Silizium-Nanodrähte und optische Stimulation für Untersuchungen der intra- und interzellulären elektrischen Kopplung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Silizium-Nanodrähten für die intrazelluläre optische Biomodulation von Zellen in einer einfachen und einfach durchzuführenden Methode. Die Technik ist sehr anpassungsfähig an verschiedene Zelltypen und kann sowohl für In-vitro- als auch für In-vivo-Anwendungen eingesetzt werden.

Zusammenfassung

Myofibroblasten können spontan Silizium-Nanodrähte (SiNWs) verinnerlichen und sind damit ein attraktives Ziel für bioelektronische Anwendungen. Diese Zell-Silizium-Hybride bieten bleifreie optische Modulationsfunktionen mit minimaler Störung des normalen Zellverhaltens. Die optischen Fähigkeiten werden durch die photothermischen und photoelektrischen Eigenschaften von SiNWs ermittelt. Diese Hybriden können mit Standard-Gewebekulturtechniken geerntet und dann auf verschiedene biologische Szenarien angewendet werden. Wir zeigen hier, wie diese Hybriden verwendet werden können, um die elektrische Kopplung von Herzzellen zu untersuchen und zu vergleichen, wie Myofibroblasten miteinander oder mit Kardiomyozyten verzahnt werden. Dieser Prozess kann ohne spezielle Ausrüstung jenseits eines Fluoreszenzmikroskops mit gekoppelter Laserlinie durchgeführt werden. Gezeigt wird auch die Verwendung einer maßgeschneiderten MATLAB-Routine, die die Quantifizierung der Kalziumvermehrung innerhalb und zwischen den verschiedenen Zellen in der Kultur ermöglicht. Myofibroblasten haben nachweislich eine langsamere elektrische Reaktion als Kardiomyozyten. Darüber hinaus zeigt die myofibroblast-interzelluläre Ausbreitung etwas langsamere, wenn auch vergleichbare Geschwindigkeiten mit ihren intrazellulären Geschwindigkeiten, was auf eine passive Ausbreitung durch Spaltknoten oder Nanoröhren hindeutet. Diese Technik ist sehr anpassungsfähig und kann leicht auf andere zelluläre Arenen angewendet werden, sowohl für In-vitro-, als auch in vivo- oder ex vivo-Untersuchungen.

Einleitung

Alle biologischen Organismen nutzen Elektrizität in Form von Ionen, um das zelluläre Verhalten zu regulieren. Zellmembranen enthalten verschiedene Arten spezifischer Ionenkanäle, die den passiven und aktiven Transport von Ionen ermöglichen. Diese Ionen steuern die Funktionen von erregbaren Zellen, wie neuronale Aktivität und Skelett und Herzmuskelkontraktilität. Jedoch, Bioelektrizität spielt auch eine wichtige Rolle in nicht-erregbaren Zellen, die viele zelluläre Funktionen wie Zellproliferation^1,Neuroimmunität^2,3,4und Stammzelldifferenzierung⁵.

In den letzten Jahrzehnten hat der Bereich der Bioelektrizität ein wachsendes Interesse geweckt, was zur Entwicklung zahlreicher Technologien für bioelektronische Schnittstellen beigetragen hat. Mikroelektroden-Patchpipetten sind der Goldstandard der intrazellulären Aufzeichnung und Stimulation⁶. Bei dieser Methode wird eine Glaspipette unter bestimmten Bedingungen gezogen, um eine scharfe Kante mit einer Porengröße von wenigen Mikrometern zu bilden. Diese Pipette ist mit einem Puffer gefüllt und die Pipette ermöglicht den direkten Kontakt des Puffers mit dem intrazellulären Volumen. Daraus ergibt sich eine bioelektrische Schnittstelle, die extrem hohe Signal-Rausch-Verhältnisse, eine präzise Steuerung der zellulären elektrischen Aktivität und eine extrem hohe zeitliche Auflösung liefert. Obwohl diese Methode ein extrem leistungsfähiges Werkzeug ist, das vor kurzem auf eine Nanopipettenkonfiguration⁷herunterskaliert wurde, ist es mit mehreren wichtigen technischen Einschränkungen verbunden. Der Zytosolverdünnungseffekt⁸sowie mechanische Vibrationen beschränkt seinen Nutzen auf kurzfristige Verhöre und erfordert teure Spezialausrüstung und ein hohes Maß an technischem Geschick. Darüber hinaus begrenzt seine Sperrigkeit die Anzahl der Zellen, die gleichzeitig aufgezeichnet oder stimuliert werden können, und aufgrund seiner Invasivität kann es während eines Experiments nicht neu konfiguriert werden. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden Mikroelektroden-Arrays entwickelt, aber die Größe der Elektroden begrenzt die räumliche Auflösung sowie den intrazellulären Zugang. Nanoelektroden-Arrays ermöglichen intrazelluläre Aufzeichnung und Stimulation, erfordern aber eine abrasive Elektroporation, um auf das Zytosol^9,10zugreifen zu können. Darüber hinaus sind alle diese Methoden substratgebunden und daher auf In-vitro-Zellkulturen oder auf externe oberflächliche Zellen beschränkt, ohne Zugang zu Zellen, die sich in einem dreidimensionalen (3D) Gewebe befinden.

