Nanofili di silicio e stimolazione ottica per indagini sull'accoppiamento elettrico intra e intercellulare

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'uso di nanofili di silicio per la biomodulazione ottica intracellulare delle cellule in un metodo semplice e facile da eseguire. La tecnica è altamente adattabile a diversi tipi di cellule e può essere utilizzata sia per applicazioni in vitro che in vivo.

Abstract

I miofibroblasti possono interiorizzare spontaneamente i nanofili di silicio (SiNWs), rendendoli un bersaglio attraente per le applicazioni bioelettroniche. Questi ibridi cell-silicon offrono capacità di modulazione ottica senza piombo con una perturbazione minima rispetto al normale comportamento cellulare. Le capacità ottiche sono ottenute dalle proprietà fototermiche e fotoelettriche dei SiNW. Questi ibridi possono essere raccolti utilizzando tecniche standard di coltura tissutale e quindi applicati a diversi scenari biologici. Dimostriamo qui come questi ibridi possono essere usati per studiare l'accoppiamento elettrico delle cellule cardiache e confrontare come i miofibroblasti si accoppiano tra loro o con i cardiomiociti. Questo processo può essere realizzato senza apparecchiature speciali oltre un microscopio fluorescente con linea laser accoppiata. È inoltre mostrato l'uso di una routine MATLAB personalizzata che consente la quantificazione della propagazione del calcio all'interno e tra le diverse cellule nella coltura. I miofibroblasti hanno una risposta elettrica più lenta di quella dei cardiomiociti. Inoltre, la propagazione intercellulare del miofibroblasto mostra velocità leggermente più lente, anche se paragonabili alle loro velocità intracellulari, suggerendo la propagazione passiva attraverso giunzioni gap o nanotubi. Questa tecnica è altamente adattabile e può essere facilmente applicata ad altre arene cellulari, sia per indagini in vitro che in vivo o ex vivo.

Introduzione

Tutti gli organismi biologici usano l'elettricità, sotto forma di ioni, per regolare il comportamento cellulare. Le membrane cellulari contengono vari tipi di canali ionici specifici che consentono il trasporto passivo e attivo degli ioni. Questi ioni governano le funzioni delle cellule eccitabili, come l'attività neuronale e la contrattilità muscolare scheletrica e cardiaca. Tuttavia, la bioelettricità svolge anche un ruolo importante nelle cellule non eccitabili, governando molte funzioni cellulari come la proliferazione^{cellulare 1,}la neuroimmunità^2,3,4e la differenziazione delle cellule staminali⁵.

Negli ultimi decenni, il campo della bioelettricità ha attirato un crescente livello di interesse, che ha contribuito allo sviluppo di numerose tecnologie per le interfacce bioelettroniche. Le pipette patch microelettrode sono il gold standard della registrazione intracellulare e della^{stimolazione 6}. In questa metodologia, una pipetta di vetro viene tirata in condizioni specifiche per formare un bordo affilato con una dimensione dei pori di pochi micron. Questa pipetta viene riempita con un tampone e la pipetta consente il contatto diretto del buffer con il volume intracellulare. Ciò si traduce in un'interfaccia bioelettrica che produce rapporti segnale/rumore estremamente elevati, un controllo preciso sull'attività elettrica cellulare e una risoluzione temporale estremamente elevata. Sebbene questa metodologia sia uno strumento estremamente potente, che è stato recentemente ridimensionato in una configurazione nano-pipetta⁷, è associato a diverse importanti limitazioni tecniche. L'effetto di diluizione del citosolo 8 , così come le vibrazioni meccaniche, limita la sua utilità agli interrogatori a breve termine e richiede costose^attrezzaturespecializzate e un alto livello di abilità tecnica. Inoltre, la sua ingombrantità limita il numero di cellule che possono essere registrate o stimolate contemporaneamente e, a causa della sua invasività, non può essere riconfigurata durante un esperimento. Per superare questi limiti, sono stati sviluppati array di microelettrodi, ma la dimensione degli elettrodi limita la risoluzione spaziale e l'accesso intracellulare. Gli array di nanoelettrodi consentono la registrazione e la stimolazione intracellulare, ma richiedono l'elettroporazione abrasiva per accedere al citosol^9,10. Inoltre, tutte queste metodologie sono legate al substrato e sono quindi limitate a colture cellulari in vitro, o a cellule superficiali esterne, senza accesso a cellule che si trovano all'interno di un tessuto tridimensionale (3D).

