실리콘 나노 와이어 및 세포 간 전기 커플링의 조사를위한 광학 자극

요약

이 프로토콜은 간단하고 수행하기 쉬운 방법으로 세포의 세포 내 광학 바이오 변조를위한 실리콘 나노 와이어의 사용을 설명합니다. 이 기술은 다양한 세포 유형에 매우 적응력이 뛰어나며 생체 내뿐만 아니라 생체 내 응용 분야에도 사용할 수 있습니다.

초록

Myofibroblasts는 자발적으로 실리콘 나노 와이어 (SiNWs)를 내면화 할 수 있습니다, 그들에게 바이오 전자 응용 프로그램에 대한 매력적인 대상이 될 수 있습니다. 이러한 셀-실리콘 하이브리드는 정상적인 세포 거동에 최소한의 교란을 통해 납없는 광학 변조 기능을 제공합니다. 광학 기능은 SiNWs의 광열 및 광전 특성에 의해 얻어진다. 이러한 하이브리드는 표준 조직 배양 기술을 사용하여 수확한 다음 다른 생물학적 시나리오에 적용할 수 있습니다. 우리는 이 혼성이 어떻게 심장 세포의 전기 결합을 연구하고 근섬유 세포가 서로 또는 심근세포에 어떻게 결합되는지 비교하기 위하여 어떻게 이용될 수 있는지 여기에서 보여줍니다. 이 과정은 결합 된 레이저 라인과 형광 현미경을 넘어 특별한 장비없이 달성 할 수 있습니다. 또한 배양시 다른 세포 들 사이 칼슘 전파의 정량화를 허용하는 맞춤형 MATLAB 루틴의 사용이 도시되어 있습니다. 근섬유 세포는 심근 세포보다 느린 전기 반응을 보이는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 근섬유세포 세포 간 전파는 약간 느리게 보여줍니다, 비록 그들의 세포 내 속도에 비교 속도, 갭 접합 또는 나노 튜브를 통해 수동 전파를 제안. 이 기술은 매우 적응력이 뛰어나며 생체 외뿐만 아니라 생체 내 또는 전 생체 내 조사를 위해 다른 셀룰러 경기장에 쉽게 적용 할 수 있습니다.

서문

모든 생물학적 유기체는 이온의 형태로 전기를 사용하여 세포 행동을 조절합니다. 세포막에는 이온의 수동적이고 능동적인 운반을 허용하는 다양한 유형의 특정 이온 채널을 함유하고 있습니다. 이 이온은 흥분하는 세포의 기능을 지배, 신경 활동 및 골격 및 심장 근육 수축 등. 그러나, 바이오전기는 또한 세포증식^1,신경면역^2,3,4,줄기세포 분화^5와같은 많은 세포 기능을 지배하는 비흥분성 세포에서 중요한 역할을 한다.

최근 수십 년 동안 바이오 전기 분야는 점점 더 높은 관심을 불러 왔으며, 이는 바이오 전자 인터페이스를 위한 수많은 기술 개발에 기여했습니다. 마이크로 전극 패치 파이펫은 세포 내 기록 및 자극^6의금 본위제이다. 이 방법론에서는 특정 조건에서 유리 파이펫을 당겨 공공 크기가 거의 없는 날카로운 모서리를 형성합니다. 이 파이펫은 버퍼로 채워지며 파이펫을 사용하면 세포 내 부피와 버퍼의 직접 접촉할 수 있습니다. 이로 인해 매우 높은 신호대 잡음 비, 셀룰러 전기 활동을 정밀하게 제어하며 매우 높은 시간적 분해능을 생성하는 바이오 전기 인터페이스가 생성됩니다. 이 방법론은 최근 나노 파이펫 구성^7로축소 된 매우 강력한 도구이지만 몇 가지 중요한 기술적 한계와 관련이 있습니다. 사이토솔 희석 효과^8,기계적 진동뿐만 아니라, 단기 심문에 유틸리티를 제한하고, 고가의 전문 장비와 높은 수준의 기술 기술이 필요합니다. 더욱이, 그것의 부피가 기록되거나 동시에 자극될 수 있는 세포의 수를 제한하고, 그것의 침략으로 인해, 실험을 통해 재구성될 수 없습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 마이크로 전극 어레이가 개발되었지만 전극의 크기는 세포 내 액세스뿐만 아니라 공간 해상도를 제한합니다. 나노 전극 어레이는 세포 내 기록 및 자극을 허용하지만 사이토솔^9,10에액세스하기 위해 연마 전기 포기가 필요합니다. 또한, 이러한 모든 방법론은 기판에 결합되어 따라서 체외 세포 배양, 또는 외부 피상 세포로 제한되며, 3차원(3D) 조직 내부에 있는 세포에 접근할 수 없다.

