2 세포 배양 인큐베이터로 되돌리고 세포 현탁액을 다시 회전한다.
16. FN 커버슬립상에 셀 현탁액을 도금한 후, 세포가 원하는 시간(예를 들어, 10분, 15분, 20분, 30분)동안 부착되도록 한 다음 즉시 4단계로 진행한다.

4. 면역 형광을 위한 세포 고정 및 항체 염색

참고: 다음 단계는 달리 명시되지 않는 한 비멸균 조건 및 실온에서 수행됩니다.

1. 접착이 필요한 시간이 경과한 후, 플레이트의 각 커버슬립에서 셀 용액을 흡인한다.
2. 우물의 측면을 사용하여 각 커버 슬립에 3.7 % 파라 포름 알데히드 용액 500 μL을 부드럽게 분배하고 10-15 분 기다립니다.
3. 파라포름알데히드 용액을 제거하고 각 커버슬립을 500 μL의 1x PBS로 총 2회 세척합니다.
   참고: 기관의 환경 보건 및 안전 계획에 따라 파라포름 알데히드 폐기물을 책임감 있게 폐기하십시오.
4. PBS를 흡인하고, 실온에서 10-15분 동안 1x PBS(v/v)에서 0.2% 트리톤 X-100의 500 μL로 각 커버슬립에 세포를 투과시한다.
5. 각 커버슬립을 1x PBS의 500 μL로 3회 세척합니다.
6. 5% 염소 혈청, 2.5% BSA 및 0.05% 트리톤 X-100을 함유하는 면역형광 차단 완충액500 μL로 각 커버슬립상의 세포를 1 x PBS 용액에 30-60분 동안 용해시블한다.
7. 차단 완충제에서 1차 항팍실린 항체(1:250)를 희석한다. 잘 섞어서 각 커버슬립에 항체 용액200 μL을 추가합니다. 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양하십시오.
   참고: 대안적으로, 1차 항체 용액은 4°C에서 하룻밤 동안 배양될 수 있다. 염색 복합체 및 후속 FA 분석에 사용될 수 있는 많은 일반적인 초점 접착 마커가 있습니다. 이들은 인테그린 소단위 (β1, α5, 또는 αV), 탈린, 또는 vinculin^2:다음 단백질에 대하여 항체를 포함합니다.
8. 항체 용액을 흡인하고, 각 커버슬립을 1x PBS의 500 μL로 각각 10분 동안 3회 세척한다. 이 지점에서 앞으로 빛으로부터 샘플을 보호하십시오.
9. 동일한 차단 완충액에서 적색 형광 알렉사 594 염료(1:1000) 및 염소 항 마우스 488형광이차 항체(1:400)에 공액화된 팔로이드 F-액틴 프로브를 희석한다. 잘 섞어서 각 커버슬립에 200 μL의 항체 용액을 30분 동안 넣습니다.
   참고: 다른 종으로부터형광성으로 공액된 이차 항체도 사용될 수 있다. 그러나, 다른 종으로부터항체의 사용은 차단 완충제 혈청의 변형을 요구할 것이다.
10. 항체 용액을 흡인하고, 각 커버슬립을 1x PBS의 500 μL로 각각 10분 동안 3회 세척한다.
11. 1x PBS를 흡인하고 dIH₂O의 500 μL로 한 번 헹구는다.
12. DAPI를 포함하는 안티 페이드 장착 매체를 사용하여 현미경 슬라이드에 전표를 장착합니다.
13. 현미경 슬라이드를 두고 실온에서 어둠 속에서 하룻밤 을 설정합니다.
14. 현미경 슬라이드를 4 °C에서 어두운 환경에서 저장하여 장기간 보관하고 이미징이 끝날 때까지 보관하십시오.
    참고 : 표준 면역 형광 기술을 사용하여 이미지. 고출력 오일 침지 60배 대물 렌즈를 사용하여 셀 가장자리의 초점 접착력과 주변 주름을 기록할 수 있는 충분한 해상도를 확보하는 것이 좋습니다. 각 치료 조건 및 시간에 따라 각 커버슬립에 대해 여러 시야에서 20-30개의 셀 이미지를 수집합니다. 결합된 복제본에서 통계 분석을 수행하려면 최소 60개의 셀을 생성해야 합니다. 형광 이미지를 로 저장하고 내보내기. 최소 300dpi 해상도의 TIFF 파일.

5. 응력 섬유, 세포 순환 및 초점 접착 형성 정량화

참고 : 다음 이미지 분석은 (http://fiji.sc/) 무료로 다운로드 할 수있는 피지 그냥 이미지 J (피지)의 최신 버전을 사용하여 수행됩니다.

