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摘要

该协议描述了使用硅纳米线在细胞内光学生物调制细胞在简单和易于执行的方法。该技术高度适应不同的细胞类型，可用于体外和体内应用。

摘要

肌纤维细胞可以自发地内化硅纳米线（SiNWs），成为生物电子应用的有吸引力的目标。这些细胞硅混合器件提供无铅光调制功能，对正常细胞行为的扰动最小。光功能由SiNW的光热和光电特性获得。这些杂交种可以使用标准组织培养技术进行收获，然后应用于不同的生物情景。我们在这里演示如何使用这些杂交体来研究心脏细胞的电耦合，并比较肌纤维细胞如何耦合彼此或心肌细胞。除了荧光显微镜和耦合激光线之外，无需特殊设备即可完成此过程。还显示使用定制的MATLAB例程，允许钙在培养中不同细胞内和不同细胞之间进行定量传播。显示肌纤维细胞的电反应比心肌细胞的电反应慢。此外，肌纤维细胞间传播显示稍慢，尽管其细胞内速度相当，表明通过间隙结或纳米管进行被动传播。这种技术具有很强的适应性，可以很容易地应用于其他细胞竞技场，用于体外以及体内或体外调查。

引言

所有生物有机体都使用离子形式的电来调节细胞行为。细胞膜包含各种类型的特定离子通道，允许离子的被动和主动传输。这些离子控制兴奋细胞的功能，如神经元活动、骨骼和心肌收缩。然而，生物电在非兴奋细胞中也起着重要的作用，它控制着许多细胞功能，如细胞增殖1、神经免疫2、3、4和干细胞分化5。

近几十年来，生物电领域引起了越来越多的关注，这促进了生物电子接口众多技术的发展。微电极贴片移液器是细胞内记录和刺激的黄金标准6。在这种方法中，玻璃移液器在特定条件下被拉扯，形成孔径为几微米的锋利边缘。此移液器充满缓冲器，移液器允许缓冲器与细胞内体积直接接触。这会产生一个生物电接口，产生极高的信噪比、对蜂窝电活动的精确控制以及极高的时间分辨率。虽然这种方法是一个极其强大的工具，最近被缩小为纳米移液器配置7，它与几个重要的技术限制有关。细胞胶稀释效应8，以及机械振动，将其效用限制在短期的审讯，它需要昂贵的专业设备和高水平的技术技能。此外，它的体积限制可以同时记录或刺激的细胞数量，并且由于其侵入性，它不能在整个实验中重新配置。为了克服这些限制，开发了微电极阵列，但电极的大小限制了空间分辨率以及细胞内访问。Nanoelectrode阵列允许细胞内记录和刺激，但需要磨蚀性电穿孔才能访问细胞胶9，10。此外，所有这些方法都是基质束缚的，因此仅限于体外细胞培养，或外部表面细胞，无法接触到三维（3D）组织内的细胞。

光遗传学11 被广泛用于解决这些3D和体内的限制。然而，光遗传学方法基于在等离子膜上分布的光激活等离子离子通道的扰动，限制了3D空间分辨率12 和细胞内功能。

我们最近发现，硅纳米线（SiNWs）可用于用亚微米空间分辨率进行细胞内生物电检测，具有不同的非兴奋细胞，即心肌细胞和寡头细胞13。此外，我们使用这些SiNW在3D心脏组织内进行前活细胞特异性询问，调查心脏细胞在体内如何电对14。这种方法的一个主要优点是它简单;它不需要任何基因改造或笨重的仪器。许多细胞会自发内化光反应的SiNW，无需声波或电穿孔15。此外，他们将自发地逃离内体封装，与细胞胶和细胞内细胞器13，15形成无缝整合。这些细胞-SiNW复合材料，称为细胞-硅混合体，具有原始细胞的动态、柔软和多功能特性，以及SiNW的光电功能。杂交后，利用标准组织培养技术采集细胞-SiNW杂交，用于细胞内生物电刺激等各种应用;体外研究细胞间生物电耦合;和体内细胞特定的审讯。由于有效的刺激需要高光功率密度和SiNW的共同定位，因此可以实现2D和3D的高空间分辨率。在该协议中，我们详细描述了方法，以及如何分析结果。重点是体外细胞内和细胞间研究，但这种方法的体内实施可直接用于许多其他生物情景。

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研究方案

为确保符合道德标准，芝加哥大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）首先批准了与啮齿动物心脏隔离心肌细胞有关的所有动物程序。此外，所有动物实验都是按照芝加哥大学亚组会的指导进行的。

