シリコンナノワイヤと細胞間電気結合の研究のための光刺激

要約

このプロトコルは、細胞内光学バイオ変調のためのシリコンナノワイヤの使用を、簡単かつ容易に行う方法で説明する。この技術は、多様な細胞タイプに適応性が高く、インビトロおよびインビボ用途にも使用できます。

要約

筋線維芽細胞はシリコンナノワイヤ(SiWn)を自発的に内部化し、バイオエレクトロニクスアプリケーションの魅力的なターゲットとなっています。これらのセルシリコンハイブリッドは、通常の細胞挙動への摂動を最小限に抑えた、鉛のない光学変調機能を提供します。光学機能は、SiNWの光熱および光電特性によって得られる。これらのハイブリッドは、標準的な組織培養技術を使用して収穫し、異なる生物学的シナリオに適用することができます。ここでは、これらのハイブリッドを使用して心臓細胞の電気結合を研究し、筋線維芽細胞がどのように互いに結合するか、または心筋細胞と比較する方法を実証します。このプロセスは、結合されたレーザーラインを有する蛍光顕微鏡を超える特別な装置なしで達成することができる。また、培養中の異なる細胞内および細胞間のカルシウム伝搬の定量化を可能にするカスタム構築MATLABルーチンの使用も示されている。筋線維芽細胞は、心筋細胞のそれよりも遅い電気応答を有することが示されている。さらに、筋線維芽細胞間伝播は、細胞内速度に匹敵する速度であるが、ギャップ接合部またはナノチューブを介した受動的な伝播を示唆するが、わずかに遅い結果を示す。この技術は非常に適応性が高く、インビボやインビボ調査のために他のセルラーアリーナに簡単に適用できます。

概要

すべての生物は、細胞の挙動を調節するために、イオンの形で電気を使用します。細胞膜には、イオンの受動的かつ能動的な輸送を可能にする、さまざまなタイプの特定のイオンチャネルが含まれています。これらのイオンは、神経活動や骨格や心筋収縮などの興奮性細胞の機能を支配する。しかし、生体電気は非興奮性細胞においても重要な役割を果たし、細胞増殖^1、神経免疫^2、3、4、幹細胞^分化5などの多くの細胞機能を支配する。

ここ数十年、バイオ電気の分野は、バイオエレクトロニクスインターフェースのための多くの技術の開発に貢献している、関心の高まりのレベルを引き付けています。マイクロ電極パッチピペットは、細胞内記録および刺激⁶のゴールドスタンダードである。この方法論では、ガラスピペットを特定の条件下で引っ張り、小さなミクロンの細孔サイズで鋭いエッジを形成します。このピペットはバッファーで満たされ、ピペットは細胞内容積とのバッファーの直接接触を可能にする。これにより、極めて高い信号対雑音比、細胞の電気的活動の正確な制御、および非常に高い時間分解能をもたらす生体電気インターフェースが得られます。この方法論は、最近ナノピペット構成⁷に縮小された非常に強力なツールですが、いくつかの重要な技術的な制限に関連しています。細胞質ゾル希釈効果⁸は、機械的振動と同様に、その有用性を短期的な尋問に制限し、高価な特殊な機器と高いレベルの技術スキルを必要とします。さらに、そのかさばりは、同時に記録または刺激することができる細胞の数を制限し、その侵襲性のために、実験全体を通して再構成することはできません。これらの限界を克服するために、マイクロ電極アレイが開発されましたが、電極の大きさは空間分解能と細胞内アクセスを制限します。ナノ電極アレイは細胞内の記録と刺激を可能にするが、細胞質ゾル^9、10にアクセスするには研磨エレクトロポレーションが必要である。さらに、これらすべての方法論は基質結合であり、したがって、3次元(3D)組織の内部にある細胞にアクセスしない体外細胞培養物、または外部の表面細胞に限定される。

光遺伝学¹¹ は、これらの3Dおよび生体内の制限に対処するために広く使用されている。しかし、光遺伝学的方法は、原形質膜に分布する光活性化形質膜イオンチャネルの摂動に基づいており、3D空間分解能¹² および細胞内能力を制限する。