L'optogenetica¹¹ è ampiamente utilizzata per affrontare queste limitazioni 3D e in vivo. Tuttavia, i metodi optogenetici si basano sulle perturbazioni dei canali ionici a membrana plasmatica attivati dalla luce che sono distribuiti alla membrana plasmatica, limitando la risoluzione spaziale^{3D 12} e le capacità intracellulari.

Recentemente abbiamo dimostrato che i nanofili di silicio (SiNW) possono essere utilizzati per eseguire interrogatori bioelettrici intracellulari con risoluzione spaziale submicrona con diverse cellule non eccitabili, vale a dire miofibroblasti cardiaci e oligodendrociti¹³. Inoltre, abbiamo utilizzato questi SiNW per eseguire un interrogatorio specifico per cellule ex-vivo all'interno di un tessuto cardiaco 3D, per indagare come le cellule cardiache si accoppiano elettricamente in vivo¹⁴. Uno dei principali vantaggi di questa metodologia è la sua semplicità; non richiede alcuna modificazione genetica o strumentazione ingombrante. Molte cellule interiorizzeranno spontaneamente i SiNW foto-reattivi senza bisogno di sonicazione o elettroporazione¹⁵. Inoltre, sfuggiranno spontaneamente all'incapsulamento endosomico e formeranno una perfetta integrazione con il citosol e gli organelli intracellulari^13,15. Questi compositi cell-SiNWs, definiti ibridi cell-silicon, possiedono la natura dinamica, morbida e versatile della cella originale, così come le capacità optoelettriche dei SiNW. Dopo l'ibridazione, l'ibrido cellula-SiNW può essere raccolto utilizzando tecniche standard di coltura tissutale e utilizzato per varie applicazioni come la stimolazione bioelettrica intracellulare; studiare l'accoppiamento bioelettrico intercellulare in vitro; e per l'interrogatorio specifico della cellula in vivo. Poiché una stimolazione efficace richiede la co-localizzazione di densità di potenza ottiche elevate e SiNW, si può ottenere un'alta risoluzione spaziale sia in 2D che in 3D. In questo protocollo descriviamo in dettaglio la metodologia, così come come i risultati possono essere analizzati. L'attenzione è rivolta all'indagine intra- e intercellulare in vitro, ma l'implementazione in vivo di questa metodologia può essere utilizzata direttamente per molti altri scenari biologici.

Protocollo

Per garantire il rispetto degli standard etici, tutte le procedure animali relative all'isolamento dei cardiomiociti dai cuori dei roditori sono state approvate per la prima volta dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Chicago. Inoltre, tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in completa conformità con le indicazioni dell'Università di Chicago IACUC.