Optogenetik¹¹ ist weit verbreitet, um diese 3D- und In-vivo-Beschränkungen zu beheben. Optogenetische Methoden basieren jedoch auf den Störungen von lichtaktivierten Plasmamembran-Ionenkanälen, die an der Plasmamembran verteilt werden, wodurch die räumliche 3D-Auflösung¹² und intrazelluläre Fähigkeiten begrenzt werden.

Wir haben vor kurzem gezeigt, dass Silizium-Nanodrähte (SiNWs) verwendet werden können, um intrazelluläre bioelektrische Verhöre mit submikronräumlicher Auflösung mit verschiedenen nicht erregbaren Zellen durchzuführen, nämlich Herzmyofibroblasten und Oligodendrozyten¹³. Darüber hinaus verwendeten wir diese SiNWs, um ex-vivo zellspezifische Verhöre innerhalb eines 3D-Herzgewebes durchzuführen, um zu untersuchen, wie Herzzellen in vivo¹⁴elektrisch koppeln. Ein großer Vorteil dieser Methode ist ihre Einfachheit; es erfordert keine genetische Veränderung oder sperrige Instrumentierung. Viele Zellen verinnerlichen spontan fotoresponsive SiNWs ohne Beschallung oder Elektroporation¹⁵. Darüber hinaus entfliehen sie spontan der endosomalen Verkapselung und bilden eine nahtlose Integration mit den Zytosolen und intrazellulären Organellen^13,15. Diese Zell-SiNWs-Verbundwerkstoffe, sogenannte Zell-Silizium-Hybride, besitzen die dynamische, weiche und vielseitige Natur der ursprünglichen Zelle sowie die optoelektrischen Fähigkeiten der SiNWs. Nach der Hybridisierung kann der Zell-SiNW-Hybrid mit Standard-Gewebekulturtechniken geerntet und für verschiedene Anwendungen wie intrazelluläre bioelektrische Stimulation verwendet werden; Untersuchung der interzellulären bioelektrischen Kopplung in vitro; und für in vivo zellspezifische Verhöre. Da eine effektive Stimulation eine Kolokalisierung von hohen optischen Leistungsdichten und SiNWs erfordert, kann man sowohl in 2D als auch in 3D eine hohe räumliche Auflösung erzielen. In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert die Methodik sowie wie die Ergebnisse analysiert werden können. Der Schwerpunkt liegt auf der intra- und interzellulären Untersuchung in vitro, aber die in vivo Umsetzung dieser Methode kann direkt für viele andere biologische Szenarien genutzt werden.

Protokoll

Um die Einhaltung ethischer Standards zu gewährleisten, wurden alle tiertierischen Verfahren im Zusammenhang mit der Isolierung von Kardiomyozyten aus Nagetierherzen zuerst vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Chicago genehmigt. Darüber hinaus wurden alle Tierversuche in vollständiger Übereinstimmung mit Anleitung der University of Chicago IACUC durchgeführt.

