Nanohilos de silicio y estimulación óptica para investigaciones de acoplamiento eléctrico intra e intercelular

Resumen

Este protocolo describe el uso de nanohilos de silicio para la biomodulación óptica intracelular de la célula en un método simple y fácil de realizar. La técnica es altamente adaptable a diversos tipos de células y se puede utilizar para aplicaciones in vitro e in vivo.

Resumen

Los miofibroblastos pueden internalizar espontáneamente nanohilos de silicio (SiNW), lo que los convierte en un objetivo atractivo para aplicaciones bioelectrónicas. Estos híbridos de silicio celular ofrecen capacidades de modulación óptica sin plomo con una perturbación mínima para el comportamiento normal de las células. Las capacidades ópticas se obtienen por las propiedades fototérmicas y fotoeléctricas de los SINW. Estos híbridos se pueden cosechar utilizando técnicas estándar de cultivo de tejidos y luego aplicarse a diferentes escenarios biológicos. Aquí demostramos cómo estos híbridos se pueden utilizar para estudiar el acoplamiento eléctrico de las células cardíacas y comparar cómo los miofibroblastos se unen entre sí o para cardiomiocitos. Este proceso se puede realizar sin equipo especial más allá de un microscopio fluorescente con línea láser acoplada. También se muestra el uso de una rutina MATLAB personalizada que permite la cuantificación de la propagación del calcio dentro y entre las diferentes células en el cultivo. Se ha demostrado que los miofibroblastos tienen una respuesta eléctrica más lenta que la de los cardiomiocitos. Además, la propagación intercelular miofibroblasto muestra velocidades ligeramente más lentas, aunque comparables a sus velocidades intracelulares, lo que sugiere la propagación pasiva a través de uniones de separación o nanotubos. Esta técnica es altamente adaptable y se puede aplicar fácilmente a otras arenas celulares, tanto para investigaciones in vitro como in vivo o ex vivo.

Introducción

Todos los organismos biológicos utilizan electricidad, en forma de iones, para regular el comportamiento celular. Las membranas celulares contienen varios tipos de canales iónicos específicos que permiten el transporte pasivo y activo de iones. Estos iones gobiernan las funciones de las células excitables, como la actividad neuronal y la contractilidad muscular esquelética y cardíaca. Sin embargo, la bioelectricidad también desempeña un papel importante en las células no excitables, gobernando muchas funciones celulares como la proliferación celular¹, neuroinmunidad^2,3,4, y la diferenciación de células madre⁵.

En las últimas décadas, el campo de la bioelectricidad ha generado un creciente nivel de interés, lo que ha contribuido al desarrollo de numerosas tecnologías para interfaces bioelectrónicas. Las pipetas de parches de microelectrodo son el estándar de oro de la grabación y estimulación intracelular⁶. En esta metodología, una pipeta de vidrio se tira en condiciones específicas para formar un borde afilado con un tamaño de poro de pocos micras. Esta pipeta se rellena con un tampón y la pipeta permite el contacto directo del tampón con el volumen intracelular. Esto da como resultado una interfaz bioeléctrica que produce relaciones de señal a ruido extremadamente altas, control preciso sobre la actividad eléctrica celular y una resolución temporal extremadamente alta. Aunque esta metodología es una herramienta extremadamente potente, que recientemente se redujo a una configuración de nano-pipeta^7,se asocia con varias limitaciones técnicas importantes. El efecto de dilución del^{citosol 8,}así como las vibraciones mecánicas, limita su utilidad a los interrogatorios a corto plazo, y requiere costosos equipos especializados y un alto nivel de habilidad técnica. Además, su voluminosidad limita el número de células que se pueden registrar o estimular simultáneamente, y debido a su invasividad, no puede ser reconfigurada a lo largo de un experimento. Para superar estas limitaciones, se desarrollaron matrices de microelectrodos, pero el tamaño de los electrodos limita la resolución espacial, así como el acceso intracelular. Las matrices de nanoelectrodos permiten el registro y la estimulación intracelulares, pero requieren electroporación abrasiva para acceder al^{citosol 9,10}. Además, todas estas metodologías están unidas al sustrato y, por lo tanto, se limitan a cultivos celulares in vitro, o a células superficiales externas, sin acceso a células que están dentro de un tejido tridimensional (3D).

Optogenetics¹¹ se utiliza ampliamente para abordar estas limitaciones 3D e in vivo. Sin embargo, los métodos optogenéticos se basan en las perturbaciones de los canales iónicos de membrana plasmática activados por la luz que se distribuyen en la membrana plasmática, limitando la resolución espacial 3D¹² y las capacidades intracelulares.