我々は最近、シリコンナノワイヤ(SiNW)が異なる非興奮性細胞、すなわち心臓筋線維芽細胞およびオリゴデンドロサイト¹³とのサブミクロン空間分解能を有する細胞内生体電気的尋問を行うために使用できることを示した。さらに、これらのSiNWを用い、3D心臓組織内での元生体細胞特異的な調合を行い、心臓細胞^が生体内で電気的に結合する方法を調べる。この方法論の主な利点は、そのシンプルさです。遺伝子組み換えやかさばる計測は必要ありません。多くの細胞は、超音波処理やエレクトロポレーション¹⁵を必要とせず、写真応答SiNWsを自発的に内部化します。さらに、それらは、自然に内皮カプセル化を逃れ、細胞質体および細胞内小器官^13,15とのシームレスな統合を形成する。これらのセル-SiNW複合材料は、セルシリコンハイブリッドと呼ばれる、元の細胞のダイナミックで柔らかく、汎用性の高い性質だけでなく、SiNWの光電能力を有する。ハイブリダイゼーション後、細胞-SiNWハイブリッドは、標準的な組織培養技術を使用して収穫することができ、細胞内生体電気刺激などの様々な用途に使用することができます。細胞間生体結合を研究するそしてインビボ細胞特異的尋問のために。効果的な刺激は高い光学パワー密度とSiNWの共局在化を必要とするため、2Dと3Dの両方で高い空間分解能を実現できます。このプロトコルでは、方法論と結果の分析方法について詳しく説明します。インビトロでの細胞内および細胞間調査に焦点を当てていますが、この方法論のインビボ実装は、他の多くの生物学的シナリオに直接利用することができます。

プロトコル

倫理基準の遵守を確保するために、げっ歯類の心臓から心筋細胞を隔離することに関連するすべての動物の手順は、シカゴ大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって最初に承認されました。さらに、すべての動物実験は、シカゴ大学IACUCからの指導に従って完全に行われました。

1. 細胞-SiNWsハイブリッドの調製

1. メーカーのガイドラインに従って、商用キットを使用して、一次心筋細胞(CM)を分離します。
2. 10%の熱不活性化ウシ胎児血清、1%ペニシリンストレプトマイシン、および1%L-グルタミンを補った一次細胞分離のための完全なDMEMを準備する。
3. MFs-CM懸濁液から筋線維芽細胞(MF)を分離するには、分離した細胞を組織培養皿(ステップ1.1.1.1から2つの心臓から単離された細胞)に1時間前プレートします。CMはフィブロネクチンまたはコラーゲン処理面を接着する必要がありますので、MFsだけが組織培養表面に付着します。
4. 濃縮されたCM細胞懸濁液を吸引する。これらのCMは、セクション3に記載されているように、ヘテロ細胞結合実験に使用することができる。MM で MF を洗い上がって、MF の皿から残っている CM を取り除きます。
5. 新鮮な培養培地をMFに加え、〜80%コンフルエント(2-4日)になるまで増殖させます。1 日おきにメディアを変更します。
6. 細胞の準備ができたら(80%コンフルエント)、下記のハイブリダイゼーションステップ(ステップ1.7)のためにSiNWを準備します。
   注: これには多くの種類のSiNWを使用できます。本実験では、コアシェルp-i-n接合構成を有する化学蒸着(CVD)によって成長させたSiNWを、前述の¹⁶に用いた。CVD成長の間、SiNWはシリコンウエハ基板上で成長し、最終的にはSiNWで覆われたシリコンチップとして保持されます。
7. ダイヤモンドの筆記者を使用して、CVD成長SiNWでウエハーから3mm x 3mmチップをカットします。鋭利な鉗子を使用してウエハを処理し、SiNWを破壊する可能性があるため、鉗子に触れる表面積を最小限に抑えます。
8. チップを70%エタノールでリンスし、バイオセーフティラミナーフローフードでUV光下で30分間乾燥させてチップを殺菌します。
9. 完全な培養培地を使用して、無菌マイクロ遠心チューブにチップを移し、余分なエタノールをすすります。
10. 培養メディアの1 mLを追加し、1-10分間超音波浴でチップを超音波処理します。SiNWがメディアにリリースされると、メディアは曇りになるはずです。
    注:短い持続時間と低いパワーが長いSiNWをもたらすように、超音波処理の時間とパワーは、異なる超音波装置や異なるセルのために最適化する必要があります。
11. SiNWs懸濁液を5mLの培養培地に加え、MFで100mm組織培養皿に播種します。部分的に内部化された SiNW が使用する前に別の 1 時間座って、内部化を完了することを許可します。
    注: セルの種類によって SiNW の濃度や内部化時間が異なる場合があります。
12. 1:50の比率で無菌20 mM酢酸でコラーゲンストック溶液(3mg/mL)を希釈してコラーゲンコーティング液を調製します。35mmガラス底皿に0.5 mLコーティング溶液を加え、37°Cで1時間座るようにします。 溶液を取り除き、滅菌PBSで皿を洗いすります。
13. 3mLのトリプシンで細胞を37°Cで2分間処理して、細胞-SiNWsハイブリッドを収穫します。 10 mLの培養培地を加え、ピペットでハイブリッドを激しくすすいます。細胞を200 x g で5分間静かに遠心分離し、内部化されたSiNWで細胞を損傷しないようにします。余分な培地を取り除き、1 mL培地で細胞を懸濁し、コラーゲン処理ガラス底皿に播種します。
    注:ハイブリッドは、単独で播種することができ、細胞内または細胞間の結合を調査するか、またはVITROで異細胞結合を調査するためにCMを使用して。
14. 細胞の細胞質(カルセイン-AM、4 μM)および膜(膜マーカー、2μM)を37°Cで30分間標識し、共焦点顕微鏡を用いて細胞をイメージングすることにより、SiNW内在化の最終検証を行います。SiNWは反射性が高く、反射光を蛍光の代わりに使用して可視化することができます。