1. 制备细胞-SiNW杂交

  1. 按照制造商的指南使用商业套件隔离原发性心肌细胞 （CMs）。
  2. 为原发细胞分离准备完整的DMEM，辅以10%的热灭活胎儿血清、1%青霉素链霉素和1%L-谷氨酰胺。
  3. 要将肌纤维细胞 （MM） 与 MFs-MM 悬浮液分离，请将分离的细胞预镀在组织培养盘上（从步骤 1.1. 每 100 mm 培养皿中从 2 颗心脏分离的细胞）上预镀 1 小时。由于 CMs 需要纤维素或胶原蛋白处理表面来粘附，因此只有 MFs 会附着在组织培养表面。
  4. 吸进富集的CMs细胞悬浮液。这些 CM 可用于异细胞耦合实验，如第 3 节所述。使用 DMEM 冲洗 MFs，以消除 MFs 盘中剩余的 1M。
  5. 向 MF 添加新鲜的培养介质，并允许它们扩散，直到它们汇合 80%（2-4 天）。每隔一天更换一次媒体。
  6. 当单元格准备就绪（80% 汇合）时，为下面的杂交步骤（步骤 1.7）准备 SiNW。
    注意:许多类型的 SiNW 都可用于此。在这个实验中，使用化学气相沉积（CVD）与核心壳p-i-n结连接配置的SiNW，如前面16所述。在 CVD 增长期间，SiNW 在硅晶片基板上生长，最终作为硅芯片保留，并覆盖在 SiNW 上。
  7. 使用金刚石划片从带 CVD 生长的 SiNW 的晶圆上切割 3 mm x 3 mm 芯片。使用锋利的钳子处理晶圆，并最小化与钳子接触的表面面积，因为这可能破坏 SiNW。
  8. 使用 70% 乙醇冲洗芯片，让乙醇在生物安全层流罩中的紫外线下干燥 30 分钟，对芯片进行消毒。
  9. 将芯片转移到无菌微离心管中，并使用完整的培养介质冲洗多余的乙醇。
  10. 添加 1 mL 的文化介质，在声波浴中对芯片进行声波化 1-10 分钟。当 SiNWs 发布到媒体时， 媒体应该变得浑浊。
    注:声波时间和功率应针对不同的声波或不同的细胞进行优化，因为较短的持续时间和较低的功率将产生更长的SiNW。
  11. 将 SiNWs 悬浮液添加到 5 mL 的培养介质中，然后用 MFs 将其播种到 100 mm 组织培养皿中。允许 SiNWs 内化 4 小时，然后用介质冲洗多余的 Siws 5 倍。允许部分内化 SiNW 完成内化，允许它们在使用前再坐 1 小时。
    注:不同的细胞类型可能需要不同的SiNW浓度和/或内化时间。
  12. 通过稀释胶原蛋白库存溶液（3mg/mL）和无菌20 mM醋酸，以1:50的比例准备胶原蛋白涂层溶液。在 35 mm 玻璃底盘中加入 0.5 mL 涂层溶液，在 37 °C 中可坐 1 小时。 取出溶液，用无菌 PBS 冲洗盘子。
  13. 在37°C下用3 mL的三辛治疗细胞2分钟，收获细胞-SiNWs杂交细胞。 加入10 mL的培养介质，通过移液剂大力冲洗杂交。以 200 x g 轻轻离心 5 分钟，以避免使用内化 SiNW 损坏细胞。去除多余的介质，用1 mL介质悬浮细胞，并将其播种到胶原蛋白处理玻璃底盘上。
    注:杂交组可以单独播种，研究细胞内或细胞间耦合，或与CM研究体外异细胞耦合。
  14. 通过标记细胞的细胞胶（钙蛋白-AM，4 μM）和膜（膜标记，2 μM）在37°C下30分钟，对SiNW内化进行最终验证，并使用共和显微镜对细胞进行成像。由于 SiNW 具有高反射性，因此可以使用反射光而不是荧光来可视化它们。

2. 细胞内和细胞间调查的制备

  1. 准备胶原蛋白涂层溶液，如1.12
  2. 对于细胞内电刺激，培养杂交的种子密度低。使用标准血细胞计计算第 1.11 节中的细胞。并在培养介质中 35 mm 玻璃底盘上播种 50，000 个细胞。对于细胞间调查，使用更高的细胞密度（每盘500，000个细胞）。对于 VM 和 MF 之间的细胞间耦合，使用新鲜隔离的 VM 共同培养混合体。
  3. 在进行光学刺激实验之前，允许细胞在一夜之间连接。对于细胞间调查，在37°C下允许48小时，让细胞在实验前表达细胞间间隙结。
  4. 通过将50μL的DMSO加入50μg Fluo-4 AM，制备钙敏感染料库存溶液（可保持在-20°C）。在 1 mL DMEM 中稀释 1 μL 染料，制备染色溶液。
  5. 从细胞中吸出培养培养剂，加入1mL染色溶液。让染料在37°C下内化为细胞20-30分钟。 吸气染料，用无菌PBS冲洗两次。
  6. 最后，加入1 mL的预热酚红色无DMEM介质，让细胞内氟-4在37°C下进行30分钟的脱酯化。
  7. 将细胞转移到显微镜进行成像和刺激。