Recientemente hemos demostrado que los nanohilos de silicio (SiNW) se pueden utilizar para realizar interrogaciones bioeléctricas intracelulares con resolución espacial submicrónico con diferentes células no excitables, a saber, miofibroblastos cardíacos y oligodendrocitos¹³. Por otra parte, utilizamos estos SINW para realizar interrogatorios específicos de células ex-vivo dentro de un tejido cardíaco 3D, para investigar cómo las células cardíacas se acoplan eléctricamente in vivo¹⁴. Una de las principales ventajas de esta metodología es su simplicidad; no requiere ninguna modificación genética o instrumentación voluminosa. Muchas células internalizarán espontáneamente siNWs foto-sensibles sin necesidad de sonicación o electroporación¹⁵. Además, escaparán espontáneamente de la encapsulación endosomal y formarán una integración perfecta con el citosol y los orgánulos intracelulares^13,15. Estos compuestos cell-SiNWs, llamados híbridos de silicio celular, poseen la naturaleza dinámica, suave y versátil de la célula original, así como las capacidades optoeléctricas de los SiNW. Después de la hibridación, el híbrido cell-SiNW se puede cosechar utilizando técnicas estándar de cultivo de tejidos y se utiliza para diversas aplicaciones como la estimulación bioeléctrica intracelular; estudio del acoplamiento bioeléctrico intercelular in vitro; y para el interrogatorio específico de la célula in vivo. Como una estimulación eficaz requiere la co-localización de altas densidades de potencia óptica y SiNWs, se puede lograr una alta resolución espacial tanto en 2D como en 3D. En este protocolo describimos en detalle la metodología, así como cómo se pueden analizar los resultados. El enfoque se centra en la investigación intra e intercelular in vitro, pero la implementación in vivo de esta metodología puede ser utilizada directamente para muchos otros escenarios biológicos.

Protocolo

Para garantizar el cumplimiento de las normas éticas, todos los procedimientos animales relacionados con el aislamiento de cardiomiocitos de corazones de roedores fueron aprobados por primera vez por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Chicago (IACUC). Además, todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la orientación de la IACUC de la Universidad de Chicago.

1. Preparación de híbridos cell-SiNWs

1. Aísle los cardiomiocitos primarios (CM) utilizando un kit comercial siguiendo las pautas del fabricante.
2. Preparar DMEM completo para el aislamiento de células primarias complementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, 1% penicilina-estreptomicina, y 1% L-glutamina.
3. Para aislar el miofibroblasto (MF) de la suspensión MFs-CM, pre-placa las células aisladas en un plato de cultivo de tejido (células aisladas de 2 corazones del paso 1.1. por plato de 100 mm) para 1 h. Como los CM necesitan una fibronectina o una superficie tratada con colágeno para adherirse, solo los MF se unen a la superficie de cultivo de tejidos.
4. Aspirar la suspensión de células de CM enriquecidas. Estos CM se pueden utilizar para experimentos de acoplamiento heterocelular como se describe en la sección 3. Enjuague los MFs con DMEM para eliminar los CM restantes de la antena MFs.
5. Añadir medio de cultivo fresco a los MF y permitir que proliferen hasta que sean confluentes del 80% (2-4 días). Cambia el medio cada dos días.
6. Cuando las células estén listas (80% confluentes), prepare siNWs para el paso de hibridación a continuación (paso 1.7).
   NOTA: Para ello se pueden utilizar muchos tipos de SiNW. En este experimento, los SINW que fueron cultivados por deposición de vapor químico (CVD) con una configuración de unión p-i-n de núcleo-shell se utilizaron como se describió anteriormente¹⁶. Durante el crecimiento de la ECV, los SiNW se cultivan sobre un sustrato de obleas de silicio, y finalmente se mantienen como chips de silicio cubiertos con SINWs.
7. Corte un chip de 3 mm x 3 mm de una oblea con siNWs cultivados en CVD utilizando un escriba de diamante. Utilice fórceps afilados para manejar la oblea y minimizar el área de superficie que se toca con los fórceps, ya que esto puede romper los SiNW.
8. Esterilice el chip enjuagando con 70% de etanol y permitiendo que el etanol se seque durante 30 minutos bajo la luz UV en una campana de flujo laminar de bioseguridad.
9. Transfiera el chip a un tubo de microcentrífuga estéril y enjuague el exceso de etanol utilizando medios de cultivo completos.
10. Añadir 1 mL de medios de cultivo y sonicar el chip en el baño de sonicación durante 1-10 min. Los medios deben nublarse a medida que los SINW se liberan en los medios.
    NOTA: El tiempo y la potencia de sonicación deben optimizarse para diferentes sonicadores o células diferentes, ya que las duraciones más cortas y las potencias más bajas producirán siNW más largos.
11. Añadir la suspensión siNWs en 5 ml de medios de cultivo y sembrar en el plato de cultivo de tejido de 100 mm con MF. Permita que los SiNWs internalicen durante 4 h y enjuague el exceso de SiNWs de 5x con medios. Permita que los SINW parcialmente internalizados completen la internalización permitiéndoles sentarse durante otra 1 hora antes de su uso.
    NOTA: Diferentes tipos de células pueden necesitar diferentes tiempos de concentración y/o internalización de SiNWs.
12. Preparar la solución de recubrimiento de colágeno diluyendo la solución de cola de colágeno (3 mg/ml) con ácido acético estéril de 20 mM en una proporción de 1:50. Añadir una solución de recubrimiento de 0,5 ml a un plato inferior de vidrio de 35 mm y dejar reposar durante 1 h en 37 oC. Retire la solución y enjuague el plato con PBS estéril.
13. Cosecha los híbridos cell-SiNWs tratando las células con 3 ml de trippsina durante 2 min a 37oC. Añadir 10 ml de medios de cultivo y enjuagar los híbridos vigorosamente pipeteando. Centrifugar las células suavemente a 200 x g durante 5 min para evitar dañar las células con los SINW internalizados. Retire el exceso de medios, suspenda las células con 1 ml de medios y se las semilla en el plato inferior de vidrio tratado con colágeno.
    NOTA: Los híbridos pueden ser sembrados solos, para investigar el acoplamiento intracelular o intercelular o con CM para investigar el acoplamiento heterocelular in vitro.
14. Realizar una verificación final de la internalización de SiNW mediante el etiquetado de citosol de las células (calceína-AM, 4 m) y la membrana (marcador de membrana, 2 m) durante 30 minutos a 37 oC, e imágenes de la célula mediante microscopía confocal. Como los SiNW son altamente reflectantes, se puede utilizar la luz reflejada en lugar de la fluorescencia para visualizarlos.

