ננו-חוטי סיליקון וגירוי אופטי לחקירות של צימוד חשמלי פנים-תאי

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש nanowires סיליקון עבור ביו-אפנון אופטי תאי של תא בשיטה פשוטה וקלה לביצוע. הטכניקה ניתנת להתאמה גבוהה לסוגי תאים מגוונים ותוכל לשמש במבחנה, כמו גם ביישומים vivo.

Abstract

Myofibroblasts יכול באופן ספונטני להפנים nanowires סיליקון (SiNWs), מה שהופך אותם יעד אטרקטיבי עבור יישומים ביו-אלקטרוניים. כלאיים אלה של תאים-סיליקון מציעים יכולות אפנון אופטי ללא עופרת עם סטיה מינימלית להתנהגות תאים רגילה. היכולות האופטיות מתקבלות על ידי המאפיינים הפוטותרמיים והפוטואלקטריים של SiNWs. בני כלאיים אלה ניתן לקצור באמצעות טכניקות תרבות רקמות סטנדרטיות ולאחר מכן להחיל על תרחישים ביולוגיים שונים. אנו מדגימים כאן כיצד בני-כלאיים אלה יכולים לשמש כדי ללמוד את הזיווג החשמלי של תאי לב ולהשוות כיצד myofibroblasts זוג אחד לשני או cardiomyocytes. תהליך זה יכול להתבצע ללא ציוד מיוחד מעבר למיקרוסקופ פלורסנט עם קו לייזר בשילוב. כמו כן מוצג השימוש של שגרת MATLAB בהתאמה אישית המאפשרת כימות של הפצת סידן בתוך ובין התאים השונים בתרבות. Myofibroblasts מוצגים יש תגובה חשמלית איטית יותר מזה של cardiomyocytes. יתר על כן, ההתפשטות הבין-תאית myofibroblast מראה מעט איטי יותר, אם כי מהירויות דומות למהירות תאית שלהם, מציע התפשטות פסיבית דרך צמתים פער או צינורות. טכניקה זו היא הסתגלות גבוהה, ניתן להחיל בקלות על זירות סלולריות אחרות, עבור במבחנה, כמו גם בחקירות vivo או לשעבר vivo.

Introduction

כל האורגניזמים הביולוגיים משתמשים בחשמל, בצורה של יונים, כדי לווסת את ההתנהגות התאית. קרום התא מכיל סוגים שונים של ערוצי יונים ספציפיים המאפשרים הובלה פסיבית ופעילה של יונים. יונים אלה שולטים בפונקציות של תאים מרגשים, כגון פעילות עצבית והתכווצות שריר השלד והלבי. עם זאת, ביו-אלקטריות ממלאת תפקיד חשוב גם בתאים שאינם מרגשים, השולטת בפונקציות תאיות רבות^{כגון התפשטות}תאים 1 ,^{חסינות עצבית 2,3,4,}ובידול תאי גזע⁵.

בעשורים האחרונים, תחום הביו-אלקטריות משך רמה הולכת וגוברת של עניין, אשר תרמה לפיתוח טכנולוגיות רבות עבור ממשקים ביו-אלקטרוניים. פיפטות תיקון Microelectrode הם תקן הזהב של הקלטה תאית וגירוי⁶. ב מתודולוגיה זו, פיפטה זכוכית נמשך בתנאים ספציפיים כדי ליצור קצה חד עם גודל נקבובית של מיקרון מעט. פיפטה זו מלאה במאגר והפיפטה מאפשרת מגע ישיר של המאגר עם אמצעי האחסון התוך תאי. התוצאה היא ממשק ביו-חשמלי המניב יחסי איתות גבוהים באופן קיצוני לרעש, שליטה מדויקת בפעילות החשמלית הסלולרית ורזולוציית זמן גבוהה באופן קיצוני. למרות מתודולוגיה זו היא כלי רב עוצמה מאוד, אשר לאחרונה הוקטן לתצורת ננו-pipette⁷, הוא משויך מספר מגבלות טכניות חשובות. אפקט דילול ציטוסול⁸, כמו גם תנודות מכניות, מגביל את השירות שלה לחקירות קצרות טווח, והוא דורש ציוד מיוחד יקר ורמת מיומנות טכנית גבוהה. יתר על כן, bulkiness שלה מגביל את מספר התאים שניתן להקליט או מגורה בו זמנית, ו בשל פולשניותו, זה לא ניתן להגדיר מחדש לאורך כל ניסוי. כדי להתגבר על מגבלות אלה פותחו מערכי מיקרו-אלקטרודה, אך גודל האלקטרודות מגביל את הרזולוציה המרחבית, כמו גם את הגישה התוך תאית. מערכי Nanoelectrode מאפשרים הקלטה וגירוי תאיים, אך דורשים אלקטרואידיות שוחקת כדי לגשת לציטוסול^9,10. בנוסף, כל המתודולוגיות הללו מאוגדים בתחום המיצות ולכן מוגבלות לתרביות תאים במבחנה, או לתאים שטחיים חיצוניים, ללא גישה לתאים שבתוך רקמה תלת-ממדית (תלת-ממדית).