1. 일반 이미지 처리
   참고: 모든 이미지는 아래 5.1.1-5.1.5 단계를 수행하여 계산 분석을 위해 준비해야합니다(그림 2). 그 후, 모든 후속 정량화 절차를 선택할 수 있다.
   1. 을 엽니다. 피지를 사용 하 여 TIFF 형광 이미지입니다. 이미지가 8비트 및 그레이스케일인지 확인합니다.
   2. 이미지 조정 창/레벨을 선택하고 자동(그림 2A)을선택합니다.
   3. 배경 형광을 빼려면 프로세스 빼기 배경을 선택합니다. 포물선 슬라이딩을 선택하고 롤링 볼 반지름 50픽셀(그림2B)의옵션을 선택합니다.
      참고: 롤링 볼 반지름에 적합한 크기를 확인하려면 선 도구를 선택하고 이미지에서 가장 큰 접착력에 반지름을 그립니다. 측정을 선택하여 그려진 선의 길이를 확인합니다. 반지름 값이 너무 크면 이미지에서 접착을 포함한 피쳐가 손실됩니다. 반지름이 너무 작으면 배경 잡음으로 인해 처리된 이미지에서 아티팩트가 발생합니다.
   4. 이미지 조정- 밝기/대비를 선택하여 배경에 접착강도를 확인합니다. 필요한 경우 조정합니다.
      참고: 밝기 / 콘트라스트를 최적화하고 신호를 포화하지 않으려면 이미지의 조회 도구를 사용하여 히스토그램을 검사하여 밝기 / 대비를 조정하십시오.
   5. 분석-세트 측정:면적, 평균 회색 값, 모양 설명자 및 통합 밀도에서 다음 매개변수를 선택합니다.
2. 응력 섬유 형성 분석
   참고: 응력 섬유는 표현형에 따라 여러 가지 방법으로 정량화될 수 있습니다.
   1. 총 셀 수에 대한 백분율로 응력 섬유가 있는 셀 수를 계산합니다. 이 분석은 서로 다른 실험 조건 하에서 형성된 응력 섬유의 수에 시각적 차이가 있는 경우에 가장 좋습니다.
   2. 셀을 가로대하는 응력 섬유의 수를 계산합니다. 이 분석은 세포 당 형성된 응력 섬유의 수를 비교하는 것을 허용합니다.
   3. 세포 당 염색된 플라할로이드(예를 들어, F-액틴)에 의해 주어진 총 형광 강도를^{측정한다 17,18.} 이 방법은 F-액틴 염색으로 인한 형광 강도의 급격한 증가/감소를 강조합니다.
      1. 위의 5.1.5단계에서 측정 파라미터를 설정합니다.
      2. 피지 도구 모음에서 자유형 도구를 선택하고 관심 있는 셀을 수동으로 추적합니다. 분석 측정을선택합니다. 선택한 측정 매개 변수를 보여주는 새 창이 나타납니다.
      3. 피지 도구 모음에서 자유형 도구를 선택하고 셀이 없는 빈 공간을 수동으로 추적합니다. 분석 측정을선택합니다. 이 측정은 배경 형광으로 작용합니다.
      4. 아래 방정식을 사용하여 세포당 총 F-액틴 형광을 결정합니다.
         
         참고: 생성된 측정은 세포당 F-액틴 형광을 주기 위해 다른 세포와 비교하여 정규화될 수 있습니다.
3. 세포 순환성 분석
   참고 : 세포 영역에 대한 정보 (시간이 지남에 따라 퍼지는 셀의 지표) 뿐만 아니라 원형도 기록 할 수 있습니다. 이 측정은 각각 둥글게 길쭉한 셀을 정량화하는 방법으로 0에서 1 사이의 비율로 제공됩니다.
   1. 피지 도구 모음에서 자유형 도구를 선택하고 개별 셀을 추적합니다. 이미지 측정을 선택하고 각 셀의 셀 면적 및 둘레 측정값을 기록합니다. 각 셀에 대해 이 절차를 반복합니다.
      참고: 설정 측정 기능에서 원형은 모양 설명자 측정(5.1.5 단계)으로 제공됩니다.
   2. 그림 3 및 그림 4에 설명된 대로 셀당 액틴이 풍부한 주름 또는 돌출부를 수동으로 계산합니다.
4. 초점 접착 분석
   참고 : 초점 접착 분석을 수행하기 전에, 피지의 최신 버전에 멕시코 모자 필터 플러그인을 설치합니다. 다음 프로토콜은 이전 연구^{19,20,21에서}수정되었습니다.
   1. 블록 크기 19, 히스토그램 저장소 256, 최대 경사 6을 사용하여 마스크없이 빠르지 않은 최대 경사를 사용하여 프로세스 향상 로컬 대비(Clahe)를 선택합니다. (그림2C)
   2. 프로세스 필터- 시그마(반지름)가 2.0인 가우시안 블러를 선택하여 이미지를 필터링합니다(그림2D).
   3. 반경이 2.0인 플러그인-멕시코 모자 필터(Mhf)를 선택합니다(그림2E).
   4. 임계값을 실행하고 황 또는 Isodata를 임계값 방법으로 사용하여 어두운 배경 및 오버/언더를 선택합니다. 자동 임계값을선택합니다.
      참고: 이 단계를 수행하면 유착이 강조 표시되고 서로 구별됩니다.
   5. 다음 매개변수를 선택한 파티클 분석(크기=20, 픽셀 무한대 및 원형=0.00-0.99)을 선택합니다. 윤곽선을 확인하여 초점 접착을 적절히 감지하고 분리합니다.
      참고: 이러한 결과는 개별 초점 접착의 수, 면적 및 모양 설명을 생성합니다.