^{광유전학(11)은} 이러한 3D 및 생체 제한 문제를 해결하기 위해 널리 사용된다. 그러나, 광유전학적 방법은 혈장 막에 분포되는 광 활성화 플라즈마 멤브레인 이온 채널의 동요를 기반으로 하며, 3D 공간^{해상도(12)와} 세포내 기능을 제한한다.

우리는 최근에 실리콘 나노 와이어 (SiNWs)가 다른 비 흥분 세포, 즉 심장 근섬유 세포 및 올리고덴드로키테^(13)와하위 micron 공간 해상도와 세포 내 생물 전적 심문을 수행하는 데 사용할 수 있음을 보여 주었다. 더욱이, 우리는 3D 심장 조직 내에서 전 생체 세포 특정 심문을 수행하기 위해 이러한 SiNWs를 사용하여 심장 세포가 생체^14에서전기적으로 결합하는 방법을 조사하였다. 이 방법론의 주요 장점은 단순함입니다. 그것은 어떤 유전 적 변형 또는 부피가 큰 계측을 필요로하지 않습니다. 많은 세포가 초음파 처리 또는 전기화^15에대한 필요없이 자발적으로 사진 반응 SiNWs를 내면화합니다. 또한, 그들은 자발적으로 내피 캡슐화를 탈출하고 사이토솔 및 세포 내^{세포세포(13,15)와}원활한 통합을 형성한다. 셀-실리콘 하이브리드라고 불리는 이 셀-SiNWs 복합체는 SiNWs의 연동적이고 부드럽고 다재다능한 특성뿐만 아니라 SiNWs의 광전 기능을 가지고 있습니다. 혼성화 후, 세포-SiNW 하이브리드는 표준 조직 배양 기술을 사용하여 수확하고 세포내 바이오전 자극과 같은 다양한 용도에 사용될 수 있다; 체외에서 세포 간 바이오 전기 커플링을 공부; 그리고 생체 내 세포 특정 심문. 효과적인 자극은 높은 광학 전력 밀도와 SiNWs의 공동 국소화가 필요하므로 2D 및 3D 모두에서 높은 공간 해상도를 달성할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 방법론뿐만 아니라 결과를 분석할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 초점은 체외에서 세포 내 및 세포 간 조사에 배치됩니다, 그러나 이 방법론의 생체 내 구현은 많은 그밖 생물학 시나리오에 직접 이용될 수 있습니다.

프로토콜

윤리 기준을 준수하기 위해 설치류 심장에서 심근세포 를 분리하는 것과 관련된 모든 동물 절차는 시카고 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 처음 승인되었습니다. 또한, 모든 동물 실험은 시카고 IACUC 대학의 지침에 따라 완전히 수행되었습니다.