3. 光学成像和刺激

  1. 将加湿微吸收器预热至37°C和气泡空气-CO2 混合物（95:5）。
  2. 使用显微镜与准直激光线耦合到光路径钙成像和光学刺激。
    注:扫描共声显微镜由于其点刺激功能，是最直接的选择。但是，使用任何标准荧光显微镜，可以使用光束分路器将准直激光束耦合到光路径的无穷空间中，完成此过程。任何显微镜目标的设计，使直准激光通过它将聚焦到衍射有限的激光点的焦点平面。激光波长应接近激发光，因此由二色镜反射，并通过激励滤波器。
  3. 可视化 SiNW 并使用亮场显微镜、透光或反射光确定刺激点。然后，重新配置荧光模式的光路径，同时保持在 SiNW 预定义位置的刺激点。
  4. 验证每个 SiNW 大小和细胞类型的最佳刺激功率和脉冲长度，以尽量减少对受刺激细胞的光热损伤。对于典型的刺激方案，执行细胞内钙活性的2-10 s基线记录。然后，应用1-10 mW功率和1-10 ms持续时间（对应于30-300千瓦/毫米2）的单个激光脉冲来刺激SiNW，并记录由此产生的钙波为另外2-10秒。
    注:优化每个 SiNW 尺寸和电池的光功率和脉冲长度至关重要。这是必要的，以尽量减少光热损害受刺激的细胞。
  5. 如有必要，传输光学刺激的录制影片，以进行进一步分析。

4. 视频处理

  1. 使用 ImageJ18 可用的"dF 过 F"宏 17 可视化 Fluo-4 荧光的变化，该宏18计算每个像素的荧光计数变化，并按静止基线的平均值进行规范化。将输出（浮点格式）转换为 8 位以进行进一步处理。
  2. 使用 ImageJ 中提供的"删除异常值"选择性中位数滤波器进一步处理 dF/F 影片。定义参数以删除其值超过 2 像素半径中中位数值 10 的像素，并将其像素值替换为中位数。
  3. 通过卢卡斯-卡纳德算法计算每帧中的光流，如 Matlab 计算机视觉工具箱中实现。此函数的输出是一个向量场，其中包含每个图像中每个点光流的 x 和 y 分量（代码在补充文件 1 中可用）。
    注:细胞内平均光流<=>对应于细胞内钙通量的发展。光流的差分，[<>通过识别信号最大化的地方，提供了钙信号激活的时间点。此外，最大时[<]>的幅度与钙波前部通过细胞的速率相关。
  4. 根据以下方程计算钙的细胞间速度。
    vCa2= rij / （ t最大，j = t最大，i ），
    其中t max，j和t最大值，i分别是细胞j和 i的激活时间，rij是细胞的质心之间的距离。

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结果

这种方法允许直接访问细胞内细胞体糖的能力取决于SiNW对细胞的自发内化。虽然SiNW将经历自发内化到许多细胞类型15，一些细胞，如心肌细胞和神经元，将需要西努瓦治疗，以允许其内化19。在该协议中，我们描述了直径为200-300纳米和±1-3μm的p-i-n SiNW的内化过程。 图1A 演示了SiNW在透光显微镜下是如何出现的。使用标准相位对比度光学器?...

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讨论

我们在这里演示了一种执行细胞内电刺激的简单方法。在此演示中，我们使用与 SiGW 预混合的 MF，然后与 CMs 共同培养。一般来说，大多数增殖细胞有内化SiNW的倾向，这允许此方法与许多其他细胞类型使用。此外，虽然我们展示了细胞的细胞内刺激，但同样的原理可以用来对细胞进行细胞外刺激。这可以通过阻止内染色体级联15个细胞自发内化它们， 或使用不内化 SiNW 的细胞来?...

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披露声明

提交人宣称他们没有相互竞争的经济利益。

致谢

这项工作得到空军科学研究办公室（AFOSR FA9550-18-1-0503）的支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm Glass bottom dishesCellvisD35-10-0-N
3i Marianas Spinning Disk Confocal3i
Calcein-AMInvitrogenC1430
CellMask Orange Plasma membrane StainInvitrogenC10045
Collagen I, rat tailGibcoA1048301
Deluxe Diamond Scribing PenTed Pella54468
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamineGibco10313039
DMSO, AnhydrousInvitrogenD12345
Falcon Standard Tissue Culture DishesFalcon08-772E
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,Gibco10082147
Fibronectin Human Protein, PlasmaGibco33016015
Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic CleanerFisher ScientificFB11201
Fluo-4, AM, cell permeantInvitrogenF14201
FluoroBrite DMEM MediaGibcoA1896701
L-Glutamine (200 mM)Gibco25030081
OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)OKO
PBS, pH 7.4Gibco10010023
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122
Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation KitThermo Scientific88281
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056

参考文献

  1. Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).
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  6. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
  7. Jayant, K., et al. Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes. Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).
  8. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
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  15. Zimmerman, J. F., et al. Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires. Science Advances. 2 (12), 1601039(2016).
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