Кремниевые нанопроводы и оптическая стимуляция для исследований внутриклеточного и межклеточного электрического соединения

Резюме

Этот протокол описывает использование кремниевых нанопроводов для внутриклеточной оптической биомодулации клетки простым и простым в работе методом. Техника очень адаптируется к различным типам клеток и может быть использована для in vitro, а также in vivo приложений.

Аннотация

Миофибробласты могут спонтанно интернализировать кремниевые нанопроводы (SiNWs), что делает их привлекательной мишенью для биоэлектронного применения. Эти клеточные кремниевые гибриды предлагают бесхитные оптические возможности модуляции с минимальным возмущением к нормальному поведению клеток. Оптические возможности получены по фототермальным и фотоэлектрическим свойствам SiNWs. Эти гибриды могут быть собраны с использованием стандартных методов культуры тканей, а затем применяются к различным биологическим сценариям. Мы демонстрируем здесь, как эти гибриды могут быть использованы для изучения электрической связи сердечных клеток и сравнить, как миофибробласты пара друг с другом или кардиомиоцитов. Этот процесс может быть выполнен без специального оборудования за флуоресцентный микроскоп с соединенной лазерной линии. Также показано использование специально построенной matLAB рутины, которая позволяет количественное распространение кальция внутри и между различными клетками в культуре. Миофибробласты, как показано, имеют более медленный электрический ответ, чем у кардиомиоцитов. Кроме того, межклеточное размножение миофиброласта показывает несколько более медленные, хотя и сопоставимые скорости с их внутриклеточными скоростями, что предполагает пассивное распространение через разрывные соединения или нанотрубки. Этот метод очень адаптируется и может быть легко применен к другим клеточным аренам, для in vitro, а также in vivo или ex vivo исследований.

Введение

Все биологические организмы используют электричество в виде ионов для регулирования клеточного поведения. Клеточные мембраны содержат различные типы специфических ионных каналов, позволяющих пассивно и активно транспортировать ионы. Эти ионы регулируют функции возбудимых клеток, таких как нейронная активность и скелетная и сердечная соток. Тем не менее, биоэлектричность также играет важную роль в невозбудимых клетках, регулирующих многие клеточные функции,^{такие как пролиферацией клеток 1,нейроиммунностью 2,3,4}и дифференциацией стволовых^{клеток 5.}

В последние десятилетия область биоэлектричества привлекла все более высокий уровень интереса, что способствовало развитию многочисленных технологий биоэлектронных интерфейсов. Microelectrode патч пипетки являются золотым стандартом внутриклеточной записи и стимуляции⁶. В этой методологии, стеклянная пипетка вытащил при определенных условиях, чтобы сформировать острый край с поры размером несколько микрон. Эта пипетка заполнена буфером, а пипетка позволяет напрямую контактировать буфера с внутриклеточным объемом. Это приводит к биоэлектрический интерфейс, который дает чрезвычайно высокий сигнал к шуму отношения, точный контроль над клеточной электрической активности, и чрезвычайно высокое временное разрешение. Хотя эта методология является чрезвычайно мощным инструментом, который недавно был сокращен до нано-пипетки^{конфигурации 7}, это связано с несколькими важными техническими ограничениями. Эффект разбавления^{цитозолом 8,}а также механические вибрации, ограничивает его полезность краткосрочными допросами, и требует дорогостоящего специализированного оборудования и высокого уровня технических навыков. Кроме того, его громоздкость ограничивает количество клеток, которые могут быть записаны или стимулированы одновременно, и из-за его инвазивности, он не может быть перенастроен на протяжении всего эксперимента. Для преодоления этих ограничений были разработаны массивы микроэлектродов, но размер электродов ограничивает пространственное разрешение, а также внутриклеточный доступ. Nanoelectrode массивы позволяют внутриклеточной записи и стимуляции, но требуют абразивного электропорации для доступа к^{цитозолу 9,10}. Кроме того, все эти методологии связаны субстратами и, таким образом, ограничиваются культурами клеток в пробирке или внешними поверхностными клетками, не имеют доступа к клеткам, которые находятся внутри трехмерной (3D) ткани.

Optogenetics¹¹ широко используется для решения этих 3D и in vivo ограничений. Однако оптогенетические методы основаны на возмущениях светоактивных плазменных мембранных ионных каналов, которые распространяются на плазменной мембране, ограничивая 3D^{пространственное разрешение 12 и} внутриклеточные возможности.