1. Preparazione di ibridi cell-SiNWs

1. Isolare i cardiomiociti primari (MIC) utilizzando un kit commerciale seguendo le linee guida del produttore.
2. Preparare dmem completo per l'isolamento delle cellule primarie integrato con il 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore, l'1% di penicillina-streptomicina e l'1% di L-glutammina.
3. Per isolare il miofibroblasto (IF) dalla sospensione MFs-CMs, pre-placcare le cellule isolate su un piatto di coltura tissutale (cellule isolate da 2 cuori dal passo 1.1. per piatto da 100 mm) per 1 h. Poiché le macchine virtuali necessitano di una fibronectina o di una superficie trattata con collagene per aderire, solo le IF si attaccheranno alla superficie di coltura tissutale.
4. Aspirare la sospensione cellulare delle macchine virtuali arricchite. Queste macchine virtuali possono essere utilizzate per esperimenti di accoppiamento eterocellulare come descritto nella sezione 3. Risciacquare i file MFs con DMEM per eliminare eventuali macchine virtuali rimanenti dal piatto delle IF.
5. Aggiungi un mezzo di coltura fresco alle IF e consenti loro di proliferare fino a quando non sono ~80% confluenti (2-4 giorni). Cambia il mezzo a giorni nostri.
6. Quando le celle sono pronte (80% confluenti), preparare i SiNW per il passaggio di ibridazione riportato di seguito (passaggio 1.7).
   NOTA: molti tipi di SiNW possono essere utilizzati per questo. In questo esperimento, i SiNW coltivati mediante deposizione chimica di vapore (CVD) con una configurazione di giunzione p-i-n del guscio centrale sono stati utilizzati come descritto^{in precedenza 16}. Durante la crescita del CVD, i SiNW vengono coltivati su un substrato di wafer di silicio e vengono infine conservati come chip di silicio coperti da SiNW.
7. Tagliare un chip da 3 mm x 3 mm da un wafer con SiNW coltivati in CVD utilizzando uno scriba di diamanti. Utilizzare forcep affilati per gestire il wafer e ridurre al minimo l'area di superficie toccata con le forcep, in quanto ciò potrebbe rompere i SiNW.
8. Sterilizzare il truciolo risciacquarlo con il 70% di etanolo e lasciare asciugare l'etanolo per 30 minuti sotto la luce UV in una cappa a flusso laminare biosicurezza.
9. Trasferire il chip in un tubo di microcentrifugo sterile e risciacquare l'etanolo in eccesso utilizzando mezzi di coltura completi.
10. Aggiungere 1 mL di mezzi di coltura e sonicare il chip in bagno di sonicazione per 1-10 minuti. I supporti dovrebbero diventare nuvolosi man mano che i SiNW vengono rilasciati nei supporti.
    NOTA: il tempo e la potenza di sonicazione dovrebbero essere ottimizzati per diversi sonicatori o celle diverse, poiché durate più brevi e potenze inferiori produrranno SiNW più lunghi.
11. Aggiungere la sospensione SiNWs in 5 mL di mezzi di coltura e seminarla sul piatto di coltura tissutale da 100 mm con MFs. Consentire ai SiNW di internalizzare per 4 ore e risciacquare i SiNW in eccesso da 5x con i supporti. Consentire ai SiNW parzialmente internalizzati di completare l'internalizzazione consentendo loro di sedersi per altre 1 h prima dell'uso.
    NOTA: diversi tipi di cellule potrebbero aver bisogno di diversi tempi di concentrazione e/o internalizzazione dei SiNW.
12. Preparare la soluzione di rivestimento del collagene diluire la soluzione di stock di collagene (3 mg/mL) con acido acetico sterile da 20 mM con un rapporto di 1:50. Aggiungere una soluzione di rivestimento da 0,5 mL a un piatto inferiore in vetro da 35 mm e lasciare riposare per 1 h in 37 °C. Rimuovere la soluzione e sciacquare la piastra con PBS sterile.
13. Raccogliere gli ibridi cellule-SiNWs trattando le cellule con 3 mL di tripside per 2 minuti a 37 °C. Aggiungere 10 mL di mezzi di coltura e risciacquare vigorosamente gli ibridi pipettando. Centrifugare delicatamente le cellule a 200 x g per 5 minuti per evitare di danneggiare le cellule con i SiNW internalizzati. Rimuovere i mezzi in eccesso, sospendere le cellule con mezzi da 1 mL e seminarle sul piatto inferiore in vetro trattato con collagene.
    NOTA: Gli ibridi possono essere seminati da soli, per indagare l'accoppiamento intracellulare o intercellulare o con LE per indagare l'accoppiamento eterocellulare in vitro.
14. Eseguire una verifica finale dell'internalizzazione del SiNW etichettando il citosol delle cellule (calceina-AM, 4 μM) e la membrana (marcatore di membrana, 2 μM) per 30 minuti a 37 °C e utilizzando la microscopia confocale. Poiché i SiNW sono altamente riflettenti, la luce riflessa può essere utilizzata al posto della fluorescenza per visualizzarli.