2. 細胞内・細胞間調査のための細胞の調製

1. コラーゲンコーティング液を1.12のように調製
2. 細胞内電気刺激のために、低い播種密度を有する培養ハイブリッド。セクション1.11から細胞を数えるために標準的なヘモサイトメーターを使用してください。そして、培養培地で35mmガラス底皿に50,000個の細胞を種付けします。細胞間調査では、より高い細胞密度(1皿あたり50万個の細胞)を使用してください。CMとMFの間の細胞間結合のために、新たに単離されたCMとのハイブリッドを共同培養する。
3. 光学刺激実験を行う前に細胞が一晩付着することを可能にする。細胞間調査では、実験が行われる前に細胞間ギャップ接合部を発現するために細胞が37°Cで48時間を許容する。
4. 50 μg Fluo-4 AMに DMSO 50 μL を加えて、カルシウム感受性染料ストック液(-20 °C)を調製します。1 μLの色素を1 mLのDMEMに希釈して染色液を調製します。
5. 細胞から培地を吸引し、1mLの染色液を加える。色素を37°Cで20〜30分間細胞に内在させます。 滅菌PBSで染料とリンスを2回吸引する。
6. 最後に、1 mLのプレ温フェノールレッドフリーDMEM培地を添加し、細胞内Fluo-4を37°Cで30分間の脱エステル化を行います。
7. 細胞を顕微鏡に移してイメージングと刺激を行います。

3. 光学的イメージングと刺激

1. 加湿したマイクロインキュベーターを37°Cに予熱し、気泡_-CO2 混合物(95:5)を加えます。
2. カルシウムイメージングと光学刺激のために、コリメートレーザーラインを光路に結合した顕微鏡を使用してください。
   注:走査共焦点顕微鏡は、その点刺激能力に最も簡単なオプションです。しかし、この手順は、ビームスプリッターを使用して光路の無限空間にコリメートレーザービームを結合することにより、任意の標準的な蛍光顕微鏡を使用して行うことができる。任意の顕微鏡の目的は、それを通過したコリメートレーザーが焦点を合わせるように設計されています。レーザー波長は励起光に近いはずですので、二色性鏡によって反射され、励起フィルタによって通過します。
3. SiNWを可視化し、明視野顕微鏡、透過光、反射光を使用して刺激部位を決定します。次に、SiNWの所定位置で刺激点を維持しながら、蛍光モードへの光路を再構成する。
4. SiNWサイズと細胞タイプごとに最適な刺激力とパルス長さを検証し、刺激を受けた細胞への光熱損傷を最小限に抑えます。典型的な刺激プロトコルについては、細胞内カルシウム活性の2〜10sベースライン記録を行う。次に、1~10mWの電力と1~10ミリ秒のレーザーパルス(30~300kW/mm²に対応)を1回塗布してSiNWを刺激し、得られたカルシウム波を2~10秒に記録します。
   注: 各 SiNW サイズとセルに対して、光パワーとパルス長を最適化することが不可欠です。これは、刺激された細胞への光熱損傷を最小限に抑えるために必要です。
5. さらに分析するために、必要に応じて光学刺激の記録されたムービーを転送します。