Недавно мы показали, что кремниевые нанопроводы (SiNWs) могут быть использованы для выполнения внутриклеточного биоэлектрического допроса с субмикроном пространственного разрешения с различными невозбудимыми клетками, а именно сердечными миофибробластами и олигодендроцитами¹³. Кроме того, мы использовали эти SiNWs для выполнения экс-vivo клеток конкретных допроса в 3D сердечной ткани, чтобы исследовать, как сердечные клетки электрически пара in vivo¹⁴. Основным преимуществом этой методологии является ее простота; он не требует каких-либо генетических изменений или громоздких приборов. Многие клетки спонтанно интернализировать фото-реакции SiNWs без необходимости звуковой или электропорации¹⁵. Кроме того, они спонтанно избежит эндосомной инкапсуляции и образуют бесшовную интеграцию с цитозолом и внутриклеточными^{органеллами 13,15.} Эти клеточные-SiNWs композиты, называются клеточно-силиконовыми гибридами, обладают динамичным, мягким и универсальным характером оригинальной клетки, а также оптометическими возможностями SiNWs. После гибридизации гибрид cell-SiNW может быть собран с использованием стандартных методов культуры тканей и использован для различных применений, таких как внутриклеточная биоэлектрическая стимуляция; изучение межклеточной биоэлектрической связи в пробирке; и для in vivo ячейки конкретных допросов. Поскольку эффективная стимуляция требует совместной локализации высокой плотности оптической мощности и SiNWs, можно достичь высокого пространственного разрешения как в 2D, так и в 3D. В этом протоколе мы подробно описываем методологию, а также то, как можно анализировать результаты. Основное внимание уделяется внутриклеточному и межклеточному исследованию in vitro, однако внедрение этой методологии может быть непосредственно использовано для многих других биологических сценариев.

протокол

Для обеспечения соблюдения этических стандартов все процедуры для животных, связанные с изоляцией кардиомиоцитов от сердца грызунов, были впервые одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Чикагского университета (IACUC). Кроме того, все эксперименты на животных были проведены в полном соответствии с руководством Чикагского университета IACUC.

1. Подготовка гибридов cell-SiNWs

1. Изолировать первичные кардиомиоциты (СМ) с помощью коммерческого комплекта в соответствии с руководящими принципами производителя.
2. Подготовка полного DMEM для первичной изоляции клеток дополняется 10% тепла инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода, 1% пенициллин-стрептомицин, и 1% L-глутамин.
3. Чтобы изолировать миофибробласт (MFs) от подвески MFs-CMs, предварительно пластины изолированных клеток на ткани культуры блюдо (клетки изолированы от 2 сердца от шага 1,1. на 100 мм блюдо) на 1 ч. По мере того как CMs нужно fibronectin или поверхность обработанной коллагена для того чтобы придерживаться, только MFs прикрепят к поверхности культуры ткани.
4. Аспирировать обогащенную подвеску клеток CMs. Эти CMs могут быть использованы для гетеро-клеточных экспериментов связи, как описано в разделе 3. Промыть MFs с DMEM для устранения любых оставшихся CMs из MFs блюдо.
5. Добавьте свежую культурную среду в MFs и позвольте им размножаться до тех пор, пока они не будут 80% стечены (2-4 дня). Изменение среды через день.
6. Когда клетки будут готовы (80% слияние), подготовить SiNWs для гибридизации шаг ниже (шаг 1.7).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Многие типы SiNWs могут быть использованы для этого. В этом эксперименте, SiNWs, которые были выращены путем химического осаждения пара (CVD) с основной оболочки p-i-n конфигурации соединения были использованы, как описано^{ранее 16}. Во время роста CVD, SiNWs выращиваются на кремниевой пластины субстрата, и в конечном итоге хранятся в качестве кремниевых чипов, покрытых SiNWs.
7. Вырезать 3 мм х 3 мм чип из пластины с CVD выросли SiNWs с помощью алмазного писца. Используйте острые типсы для обработки пластины и свести к минимуму площадь поверхности, которая коснулась с типсами, так как это может сломать SiNWs.
8. Стерилизовать чип путем полоскания его с 70% этанола и позволяет этанола высохнуть в течение 30 минут под ультрафиолетовым светом в биобезопасности ламинарного потока капот.
9. Перенесите чип в стерильную микроцентрифуговую трубку и промойте излишки этанола с помощью полных культурных средств массовой информации.
10. Добавьте 1 мл культурных средств массовой информации и sonicate чип в sonication ванну в течение 1-10 мин. Средства массовой информации должны стать облачно, как SiNWs выпущены в средствах массовой информации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время и мощность Sonication должны быть оптимизированы для различных звуковых или различных клеток, так как более короткие продолжительности и более низкие мощности будут приносить больше SiNWs.
11. Добавить подвеску SiNWs в 5 мл культурных средств массовой информации и семян его на 100 мм ткани культуры блюдо с MFs. Разрешить SiNWs интернализировать в течение 4 ч и промыть избыток SiNWs от 5x со средствами массовой информации. Разрешить частично интернализированных SiNWs для завершения интернализации, позволяя им сидеть еще 1 ч перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные типы клеток могут нуждаться в различных концентрациях SiNWs и/или времени интернализации.
12. Подготовка раствора коллагенового покрытия путем разбавления раствора коллагенового бульона (3 мг/мл) стерильной уксусной кислотой 20 мМ при соотношении 1:50. Добавьте раствор покрытия 0,5 мл в стеклянное дно 35 мм и дайте ему посидеть 1 ч при 37 градусах Цельсия. Снимите раствор и промойте блюдо стерильным PBS.
13. Урожай клеточно-SiNWs гибридов путем лечения клеток с 3 мл трипсина в течение 2 мин при 37 градусов по Цельсию. Добавьте 10 мл культурных средств массовой информации и энергично промойте гибриды трубами. Центрифуга клетки мягко на 200 х г в течение 5 минут, чтобы избежать повреждения клеток с интернализированными SiNWs. Удалите излишки мультимедиа, приостановите клетки с 1 мл мультимедиа и посеять их на коллаген обработанные стеклянные нижней блюдо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гибриды могут быть посеяны в одиночку, для исследования внутриклеточных или межклеточных связи или с CMs для расследования гетеро-клеточных связи в пробирке.
14. Выполните окончательную проверку интернализации SiNW путем маркировки цитозола клеток (calcein-AM, 4 МКМ) и мембраны (мембранный маркер, 2 МКМ) в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия и визуализации клетки с помощью конфокальные микроскопии. Поскольку SiNWs являются высоко отражающими, отраженный свет может быть использован вместо флуоресценции, чтобы визуализировать их.