1. Herstellung von Zell-SiNWs-Hybriden

1. Isolieren Sie primäre Kardiomyozyten (CMs) mit einem kommerziellen Kit nach den Richtlinien des Herstellers.
2. Bereiten Sie komplettes DMEM für die primäre Zellisolation vor, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin und 1% L-Glutamin.
3. Um Myofibroblast (MFs) von der MFs-CMs Suspension zu isolieren, die isolierten Zellen auf eine Gewebekulturschale (Zellen isoliert von 2 Herzen ab Schritt 1.1. pro 100 mm Schale) für 1 h vorzublenden. Da CMs eine Fibronectin- oder Kollagen-behandelte Oberfläche benötigen, um haften zu können, werden nur MFs an der Gewebekulturoberfläche befestigt.
4. Aspirieren Sie die angereicherte CMs-Zellsuspension. Diese CMs können für heterozelluläre Kopplungsexperimente verwendet werden, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Spülen Sie die MFs mit DMEM, um alle verbleibenden CMs aus dem MFs-Gericht zu entfernen.
5. Fügen Sie den MFs ein frisches Kulturmedium hinzu und lassen Sie sie sich vermehren, bis sie zu 80 % (2-4 Tage) konfluent sind. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag.
6. Wenn die Zellen bereit sind (80% konfluent), bereiten Sie SiNWs für den hybridisierenden Schritt unten vor (Schritt 1.7).
   HINWEIS: Viele Arten von SiNWs können dafür verwendet werden. In diesem Experiment wurden SiNWs verwendet, die durch chemische Dampfabscheidung (CVD) mit einer Core-Shell p-i-n-Knotenkonfiguration angebaut wurden, wie zuvor^{beschrieben 16}. Während des CVD-Wachstums werden die SiNWs auf einem Siliziumwafersubstrat angebaut und schließlich als Siliziumchips mit SiNWs abgedeckt.
7. Schneiden Sie einen 3 mm x 3 mm Chip aus einem Wafer mit CVD gewachsenen SiNWs mit einem Diamantschreiber. Verwenden Sie scharfe Zangen, um den Wafer zu behandeln und die Oberfläche zu minimieren, die mit den Zangen berührt wird, da dies die SiNWs brechen kann.
8. Sterilisieren Sie den Chip, indem Sie ihn mit 70% Ethanol spülen und das Ethanol 30 min unter UV-Licht in einer biosafety laminaren Durchflusshaube trocknen lassen.
9. Übertragen Sie den Chip in ein steriles Mikrozentrifugenrohr und spülen Sie überschüssiges Ethanol mit vollständigen Kulturmedien.
10. Fügen Sie 1 ml Kulturmedien hinzu und beschallen Sie den Chip im Beschallungsbad für 1-10 min. Die Medien sollten trüb werden, wenn SiNWs in die Medien veröffentlicht werden.
    HINWEIS: Beschallungszeit und -leistung sollten für verschiedene Beschallungsgeräte oder verschiedene Zellen optimiert werden, da kürzere Dauern und geringere Kräfte längere SiNWs ergeben.
11. Fügen Sie die SiNWs Suspension in 5 ml Kulturmedien ein und säen Sie sie mit MFs auf die 100 mm Gewebekulturschale. Lassen Sie die SiNWs 4 h verinnerlichen und spülen Sie die überschüssigen SiNWs mit Medien 5x ab. Erlauben Sie teilweise internalisierten SiNWs, die Internalisierung abzuschließen, indem sie vor der Verwendung weitere 1 H sitzen.
    HINWEIS: Verschiedene Zelltypen können unterschiedliche SiNWs-Konzentration und/oder Verinnerungszeiten erfordern.
12. Bereiten Sie Kollagen-Beschichtungslösung durch Verdünnen von Kollagen-Stammlösung (3 mg/ml) mit steriler 20 mM Essigsäure im Verhältnis 1:50 vor. 0,5 ml Beschichtungslösung zu einer 35 mm Glasbodenschale geben und 1 h in 37 °C sitzen lassen. Entfernen Sie die Lösung und spülen Sie die Schale mit sterilem PBS.
13. Ernte der Zell-SiNWs-Hybriden, indem Sie die Zellen mit 3 ml Trypsin für 2 min bei 37 °C behandeln. Fügen Sie 10 ml Kulturmedien hinzu und spülen Sie die Hybriden kräftig durch Pipettieren. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min vorsichtig bei 200 x g, um eine Beschädigung der Zellen mit den internalisierten SiNWs zu vermeiden. Entfernen Sie überschüssige Medien, suspendieren Sie Zellen mit 1 ml Medien und säen Sie sie auf die kollagen behandelte Glasbodenschale.
    HINWEIS: Die Hybriden können allein gesät werden, um die intrazelluläre oder interzelluläre Kopplung zu untersuchen, oder mit CMs, um die heterozelluläre Kopplung in vitro zu untersuchen.
14. Führen Sie eine abschließende Überprüfung der SiNW-Internalisierung durch, indem Sie das Cytosol (Calcein-AM, 4 M) und die Membran (Membranmarker, 2 m) 30 min bei 37 °C beschriften und die Zelle mittels konfokaler Mikroskopie abbilden. Da SiNWs stark reflektierend sind, kann reflektiertes Licht anstelle von Fluoreszenz verwendet werden, um sie zu visualisieren.