2. Preparazione di cellule per indagini intra e intercellulari

1. Preparare la soluzione di rivestimento del collagene come in 1.12
2. Per la stimolazione elettrica intracellulare, gli ibridi di coltura con basse densità di semina. Utilizzare un emocitometro standard per contare le cellule della sezione 1.11. e semina 50.000 cellule su un piatto inferiore in vetro da 35 mm nei mezzi di coltura. Per le indagini intercellulari, utilizzare densità cellulari più elevate (500.000 cellule per piatto). Per l'accoppiamento intercellulare tra macchine virtuali eMF, co-coltura degli ibridi con MACCHINE appena isolate.
3. Consentire alle cellule di attaccarsi durante la notte prima di eseguire esperimenti di stimolazione ottica. Per le indagini intercellulari, consentire a 48 ore a 37 °C che le cellule esprima le giunzioni intercellulari gap prima che l'esperimento sia condotto.
4. Preparare la soluzione di stock di coloranti sensibili al calcio (può essere conservata in -20 °C) aggiungendo 50 μL di DMSO a 50 μg Fluo-4 AM. Preparare la soluzione di colorazione diluendo 1 μL di colorante in 1 mL di DMEM.
5. Aspirare il mezzo di coltura dalle cellule e aggiungere 1 mL di soluzione di colorazione. Lasciare che il colorante si interiorizzi nelle cellule per 20-30 minuti a 37 °C. Aspirare il colorante e risciacquare due volte con PBS sterile.
6. Infine, aggiungere 1 mL di DMEM Media senza fenolo-rosso prerifapidto e lasciare che il Fluo-4 intracellulare subisca la deesterificazione per 30 minuti in 37 °C.
7. Trasferire le cellule al microscopio per l'imaging e la stimolazione.

3. Imaging ottico e stimolazione

1. Preririorre un microincubatore umidificato a 37 °C e una miscela aria bolla-CO₂ (95:5).
2. Utilizzare un microscopio con una linea laser collimata accoppiata nel percorso della luce per l'imaging del calcio e la stimolazione ottica.
   NOTA: Un microscopio confocale a scansione è l'opzione più semplice grazie alle sue capacità di stimolazione puntiforme. Tuttavia, questa procedura può essere eseguita utilizzando qualsiasi microscopio a florescence standard accoppiando un raggio laser collimato nello spazio infinito del percorso della luce usando uno splitter a fascio. Qualsiasi obiettivo del microscopio è progettato in modo che un laser collimato passato attraverso di esso si concentri su un punto laser limitato di diffrazione sul piano focale. La lunghezza d'onda del laser dovrebbe essere vicina alla luce di eccitazione, quindi sarà riflessa dallo specchio dicroico e passata dal filtro di eccitazione.
3. Visualizza i SiNW e determina il sito di stimolazione utilizzando la microscopia a campo luminoso, la luce trasmessa o la luce riflettente. Quindi, riconfigurare il percorso della luce in modalità fluorescenza, mantenendo il punto di stimolazione nella posizione predefinita del SiNW.
4. Convalidare la potenza di stimolazione ottimale e la lunghezza dell'impulso per ogni dimensione e tipo di cella SiNW, per ridurre al minimo i danni fototermici alle cellule stimolate. Per un tipico protocollo di stimolazione, eseguire una registrazione di base di 2-10 s dell'attività del calcio intracellulare. Quindi, applicare un singolo impulso laser di potenza di 1-10 mW e durata di 1-10 ms (corrispondente a 30-300 kW / mm²) per stimolare il SiNW e registrare l'onda di calcio risultante per altri 2-10 s.
   NOTA: È essenziale ottimizzare la potenza ottica e la lunghezza dell'impulso per ogni dimensione e celle SiNW. Questo è necessario per ridurre al minimo i danni fototermici alle cellule stimolate.
5. Trasferire i filmati registrati della stimolazione ottica, se necessario, per ulteriori analisi.