1. 셀-SiNWs 하이브리드의 준비

1. 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 1차 심근세포(CM)를 분리합니다.
2. 10% 열 불활성 태아 소 혈청, 1% 페니실린-연쇄절제술, 1% L-글루타민으로 보충된 1차 세포 격리를 위한 완전한 DMEM을 준비하십시오.
3. MFs-MC 서스펜션으로부터 근섬유세포(MFs)를 분리하기 위해, 조직 배양 접시에 격리된 세포를 미리 플레이트(100mm 접시당 1.1. 1.1. 100mm 접시당 2개의 하트로부터 분리된 세포). CM은 부착하기 위해 섬유넥틴 또는 콜라겐 처리 표면이 필요하기 때문에, 오직 MF만이 조직 배양 표면에 부착됩니다.
4. 농축된 CM 셀 서스펜션을 흡인합니다. 이러한 CM은 섹션 3에 설명된 바와 같이 이종 세포 커플링 실험에 사용될 수 있다. MF를 DMEM으로 헹신후 MF접시의 남은 CM을 제거합니다.
5. MF에 신선한 배양 매체를 추가하고 - 80 % 컨할 때까지 확산 할 수 있습니다 (2-4 일). 격일로 매체를 변경합니다.
6. 세포가 준비되면(80% 컨캔수), 아래혼성화 단계에 대해 SiNW를 준비한다(1.7단계).
   참고: 많은 유형의 SiNWs를 사용할 수 있습니다. 본 실험에서, 코어 쉘 p-i-n 접합 구성을 가진 화학 증기 증착(CVD)에 의해 성장된 SiNW는^이전에설명된 바와 같이 사용되었다. CVD 성장 하는 동안, SiNWs 실리콘 웨이퍼 기판에 성장 하 고 결국 SiNWs로 덮여 실리콘 칩으로 유지 됩니다.
7. 다이아몬드 스크라이브를 사용하여 CVD 재배 SiNWs로 웨이퍼에서 3mm x 3mm 칩을 잘라냅니다. 날카로운 집게를 사용하여 웨이퍼를 처리하고 시프와 접촉하는 표면적을 최소화합니다.
8. 70% 에탄올로 헹구고 바이오 세이프티 라미나르 플로우 후드에서 자외선 아래에서 30분 동안 에탄올이 건조할 수 있도록 하여 칩을 멸균합니다.
9. 칩을 멸균 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 완전한 배양 매체를 사용하여 과도한 에탄올을 헹구십시오.
10. 문화 용 매체 1 mL을 추가하고 초음파 욕조에서 칩을 1-10 분 동안 초음파 처리하십시오. SiNWs가 미디어로 공개됨에 따라 미디어는 흐려야 합니다.
    참고: 더 짧은 지속 시간 및 낮은 힘이 더 긴 SiNW를 생성하므로 초음파 처리 시간과 전력은 서로 다른 초음파 장치 또는 다른 셀에 최적화되어야 합니다.
11. SiNWs 서스펜션을 5mL의 문화 매체에 추가하고 MF를 사용하여 100mm 조직 배양 접시에 시드하십시오. 부분적으로 내부화된 SiNWs를 사용하여 사용 전에 1h에 다른 사용자가 앉을 수 있도록 하여 내부화를 완료할 수 있도록 허용합니다.
    참고: 다른 세포 유형은 다른 SiNWs 농도 및/또는 내소화 시간을 필요로 할 수 있습니다.
12. 1:50의 비율로 멸균 20 mM 아세트산으로 콜라겐 스톡 용액(3 mg/mL)을 희석하여 콜라겐 코팅 솔루션을 준비합니다. 35mm 유리 바닥 접시에 0.5 mL 코팅 용액을 추가하고 37 ° C에서 1 시간 동안 앉을 수 있습니다. 용액을 제거하고 멸균 PBS로 접시를 헹구는 것입니다.
13. 세포-SiNWs 하이브리드를 37°C에서 2분 동안 트립신 3mL로 처리하여 수확한다. 10mL의 문화 매체를 추가하고 파이펫팅을 통해 하이브리드를 적극적으로 헹신다. 내부SiNW로 세포를 손상시키지 않도록 5 분 동안 200 x g에서 세포를 부드럽게 원심 분리합니다. 과잉 매체를 제거하고 1mL 매체로 세포를 일시 중단하고 콜라겐 처리 유리 바닥 접시에 종자.
    참고: 하이브리드는 단독으로 시드를 배정할 수 있으며, 세포 내 또는 세포 간 커플링을 조사하거나 CM을 사용하여 체외에서 이종 세포 커플링을 조사할 수 있습니다.
14. 37°C에서 30분 동안 세포의 사이토솔(calcein-AM, 4 μM) 및 멤브레인(멤브레인 마커, 2 μM)을 표시하고, 공초점 현미경을 사용하여 세포를 이미징하여 SiNW 내재화의 최종 검증을 수행한다. SiNWs는 반사성이 높기 때문에 반사된 빛을 형광 대신 사용하여 시각화할 수 있습니다.