2. Vorbereitung von Zellen für intra- und interzelluläre Untersuchungen

1. Vorbereiten der Kollagenbeschichtungslösung wie in 1.12
2. Für die intrazelluläre elektrische Stimulation, Kultur-Hybriden mit geringer Sädichte. Verwenden Sie ein Standardhämozytometer, um Zellen aus Abschnitt 1.11 zu zählen. und Säen Sie 50.000 Zellen auf einer 35 mm Glasbodenschale in Kulturmedien. Für interzelluläre Untersuchungen verwenden Sie höhere Zelldichten (500.000 Zellen pro Schale). Für die interzelluläre Kopplung zwischen CMs und MFs werden die Hybriden mit frisch isolierten CMs kokulturiert.
3. Lassen Sie Zellen über Nacht anbringen, bevor Sie optische Stimulationsexperimente durchführen. Für interzelluläre Untersuchungen 48 h bei 37 °C für die Zellen erlauben, interzelluläre Spaltverbindungen auszudrücken, bevor das Experiment durchgeführt wird.
4. Bereiten Sie kalziumempfindliche Farbstoff-Lösung (kann in -20 °C gehalten werden) durch Zugabe von 50 l DMSO zu 50 g Fluo-4 AM. Bereiten Sie die Färbelösung vor, indem Sie 1 l Farbstoff in 1 ml DMEM verdünnen.
5. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus den Zellen und fügen Sie 1 ml Färbelösung hinzu. Farbstoff 20-30 min bei 37 °C in Zellen verinnerlichen lassen. Den Farbstoff ansaugen und zweimal mit sterilem PBS abspülen.
6. Schließlich 1 ml vorgewärmtphenolrot-freie DMEM Media hinzufügen und die intrazelluläre Fluo-4 für 30 min bei 37 °C entestert werden lassen.
7. Übertragen Sie Zellen zum Mikroskop zur Bildgebung und Stimulation.

3. Optische Bildgebung und Stimulation

1. Vorheizen eines befeuchteten Mikroinkubators auf 37 °C und Blasenluft-CO2-Gemisch (95:5).
2. Verwenden Sie ein Mikroskop mit einer kollimierten Laserlinie, die in den Lichtpfad für die Kalzium-Bildgebung und optische Stimulation gekoppelt ist.
   HINWEIS: Ein Raster-Konfokalmikroskop ist aufgrund seiner Punktstimulationsfähigkeiten die einfachste Option. Dieses Verfahren kann jedoch mit jedem Standardfloreszenzmikroskop durchgeführt werden, indem ein kollimierter Laserstrahl mit einem Strahlsplitter in den unendlichen Raum des Lichtpfades gekoppelt wird. Jedes Mikroskopobjektiv ist so konzipiert, dass ein kollimierter Laser, der durch ihn geleitet wird, auf einen beugungsbegrenzten Laserfleck an der Brennebene fokussiert wird. Die Laserwellenlänge sollte in der Nähe des Anregungslichts sein, so dass sie vom dichroitischen Spiegel reflektiert und vom Anregungsfilter übergeben wird.
3. Visualisieren Sie die SiNWs und bestimmen Sie die Stimulationsstelle mithilfe von Hellfeldmikroskopie, durchlichtem Licht oder reflektierendem Licht. Konfigurieren Sie dann den Lichtpfad in den Fluoreszenzmodus, während Sie den Stimulationspunkt an der vordefinierten Position des SiNW beibehalten.
4. Validieren Sie die optimale Stimulationsleistung und Pulslänge für jede SiNW-Größe und jeden Zelltyp, um photothermische Schäden an stimulierten Zellen zu minimieren. Führen Sie für ein typisches Stimulationsprotokoll eine 2-10 s Baseline-Aufzeichnung der intrazellulären Calciumaktivität durch. Wenden Sie dann einen einzelnen Laserpuls von 1-10 mW Leistung und 1-10 ms Dauer (entsprechend 30-300 kW/mm²) an, um den SiNW zu stimulieren, und zeichnen Sie die resultierende Kalziumwelle für weitere 2-10 s auf.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die optische Leistung und Pulslänge für jede SiNW-Größe und -Zellen zu optimieren. Dies ist notwendig, um photothermische Schäden an den stimulierten Zellen zu minimieren.
5. Übertragen Sie ggf. die aufgenommenen Filme der optischen Stimulation zur weiteren Analyse.