결과

실험 설정의 일반적인 스키마

도 1은 REF52 세포의 혈청 결치로 시작하여 후천형광이미지의 전산분석으로 끝나는 세포 부착 및 확산 프로토콜에 대한 일반적인 스키마를 나타낸다. 프로토콜의 주요 단계는 타임라인에 나와 있습니다. 참고로, 프로토콜의 2단계는 FN 코팅 커버슬립의 제조를 기술하며, 이는 3단계와 동시에 수행되어야 한다: 혈청 을 분주하게...

토론

여기서 설명된 프로토콜은 세포 확산 동안 동적 세포골격 리모델링을 위한 다수의 앵커리지 의존성 세포 유형을 신속하게 스크리닝하는 다목적및 경제적인 방법입니다. 특히, 이 방법은 세포가 FN에 부착될 때 산화 스트레스 동안 응력 섬유 및 국소 접착 형성을 정량적으로 검사한다(도1A). 더욱이, 이들 세포 표현형은 세포 부착 및 확산^15,

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life Technologies	25300-054	cell dissociation
10 cm2 dishes	Cell Treat	229620	sterile, tissue culture treated
15 mL conical tubes	Fisher Scientific	05-539-5	sterile
1X Phosphate Buffered Saline	Corning Cellgro	21-031-CV	PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+
24-well cell culture treated plates	Fisher Scientific	07-200-740	sterile, tissue culture treated
4°C refrigerator	Fisher Scientific
Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165)	BD Transduction Laboratories	610620	marker of focal adhesions
Aspirator	Argos	EV310
Biosafety cabinet	Nuair	NU-477-400	Class II, Type A, series 5
Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder	Fisher Scientific	BP9704-100	dlBSA
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231-100	organic solvent to dissolve Ku55933
Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose	Fisher Scientific	11965092	REF52 base cell culture medium
Fetal bovine serum	Fisher Scientific	16000044	certified, cell culture medium supplement
Fiji	National Institutes of Health	http://fiji.sc/	image analysis program
Filter syringe	Fisher Scientific	6900-2502	0.2 µM, sterile
Glass coverslips (12-Cir-1.5)	Fisher Scientific	12-545-81	autoclave in foil to sterilize
Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	fluorescent secondary antibody, light sensitive
Goat Serum	Gibco by Life Technologies	16210-064	component of blocking solution for immunofluorescence
Hemocytometer	Fisher Scientific	22-600-107	for cell counting
Human Plasma Fibronectin	Gibco by Life Technologies	33016-015	FN
IX73 Fluorescence Inverted Microscope	Olympus		microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation
Ku55933	Sigma-Aldrich	SML1109-25MG	ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species
L-glutamine	Fisher Scientific	25-030-081	cell culture medium supplement
Monochrome CMOS 16 bit camera	Optimos
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	PFA, fixative for immunofluorescence
Penicillin-streptomycin	Fisher Scientific	15-140-122	P/S, antibiotic solution for culture medium
Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe)	Invitrogen	A12381	marker of F-actin, light sensitive
ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI	Invitrogen	P36941	cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive
REF52 cells			Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018
Stir plate with heat control	Corning Incorporated	PC-420D
Syringe	BD Biosciences	309653	60 mL syringe
Tissue culture incubator	Nuair
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500	detergent used to permeabilize cell membranes
Trypan Blue Solution	Fisher Scientific	15-250-061	for cell counting
Trypsin Neutralizing Solution (1x)	Gibco by Life Technologies	R-002-100	TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum
tube rotator	Fisher Scientific	11-676-341
water bath	Fisher Scientific	FSGPD02