2. 세포 내 및 세포 간 조사를 위한 세포 준비

1. 콜라겐 코팅 용액 을 1.12로 준비
2. 세포 내 전기 자극의 경우, 낮은 종자 밀도를 가진 배양 하이브리드. 표준 혈청계를 사용하여 1.11절에서 셀을 계산합니다. 배양 배지의 35mm 유리 바닥 접시에 50,000개의 셀을 시드합니다. 세포 간 조사의 경우, 더 높은 세포 밀도 (접시 당 500,000 세포)를 사용합니다. CM과 MF 간의 세포 간 커플링의 경우 새로 분리된 CM과 하이브리드를 공동 배양합니다.
3. 광학 자극 실험을 수행하기 전에 세포가 하룻밤 사이에 부착되도록 허용합니다. 세포 간 조사의 경우, 실험이 수행되기 전에 세포 간 갭 접합을 발현하는 세포에 대해 37°C에서 48h를 허용한다.
4. 50 μg 플루오-4 AM에 DMSO의 50 μL을 추가하여 칼슘 민감한 염료 스톡 용액(-20°C)을 준비한다. DMEM의 1mL에 1 μL의 염료를 희석하여 염색 용액을 준비합니다.
5. 세포에서 배양 배지를 흡인하고 염색 용액 1mL을 추가합니다. 염료가 37°C에서 20-30분 동안 세포안으로 내면화되도록 허용한다. 멸균 PBS로 염료를 흡입하고 두 번 헹구세요.
6. 마지막으로, 미리 따뜻해지는 페놀 레드 프리 DMEM 미디어 1mL을 추가하고, 세포내 플루오-4가 37°C에서 30분 동안 탈에스테르화를 받을 수 있도록 한다.
7. 이미징 및 자극을 위해 현미경으로 세포를 전송합니다.

3. 광학 이미징 및 자극

1. 가습 된 마이크로 인큐베이터를 37 °C및 버블 공기 -CO₂ 혼합물 (95:5)으로 예열합니다.
2. 칼슘 이미징 및 광학 자극을 위해 광 경로에 결합된 레이저 라인과 현미경을 사용하십시오.
   참고: 스캐닝 공초점 현미경은 점 자극 기능으로 인해 가장 간단한 옵션입니다. 그러나, 이 절차는 빔 스플리터를 사용하여 광 경로의 무한공간으로 콜라진 레이저 빔을 결합하여 임의의 표준 플로레스세임 현미경을 사용하여 수행할 수 있다. 모든 현미경 목적은 이를 통과한 레이저가 초점 평면의 회절 제한 레이저 지점에 초점을 맞출 수 있도록 설계되었습니다. 레이저 파장이 여기 빛에 가까워야하므로 이색 거울에 의해 반사되고 흥분 필터에 의해 전달됩니다.
3. SiNWs를 시각화하고 밝은 필드 현미경 검사법, 전송 된 빛 또는 반사 광을 사용하여 자극 부위를 결정합니다. 그런 다음, SiNW의 미리 정의된 위치에서 자극 점을 유지하면서 형광 모드로 광 경로를 재구성한다.
4. 각 SiNW 크기와 세포 유형에 대한 최적의 자극 력과 펄스 길이를 검증하여 자극된 세포에 대한 광열 손상을 최소화합니다. 일반적인 자극 프로토콜의 경우, 세포내 칼슘 활성의 2-10s 기준선 기록을 수행한다. 그런 다음, 1-10mW 전력및 1-10ms 지속시간(30-300 kW/mm^2에해당)의 단일 레이저 펄스를 적용하여 SiNW를 자극하고, 생성된 칼슘 파를 2-10s에 기록한다.
   참고: 각 SiNW 크기와 셀에 대한 광학 전력 및 펄스 길이를 최적화하는 것이 필수적입니다. 이것은 자극된 세포에 대한 광열 손상을 최소화하는 데 필요합니다.
5. 추가 분석을 위해 필요한 경우 광학 자극의 녹화 된 영화를 전송합니다.