4. Videoverarbeitung

1. Visualisieren Sie Änderungen der Fluo-4-Fluoreszenz mithilfe des^für ImageJ¹⁸verfügbaren Makros "dF über F", das die Änderung der Fluoreszenzanzahl für jedes Pixel berechnet und durch den Durchschnittswert der Ruhebasislinie normalisiert. Konvertieren Sie die Ausgabe (Gleitkommaformat) zur weiteren Verarbeitung in 8 Bit.
2. Verarbeiten Sie den dF/F-Film weiter mit dem selektiven Medianfilter "Ausreißerentfernen ", der in ImageJ verfügbar ist. Definieren Sie Parameter, um Pixel zu entfernen, deren Wert mehr als 10 über dem Medianwert in einem Radius von 2 Pixeln liegt, und ersetzen Sie diesen Pixelwert durch den Median.
3. Berechnen Sie den optischen Fluss in jedem Frame über den Lucas-Kanade-Algorithmus, wie er in der Matlab Computer Vision Toolbox implementiert ist. Die Ausgabe dieser Funktion war ein Vektorfeld, das die x- und y-Komponenten des optischen Flusses an jedem Punkt in jedem Bild enthielt (Code ist in Der Zusatzdatei 1verfügbar).
   ANMERKUNG: Der mittlere optische Fluss innerhalb einer Zelle, <->, entspricht der Entwicklung des Kalziumflusses innerhalb einer Zelle. Das Differential des optischen Flusses, s<> liefert den Zeitpunkt, an dem die Calciumsignalisierung aktiviert wurde, indem ermittelt wird, wo das Signal maximiert wurde. Darüber hinaus korreliert die maximale Größe von s<> mit der Geschwindigkeit, mit der die Kalziumwellenfront durch die Zelle fortschreitet.
4. Berechnen Sie die interzelluläre Geschwindigkeit der Kalziumübertragung gemäß der folgenden Gleichung.
   v_Ca²⁺ = r_ij / ( t_max,j
   wobei t_max,j und t_max,i die Zeiten der Aktivierung für die Zellen j bzw. i sind, und r_ij ist der Abstand zwischen den Schwerpunkten der Zellen.

Ergebnisse

Die Fähigkeit dieser Methode, einen direkten Zugang zum intrazellulären Zytosol zu ermöglichen, hängt von der spontanen Internalisierung des SiNW in die Zellen ab. Obwohl SiNWs einer spontanen Internalisierung in viele Zelltypen¹⁵unterzogen werden, werden einige Zellen, wie Kardiomyozyten und Neuronen, die SiNWs benötigen, um ihre Internalisierung zu ermöglichen¹⁹. In diesem Protokoll beschreiben wir den Internalisierungsprozess von p-i-n SiNWs mit 200-300 nm Durchmes...

Diskussion

Wir haben hier eine einfache Möglichkeit zur intrazellulären elektrischen Stimulation von Zellen demonstriert. In dieser Demo haben wir MFs verwendet, die mit SiNWs vorhybridisiert und dann mit CMs kokultiviert wurden. Im Allgemeinen haben die meisten sich vermehrenden Zellen die Tendenz, SiNWs zu internalisieren, was die Verwendung dieser Methode mit vielen anderen Zelltypen ermöglicht. Darüber hinaus haben wir zwar die intrazelluläre Stimulation von Zellen demonstriert, aber die gleichen Prinzipien können verwend...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Glass bottom dishes	Cellvis	D35-10-0-N
3i Marianas Spinning Disk Confocal	3i
Calcein-AM	Invitrogen	C1430
CellMask Orange Plasma membrane Stain	Invitrogen	C10045
Collagen I, rat tail	Gibco	A1048301
Deluxe Diamond Scribing Pen	Ted Pella	54468
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine	Gibco	10313039
DMSO, Anhydrous	Invitrogen	D12345
Falcon Standard Tissue Culture Dishes	Falcon	08-772E
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,	Gibco	10082147
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner	Fisher Scientific	FB11201
Fluo-4, AM, cell permeant	Invitrogen	F14201
FluoroBrite DMEM Media	Gibco	A1896701
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)	OKO
PBS, pH 7.4	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit	Thermo Scientific	88281
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056