Optogenetics¹¹ משמש נרחב כדי לטפל אלה 3D ובמגבלות vivo. עם זאת, שיטות optogenetic מבוססות על הסטיות של ערוצים יון פלזמה המופעלים באור המופצים על קרום פלזמה, הגבלת הרזולוציה המרחבית 3D¹² ויכולות תאיות.

לאחרונה הראנו כי nanowires סיליקון (SiNWs) יכול לשמש לביצוע חקירה ביו-אלקטרית תאית עם רזולוציה מרחבית submicron עם תאים שונים שאינם מרגשים, כלים כלשהם מיופיברובלסטים לב ואוליגודנדרוציטים^13. יתר על כן, השתמשנו אלה SiNWs לבצע לשעבר vivo תא חקירה ספציפית בתוך רקמת לב 3D, כדי לחקור כיצד תאי לב זוג חשמלי vivo^14. יתרון מרכזי של מתודולוגיה זו הוא הפשטות שלה; זה לא דורש כל שינוי גנטי או מכשור מגושם. תאים רבים באופן ספונטני להפנים SiNWs צילום מגיב ללא צורך sonication או אלקטרואידציה¹⁵. בנוסף, הם ימלטו באופן ספונטני מהאנקוסום הא אנדו-אומלי ויתגבשו אינטגרציה חלקה עם האיברים התוך^{תאיים 13,15}. אלה cell-SiNWs מרוכבים, בשם תאים-סיליקון היברידיים, בעל אופי דינמי, רך ורב-תכליתי של התא המקורי, כמו גם את היכולות האופטואלקטריות של SiNWs. לאחר הכלאה, ניתן לקצור את התא-SiNW היברידית באמצעות טכניקות סטנדרטיות של תרבות רקמות ולהשתמש בהן עבור יישומים שונים כגון גירוי ביו-חשמלי תאי; לימוד צימוד ביו-אלקטרי בין-תאי במבחנה; ועל חקירה ספציפית של תא Vivo. מכיוון שגירוי יעיל דורש התאמה אישית של צפיפויות הספק אופטי גבוהות ו-SiNWs, ניתן להשיג רזולוציה מרחבית גבוהה הן ב-2D והן בתלת-מיד. בפרוטוקול זה אנו מתארים בפירוט את המתודולוגיה, כמו גם את האופן שבו ניתן לנתח את התוצאות. ההתמקדות מונחת על החקירה הבין-תאית והבין-תאית במבחנה, אך ניתן לנצל את יישום vivo של מתודולוגיה זו באופן ישיר עבור תרחישים ביולוגיים רבים אחרים.

Protocol

כדי להבטיח עמידה בסטנדרטים אתיים, כל ההליכים בבעלי חיים הקשורים לבידוד קרדיומיוציטים מלבבות מכרסמים אושרו לראשונה על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת שיקגו (IACUC). בנוסף, כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות מאוניברסיטת שיקגו IACUC.