4. 비디오 처리

1. 각 픽셀에 대한 형광 수의 변화를 계산하고 나머지 기준선의 평균 값으로 정규화하는 ImageJ^18에사용할 수 있는 "dF over F"^{매크로(17)를} 사용하여 플루오-4 형광의 변화를 시각화합니다. 추가 처리를 위해 출력(부동 점 형식)을 8비트로 변환합니다.
2. ImageJ에서 사용할 수 있는"이상값 제거"선택적 중앙값 필터를 사용하여 dF/F 동영상을 더 처리합니다. 매개 변수를 정의하여 값이 2픽셀 반경의 중앙값보다 10이상 인 픽셀을 제거하고 해당 픽셀 값을 중앙값으로 바꿉다.
3. Matlab 컴퓨터 비전 툴박스에 구현된 대로 루카스-카나데 알고리즘을 통해 각 프레임의 광학 흐름을 계산합니다. 이 함수의 출력은 각 이미지의 각 지점에서 광학 흐름의 x 및 y 구성 요소를 포함하는 벡터 필드(코드는 보충 파일 1에서사용할 수 있음)이었다.
   참고: 세포 내의 평균 광학 흐름,&θ>, 세포 내칼슘 플럭스의 개발에 해당합니다. 광학 흐름의 차동인 Δ<> 신호가 최대화된 위치를 식별하여 칼슘 신호가 활성화된 시점을 제공합니다. 또한, Δ<&θ>최대 크기의 칼슘 웨이브 전선이 세포를 통과하는 속도와 상관관계가 있습니다.
4. 다음 방정식에 따라 칼슘 전송의 세포 간 속도를 계산합니다.
   v_{Ca^{2 +}} = r_ij / (t_{최대, j} - t _{최대, i} ),
   여기서 t_{최대, j} 및 t _{최대,나는} 각각 세포 J와 i에 대한 활성화의 시간이며, r_ij는 세포의 중심 사이의 거리입니다.

결과

세포 내 사이토솔에 직접 접근할 수 있도록 하는 이 방법론의 능력은 세포로 SiNW의 자발적인 내산화에 달려 있습니다. SiNWs는 많은 세포 유형으로 자발적인 내면화를 겪을 것이지만^15,심근세포 및 뉴런과 같은 일부 세포는 내산화를 허용하기 위해 SiNWs를 치료해야합니다^19. 이 프로토콜에서 우리는 200-300 nm 직경및 심장 MFs로 길이 ~1-3 μmp의 내화 과정을

토론

우리는 여기에서 세포의 세포내 전기 자극을 수행하는 간단한 방법을 시연했습니다. 이 데모에서는 SiNWs와 사전 혼성화된 MF를 사용한 다음 CM과 공동 배양했습니다. 일반적으로, 대부분의 증식 세포는 SiNWs를 내면화하는 경향이 있습니다, 이는 많은 다른 세포 모형을 가진 이 방법론의 사용을 허용합니다. 더욱이, 우리는 세포의 세포 내 자극을 입증하는 동안, 동일한 원리는 세포의 세포 외 자극을...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Glass bottom dishes	Cellvis	D35-10-0-N
3i Marianas Spinning Disk Confocal	3i
Calcein-AM	Invitrogen	C1430
CellMask Orange Plasma membrane Stain	Invitrogen	C10045
Collagen I, rat tail	Gibco	A1048301
Deluxe Diamond Scribing Pen	Ted Pella	54468
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine	Gibco	10313039
DMSO, Anhydrous	Invitrogen	D12345
Falcon Standard Tissue Culture Dishes	Falcon	08-772E
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,	Gibco	10082147
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner	Fisher Scientific	FB11201
Fluo-4, AM, cell permeant	Invitrogen	F14201
FluoroBrite DMEM Media	Gibco	A1896701
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)	OKO
PBS, pH 7.4	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit	Thermo Scientific	88281
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056