2. Preparación de células para investigaciones intra e intercelulares

1. Preparar la solución de recubrimiento de colágeno como en 1.12
2. Para la estimulación eléctrica intracelular, híbridos de cultivo con densidades de siembra bajas. Utilice un hemocitociómetro estándar para contar las células de la sección 1.11. y sembrar 50.000 células en un plato inferior de vidrio de 35 mm en medios de cultivo. Para las investigaciones intercelulares, utilice densidades celulares más altas (500.000 células por plato). Para el acoplamiento intercelular entre CM y MFs, co-cultivo de los híbridos con CM recién aislados.
3. Permita que las células se adhieran durante la noche antes de realizar experimentos de estimulación óptica. Para las investigaciones intercelulares, permita 48 h a 37 oC para que las células expresen las uniones de separación intercelular antes de que se lleve a cabo el experimento.
4. Preparar la solución de material de colorante sensible al calcio (puede mantenerse en -20 oC) añadiendo 50 ml de DMSO a 50 g de Fluo-4 AM. Preparar la solución de tinción diluyendo 1 ml de tinte en 1 ml de DMEM.
5. Aspirar el medio de cultivo de las células y añadir 1 ml de solución de tinción. Permita que el tinte se internalice en las células durante 20-30 min a 37 oC. Aspirar el tinte y enjuagar dos veces con PBS estéril.
6. Por último, añadir 1 ml de dmEM media DMEM libre de fenol-rojo precalejado, y permitir que el Fluo-4 intracelular se someta a des-esterificación durante 30 min en 37 oC.
7. Transfiera las células al microscopio para la toma de imágenes y la estimulación.