1. הכנת תאים-SiNWs היברידיות

1. בודדו קרדיומיוציטים ראשיים (CMs) באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להנחיות היצרן.
2. הכן DMEM מלא לבידוד תאים ראשי בתוספת 10% סרום חום לא פעילות של חזיר עוברי, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, ו 1% L-גלוטמין.
3. כדי לבודד myofibroblast (MFs) מן המתלה MFs-CMs, מראש צלחת התאים המבודדים על צלחת תרבות רקמות (תאים מבודדים מ 2 לבבות מ שלב 1.1. לכל 100 מ"מ צלחת) עבור 1 שעה. כמו CMs צריך פיברונטין או קולגן מטופל משטח לדבוק, רק MFs יהיה לצרף משטח תרבות רקמות.
4. שאף את מתלי תאי ה-CMs המועשרים. CMs אלה יכולים לשמש לניסופי צימוד הטרו-תאיים כמתואר בסעיף 3. יש לשטוף את ה- MFs באמצעות DMEM כדי לסלק את כל המדינות הנותרות מצלחת ה- MFs.
5. הוסף מדיום תרבות טריה ל- MFs ואפשר להם להתרבות עד שהם כ-80% מתל-זמניים (2-4 ימים). לשנות את המדיום כל יומיים.
6. כאשר התאים מוכנים (80% confluent), להכין SiNWs לשלב הכלאה להלן (שלב 1.7).
   הערה: סוגים רבים של SiNWs יכולים לשמש עבור זה. בניסוי זה, SiNWs שגדלו על ידי תצהיר אדים כימיים (CVD) עם תצורת צומת p-i-n מעטפת הליבה שימשו כמתואר^{קודם לכן 16}. במהלך הצמיחה CVD, SiNWs גדלים על קבי וופל סיליקון, ובסופו של דבר נשמרים כמו שבבי סיליקון מכוסים SiNWs.
7. חותכים שבב של 3 מ"מ x 3 מ"מ מוופל עם SiNWs שגדלו ב-CVD באמצעות סופר יהלומים. השתמש במרטיות חדות כדי לטפל בוופל ולמזער את שטח הפנים שנוגע במרטיות, מכיוון שזה עלול לשבור את ה-SiNWs.
8. לחטא את השבב על ידי שטיפה עם 70% אתנול ומאפשר אתנול להתייבש במשך 30 דקות תחת אור UV במכסה זרימה למינאר biosafety.
9. מעבירים את השבב לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי ושטיפה של אתנול עודף באמצעות מדיה של תרבות שלמה.
10. להוסיף 1 מ"ל של מדיה תרבות sonicate השבב באמבט sonication במשך 1-10 דקות. התקשורת צריכה להיות מעונן כמו SiNWs משתחררים לתקשורת.
    הערה: זמן Sonication וכוח צריך להיות ממוטב עבור sonicators שונים או תאים שונים, כמו משכים קצרים יותר וכוחות נמוכים יותר יניבים SiNWs ארוך יותר.
11. הוסף את השעיית SiNWs לתוך 5 מ"ל של מדיה תרבות זרע אותו על 100 מ"מ צלחת תרבות רקמות עם MFs. אפשרו לSiNWs להפנים במשך 4 שעות ולשטוף את SiNWs עודף את 5x עם מדיה. אפשרו ל-SiNWs פנימי חלקית להשלים את ההפניה בכך שתאפשר להם לשבת עוד שעה אחת לפני השימוש.
    הערה: סוגי תאים שונים עשויים להזדקק לריכוז ו/או זמני הפניה שונים של SiNWs.
12. הכן פתרון ציפוי קולגן על-ידי דילול פתרון מלאי קולגן (3 מ"ג/מ"ל) עם חומצה אצטית סטרילית של 20 מ"מ ביחס של 1:50. הוסף תמיסת ציפוי 0.5 מ"ל לצלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ ולאפשר לו לשבת במשך 1 שעות ב 37 ° C. הסר את התמיסה ושטוף את הצלחת באמצעות PBS סטרילי.
13. לקצור את התא-SiNWs היברידיות על ידי טיפול בתאים עם 3 מ"ל של שלושה שלושה פעמים במשך 2 דקות ב 37 ° C. להוסיף 10 מ"ל של מדיה תרבות ולשטוף את היברידיות במרץ על ידי pipetting. צנטריפוגה התאים בעדינות ב 200 x g במשך 5 דקות כדי למנוע נזק לתאים עם SiNWs הפנימי. הסר מדיה עודפת, להשעות תאים עם 1 mL מדיה ולזרע אותם על צלחת התחתית זכוכית מטופל קולגן.
    הערה: ניתן לזרוע את ההיברידיות לבדן, לחקור צימוד תאי או בין-תאי או עם CMs כדי לחקור צימוד הטרו-תאי במבחנה.
14. לבצע אימות סופי של ההפניה SiNW על ידי תיוג ציטוסול של תאים (calcein-AM, 4 μM) וממברנה (סמן קרום, 2 μM) במשך 30 דקות ב 37 °C, והדמיה התא באמצעות מיקרוסקופית confocal. כמו SiNWs הם מאוד רפלקטיביים, אור משתקף יכול לשמש במקום פלואורסץ כדי לדמיין אותם.