4. ビデオ処理

1. ImageJ¹⁸で利用可能な「dF over F」マクロ¹⁷を用いて蛍光4の変化を可視化し、各画素の蛍光数の変化を計算し、残りのベースラインの平均値で正規化する。出力 (浮動小数点形式) を 8 ビットに変換して、さらに処理を行います。
2. ImageJ で利用可能な選択中中央値フィルタを使用して、dF/F ムービーをさらに処理します。2 ピクセルの半径の中央値より 10 以上のピクセル値を削除し、そのピクセル値を中央値に置き換えるパラメーターを定義します。
3. Matlab コンピュータ ビジョン ツールボックスに実装されているように、ルーカス カナデ アルゴリズムを使用して各フレームのオプティカル フローを計算します。この関数の出力は、各画像の各点におけるオプティカルフローのx成分とy成分を含むベクトル場であった(補足 ファイル1でコードが入手可能である)。
   メモ: セル内の平均オプティカル フロー <ν> は、セル内のカルシウムフラックスの開発に対応します。光流量の微分Δ<ν>は、シグナルが最大になった場所を特定することで、カルシウムシグナルが活性化された時点を提供します。さらに、最大の Δ<ν> の大きさは、カルシウム波前線が細胞を通過する速度と相関しています。
4. 以下の式に従って、カルシウム透過の細胞間速度を計算する。
   v_Ca²⁺ = r_ij / ( t _max,j - t_max,i )
   ここで、t_max、jおよびt_max、iは、それぞれセル j と i の活性化の時間であり、r_ijはセルの中心間の距離です。

結果

細胞内サイトゾルへの直接アクセスを可能にするこの方法論の能力は、SiNWの細胞内への自発的な内在化に依存する。SiNWは多くの細胞型¹⁵に自発的な内在化を行うが、心筋細胞やニューロンなどの一部の細胞は、その内在化^を可能にするためにSiNWを治療する必要がある。このプロトコルでは、200-300 nmの直径および心臓MFに対して〜1〜3μmの長さのp-i-n SiNWの?...

ディスカッション

ここでは、細胞の細胞内電気刺激を行う簡単な方法を示しました。このデモでは、SiNW でプレハイブリダイズされた MF を使用し、CM と共培養しました。一般に、増殖する細胞の多くはSiNWを内在化する傾向があり、他の多くの細胞タイプでこの方法論を使用することができます。また、細胞内刺激を実証する一方で、細胞外刺激にも同じ原理を用いることができる。これは、自発的に内部化す...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Glass bottom dishes	Cellvis	D35-10-0-N
3i Marianas Spinning Disk Confocal	3i
Calcein-AM	Invitrogen	C1430
CellMask Orange Plasma membrane Stain	Invitrogen	C10045
Collagen I, rat tail	Gibco	A1048301
Deluxe Diamond Scribing Pen	Ted Pella	54468
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine	Gibco	10313039
DMSO, Anhydrous	Invitrogen	D12345
Falcon Standard Tissue Culture Dishes	Falcon	08-772E
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,	Gibco	10082147
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner	Fisher Scientific	FB11201
Fluo-4, AM, cell permeant	Invitrogen	F14201
FluoroBrite DMEM Media	Gibco	A1896701
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)	OKO
PBS, pH 7.4	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit	Thermo Scientific	88281
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056