3. Imagen óptica y estimulación

1. Precalentar un microincubador humidificado a 37oC y una mezcla de burbujas de aire-CO₂ (95:5).
2. Utilice un microscopio con una línea láser colimada acoplada a la trayectoria de la luz para obtener imágenes de calcio y estimulación óptica.
   NOTA: Un microscopio confocal de escaneo es la opción más sencilla debido a sus capacidades de estimulación de puntos. Sin embargo, este procedimiento se puede realizar utilizando cualquier microscopio de florescencia estándar acoplando un rayo láser colimado en el espacio infinito de la trayectoria de luz utilizando un divisor de haz. Cualquier objetivo del microscopio está diseñado para que un láser colimado pasado a través de él se enfoque a un punto láser limitado de difracción en el plano focal. La longitud de onda del láser debe estar cerca de la luz de excitación, por lo que será reflejada por el espejo dicroico y pasada por el filtro de excitación.
3. Visualice los SiNW y determine el sitio de estimulación utilizando microscopía de campo brillante, luz transmitida o luz reflectante. A continuación, vuelva a configurar la trayectoria de la luz en el modo de fluorescencia, manteniendo el punto de estimulación en la ubicación predefinida del SiNW.
4. Validar la potencia de estimulación óptima y la longitud del pulso para cada tamaño y tipo de célula SiNW, para minimizar el daño fototérmico a las células estimuladas. Para un protocolo de estimulación típico, realice un registro basal de 2-10 s de la actividad de calcio intracelular. A continuación, aplique un solo pulso láser de 1-10 mW de potencia y 1-10 ms de duración (correspondiente a 30-300 kW/mm²) para estimular el SiNW, y registre la onda de calcio resultante para otros 2-10 s.
   NOTA: Es esencial optimizar la potencia óptica y la longitud del pulso para cada tamaño y células SiNW. Esto es necesario para minimizar el daño fototérmico a las células estimuladas.
5. Transfiera las películas grabadas de la estimulación óptica, si es necesario, para su posterior análisis.

4. Procesamiento de vídeo

1. Visualice los cambios en la fluorescencia Fluo-4 utilizando la macro "dF sobre F"¹⁷ disponible para ImageJ¹⁸, que calcula el cambio en los recuentos de fluorescencia para cada píxel y normaliza por el valor medio de la línea base en reposo. Convierta la salida (formato de punto flotante) en 8 bits para su posterior procesamiento.
2. Procese la película dF/F más adelante utilizando el filtro de mediana selectiva"Eliminar valores atípicos"disponible en ImageJ. Defina parámetros para eliminar píxeles donde su valor esté más de 10 por encima del valor mediano en un radio de 2 píxeles y reemplace ese valor de píxel por la mediana.
3. Calcule el flujo óptico en cada fotograma a través del algoritmo Lucas-Kanade, tal como se implementa en la caja de herramientas Matlab Computer Vision. La salida de esta función era un campo vectorial que contenía los componentes x e y del flujo óptico en cada punto de cada imagen (el código está disponible en el archivo suplementario 1).
   NOTA: El flujo óptico medio dentro de una célula, <->, corresponde al desarrollo del flujo de calcio dentro de una célula. El diferencial del flujo óptico, "<">, proporciona el punto de tiempo en el que se activó la señalización de calcio, identificando dónde se maximizó la señal. Además, la magnitud de la onda de calcio en su máximo se correlaciona con la velocidad a la que el frente de onda de calcio progresa a través de la célula.
4. Calcular la velocidad intercelular de la transmisión de calcio de acuerdo con la siguiente ecuación.
   v_Ca²⁺ á r_ij / ( t_max,j á t_max,i ),
   donde t_max,j y t_max,i son los tiempos de activación para las celdas j e i, respectivamente, y r_ij es la distancia entre los centroides de las celdas.

Resultados

La capacidad de esta metodología para permitir el acceso directo al citosol intracelular depende de la internalización espontánea del SiNW en las células. Aunque los SINW se someterán a una internalización espontánea en muchos tipos celulares^15,algunas células, como los cardiomiocitos y las neuronas, necesitarán que los SINW sean tratados para permitir su internalización^19. En este protocolo describimos el proceso de internalización de los SiNW p-i-n con un diám...

Discusión

Hemos demostrado aquí una forma sencilla de realizar la estimulación eléctrica intracelular de las células. En esta demostración, usamos MFs que estaban prehibridizados con SINW, luego co-cultivados con CM. En general, la mayoría de las células proliferantes tienen la tendencia a internalizar los SINW, lo que permite el uso de esta metodología con muchos otros tipos de células. Además, si bien demostramos la estimulación intracelular de las células, los mismos principios se pueden utilizar para realizar la es...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Glass bottom dishes	Cellvis	D35-10-0-N
3i Marianas Spinning Disk Confocal	3i
Calcein-AM	Invitrogen	C1430
CellMask Orange Plasma membrane Stain	Invitrogen	C10045
Collagen I, rat tail	Gibco	A1048301
Deluxe Diamond Scribing Pen	Ted Pella	54468
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine	Gibco	10313039
DMSO, Anhydrous	Invitrogen	D12345
Falcon Standard Tissue Culture Dishes	Falcon	08-772E
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,	Gibco	10082147
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner	Fisher Scientific	FB11201
Fluo-4, AM, cell permeant	Invitrogen	F14201
FluoroBrite DMEM Media	Gibco	A1896701
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)	OKO
PBS, pH 7.4	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit	Thermo Scientific	88281
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056