2. הכנת תאים לחקירות פנים ובין-תאיות

1. הכן תמיסת ציפוי קולגן כמו ב- 1.12
2. לגירוי חשמלי תאי, תרבות היברידית עם צפיפויות זריעה נמוכות. השתמש בממוציתומטר סטנדרטי כדי לספור תאים מסעיף 1.11. ולזרע 50,000 תאים על צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ במדיה תרבות. לצורך חקירות בין-תאיות, השתמש בצפיפות תאים גבוהה יותר (500,000 תאים לצלחת). לזיווג בין-תאי בין CMs ל-MFs, שתף את בני הכלאיים עם CMs חדשים ומבודדים.
3. אפשר לתאים לצרף בן לילה לפני ביצוע ניסויי גירוי אופטי. לצורך חקירות בין-תאיות, אפשרו 48 שעות ב-37°C לתאים לבטא צמתים בין-תאיים לפני ביצוע הניסוי.
4. להכין פתרון מלאי צבע רגיש סידן (ניתן לשמור ב -20 °C) על ידי הוספת 50 μL של DMSO כדי 50 μg Fluo-4 AM. להכין פתרון כתמים על ידי דילול 1 μL של צבע ב 1 מ"ל של DMEM.
5. לשאוף את מדיום התרבות מתאי ולהוסיף 1 מ"ל של תמיסת כתמים. אפשר לצבע להפנים לתאים למשך 20-30 דקות ב-37°C. לאסוף את הצבע ולשטוף פעמיים עם PBS סטרילי.
6. לבסוף, הוסף 1 מ"ל של מדיה DMEM DMEM ללא פנול-אדום חם מראש, ואפשר ל-Fluo-4 התוך תאי לעבור דה-אסתרציה למשך 30 דקות ב-37°C.
7. העבר תאים למיקרוסקופ להדמיה וגירוי.

3. הדמיה אופטית וגירוי

1. מחממים מראש מיקרו-אינקובטור לח ל-37°C ותערובת אוויר-CO_{2 של בועות} (95:5).
2. השתמש במיקרוסקופ עם קו לייזר קולימטו יחד לתוך נתיב האור להדמיית סידן וגירוי אופטי.
   הערה: מיקרוסקופ סריקה confocal היא האפשרות הפשוטה ביותר בשל יכולות גירוי הנקודה שלה. עם זאת, הליך זה יכול להיעשות באמצעות כל מיקרוסקופ פלורסנס סטנדרטי על ידי צימוד קרן לייזר collimated לתוך החלל האינסוף של נתיב האור באמצעות מפצל קרן. כל מטרת מיקרוסקופ מתוכננת כך שלייזר קולימט שעבר דרכו יתמקד בנקודת לייזר מוגבלת במפזר במטוס המוקד. אורך גל הלייזר צריך להיות קרוב לאור העירור, כך שהוא ישתקף על ידי המראה הדיקתית ויעבור על ידי מסנן העירור.
3. הצג באופן חזותי את ה-SiNWs ולקבוע את אתר הגירוי באמצעות מיקרוסקופית brightfield, אור משודר או אור מחזיר אור. לאחר מכן, הגדר מחדש את נתיב האור למצב פלואורסץ, תוך שמירה על נקודת הגירוי במיקום המוגדר מראש של ה- SiNW.
4. אמת את כוח הגירוי האופטימלי ואת אורך הדופק עבור כל גודל SiNW וסוג תא, כדי למזער נזק פוטותרמי לתאים מגורה. עבור פרוטוקול גירוי טיפוסי, בצע הקלטה בסיסית של 2-10 של פעילות הסידן התוך תאי. לאחר מכן, להחיל פעימת לייזר יחיד של 1-10 mW כוח ו 1-10 ms משך (המקביל 30-300 kW / מ"מ²⁾כדי לעורר את SiNW, ולתואם את גל הסידן שנוצר עבור עוד 2-10 s.
   הערה: חיוני לייעל את הכוח האופטי ואת אורך הדופק עבור כל גודל ותאים SiNW. זה הכרחי כדי למזער את הנזק פוטותרמי לתאים מגורה.
5. העבר את הסרטים שהוקלטו של הגירוי האופטי, במידת הצורך, לניתוח נוסף.