4. Elaborazione video

1. Visualizzare le modifiche nella fluorescenza Fluo-4 utilizzando la macro "dF over F"¹⁷ disponibile per ImageJ¹⁸, che calcola la variazione del numero di fluorescenza per ogni pixel e si normalizza in base al valore medio della linea di base di riposo. Convertire l'output (formato a virgola mobile) in 8 bit per un'ulteriore elaborazione.
2. Elaborare ulteriormente il filmato dF/F utilizzando il filtromediano selettivo " Remove outliers" disponibile in ImageJ. Definire i parametri per rimuovere i pixel in cui il loro valore è superiore a 10 al valore mediano in un raggio di 2 pixel e sostituire tale valore in pixel con la mediana.
3. Calcola il flusso ottico in ogni fotogramma tramite l'algoritmo Lucas-Kanade, come implementato nella cassetta degli attrezzi Matlab Computer Vision. L'output di questa funzione era un campo vettoriale contenente i componenti x e y del flusso ottico in ogni punto di ogni immagine (il codice è disponibile nel file complementare 1).
   NOTA: Il flusso ottico medio all'interno di una cellula, <ν>, corrisponde allo sviluppo del flusso di calcio all'interno di una cellula. Il differenziale del flusso ottico, Δ<ν> fornisce il momento in cui è stata attivata la segnalazione del calcio, identificando dove il segnale è stato massimizzato. Inoltre, la magnitudine di Δ<ν> al suo massimo è correlata alla velocità con cui il fronte dell'onda di calcio progredisce attraverso la cellula.
4. Calcola la velocità intercellulare della trasmissione del calcio secondo la seguente equazione.
   v_Ca²⁺ = r_ij / ( t_max,j − t_max,i ),
   dove t_max,j e t_{max,i sono i} tempi di attivazione per le cellule j e i, rispettivamente, e r _ij è la distanza tra i centroidi delle cellule.

Risultati

La capacità di questa metodologia di consentire l'accesso diretto al citosolo intracellulare dipende dall'internalizzazione spontanea del SiNW nelle cellule. Sebbene i SiNW subiranno l'internalizzazione spontanea in^{molti tipi di cellule 15}, alcune cellule, come cardiomiociti e neuroni, avranno bisogno che i SiNW siano trattati per consentire la loro internalizzazione¹⁹. In questo protocollo descriviamo il processo di internalizzazione dei SiNW p-i-n con un diametro di 200-...

Discussione

Abbiamo dimostrato qui un modo semplice per eseguire la stimolazione elettrica intracellulare delle cellule. In questa dimostrazione sono stati utilizzati file MF preibridizzati con SiNW, quindi co-coltivati con le macchine virtuali. In generale, la maggior parte delle cellule prolifere ha la tendenza a internalizzare i SiNW, il che consente l'uso di questa metodologia con molti altri tipi di cellule. Inoltre, mentre abbiamo dimostrato la stimolazione intracellulare delle cellule, gli stessi principi possono essere utili...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Glass bottom dishes	Cellvis	D35-10-0-N
3i Marianas Spinning Disk Confocal	3i
Calcein-AM	Invitrogen	C1430
CellMask Orange Plasma membrane Stain	Invitrogen	C10045
Collagen I, rat tail	Gibco	A1048301
Deluxe Diamond Scribing Pen	Ted Pella	54468
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine	Gibco	10313039
DMSO, Anhydrous	Invitrogen	D12345
Falcon Standard Tissue Culture Dishes	Falcon	08-772E
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,	Gibco	10082147
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner	Fisher Scientific	FB11201
Fluo-4, AM, cell permeant	Invitrogen	F14201
FluoroBrite DMEM Media	Gibco	A1896701
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)	OKO
PBS, pH 7.4	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit	Thermo Scientific	88281
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056