4. עיבוד וידאו

1. הצג באופן חזותי שינויים בפלואורסץ Fluo-4 באמצעות המאקרו "dF over F"^{17 הזמין} עבור ImageJ¹⁸, המחשב את השינוי בספירת הפלואורסץ עבור כל פיקסל, ומנרמל לפי הערך הממוצע של תוכנית הבסיס למנוחה. המר את הפלט (תבנית נקודה צפה) ל- 8 סיביות לעיבוד נוסף.
2. לעבד את הסרט dF / F עוד יותר באמצעות "הסרת חריגים" מסנן חציון סלקטיבי זמין ImageJ. הגדר פרמטרים להסרת פיקסלים שבהם הערך שלהם גבוה מ- 10 מעל הערך החציוני ברדיוס של 2 פיקסלים והחלף ערך פיקסל זה בחציון.
3. חשב את הזרימה האופטית בכל מסגרת באמצעות אלגוריתם לוקאס-קנדה, כפי שמיושם ב- Matlab Computer Vision. הפלט של פונקציה זו היה שדה וקטור המכיל את רכיבי ה- x וה- y של הזרימה האופטית בכל נקודה בכל תמונה (קוד זמין בקובץ משלים 1).
   הערה: הזרימה האופטית ממוצעת בתוך תא, <ν>, תואמת להתפתחות שטף סידן בתוך תא. ההיפרטה של הזרימה האופטית, מספקת את נקודת הזמן שבה הופעל איתות הסידן, על-ידי זיהוי היכן הוגדל האות. בנוסף, סדר הגודל של ןוה
4. חשב את המהירות הבין-תאית של שידור סידן בהתאם למשוואה הבאה.
   v_Ca²⁺ = r_ij / ( t_{max, j} - t _{max, i} ),
   איפה _{מקס, ג'יי} ותקס _מקס, אני זמני ההפעלה של התאים J ואני, בהתאמה, וr_IJ הוא המרחק בין centroids של התאים.

תוצאות

היכולת של מתודולוגיה זו לאפשר גישה ישירה ציטוסול תאי תלוי ההפנימה הספונטנית של SiNW לתאים. למרות SiNWs יעבור ההפניה ספונטנית לסוגי תאים^{רבים 15}, תאים מסוימים, כגון cardiomyocytes ונוירונים, יצטרכו את SiNWs כדי לאפשר ההפנימה^{שלהם 19}. בפרוטוקול זה אנו מתארים את תהליך ההפניה של p-i-n SiNW...

Discussion

הראינו כאן דרך פשוטה לבצע גירוי חשמלי תאי של תאים. בהדגמה זו, השתמשנו ב-MFs שהיו מותאמים מראש עם SiNWs, ואז שיתוף פעולה עם CMs. באופן כללי, רוב התאים המתרבים יש נטייה להפנים SiNWs, המאפשר את השימוש מתודולוגיה זו עם סוגי תאים רבים אחרים. יתר על כן, בעוד הראינו את הגירוי תאי של תאים, אותם עקרונות יכולים ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Glass bottom dishes	Cellvis	D35-10-0-N
3i Marianas Spinning Disk Confocal	3i
Calcein-AM	Invitrogen	C1430
CellMask Orange Plasma membrane Stain	Invitrogen	C10045
Collagen I, rat tail	Gibco	A1048301
Deluxe Diamond Scribing Pen	Ted Pella	54468
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine	Gibco	10313039
DMSO, Anhydrous	Invitrogen	D12345
Falcon Standard Tissue Culture Dishes	Falcon	08-772E
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,	Gibco	10082147
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner	Fisher Scientific	FB11201
Fluo-4, AM, cell permeant	Invitrogen	F14201
FluoroBrite DMEM Media	Gibco	A1896701
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)	OKO
PBS, pH 7.4	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit	Thermo Scientific	88281
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056