2. Подготовка клеток к внутриклеточным и межклеточным исследованиям

1. Подготовка раствора коллагенового покрытия, как в 1.12
2. Для внутриклеточной электрической стимуляции, гибриды культуры с низкой плотностью посева. Используйте стандартный гемоцитометр для подсчета ячеек из раздела 1.11. и семена 50000 клеток на 35 мм стеклянное дно блюдо в культуре средств массовой информации. Для межклеточных исследований используйте более высокую плотность клеток (500 000 клеток на блюдо). Для межклеточной связи между CMs и MFs, совместно культуры гибридов со свежеисцеленными CMs.
3. Разрешить клеткам прикрепляться на ночь перед выполнением экспериментов оптической стимуляции. Для межклеточных исследований, позволяют 48 ч при 37 градусов по Цельсию для клеток, чтобы выразить межклеточный разрыв соединений до проведения эксперимента.
4. Подготовка кальция чувствительный раствор красителя (может храниться в -20 градусов по Цельсию), добавив 50 МКЛ DMSO до 50 мкг Fluo-4 AM. Приготовьте окрашивающий раствор, разбавляя 1 мл красителя в 1 мл DMEM.
5. Аспирировать культурную среду из клеток и добавить 1 мл окрашивания раствора. Разрешить краситель интернализировать в клетки в течение 20-30 мин при 37 градусов по Цельсию. Аспирировать краситель и промыть дважды стерильным PBS.
6. Наконец, добавьте 1 мл предварительно разогретого фенол-красного свободного DMEM Media и позвольте внутриклеточному флуо-4 пройти деэстерификацию в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия.
7. Передача клеток в микроскоп для визуализации и стимуляции.

3. Оптическая визуализация и стимуляция

1. Предварительно разогреть увлажненные микроинцубаторы до 37 градусов по Цельсию и пузырь воздуха-CO₂ смеси (95:5).
2. Используйте микроскоп с коллимированной лазерной линией, соединенной в световой путь для визуализации кальция и оптической стимуляции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сканирование конфокального микроскопа является наиболее простым вариантом из-за его возможности стимуляции точки. Тем не менее, эта процедура может быть сделано с помощью любого стандартного флуоресцентного микроскопа путем соединения коллимированного лазерного луча в бесконечность пространства светового пути с помощью пучка сплиттера. Любая цель микроскопа разработана таким образом, что коллимированный лазер, пройаваемый через него, будет направлен на дифракционное ограниченное лазерное пятно на фокусной плоскости. Длина волны лазера должна быть близка к возбуждающей свету, поэтому она будет отражена дихроическим зеркалом и пройдена фильтром возбуждения.
3. Визуализуйте SiNWs и определите место стимуляции с помощью микроскопии яркого поля, передаваемого света или светоотражающего света. Затем перенастройка пути света в режим флуоресценции, сохраняя при этом точку стимуляции в заранее определенном месте SiNW.
4. Проверка оптимальной мощности стимуляции и длины импульса для каждого размера SiNW и типа клеток, чтобы свести к минимуму фототермальное повреждение стимулируемых клеток. Для типичного протокола стимуляции выполните 2-10 с базовой записи внутриклеточной активности кальция. Затем нанесите один лазерный импульс мощностью 1-10 мВт и продолжительностью 1-10 мс (соответствующий 30-300 кВт/мм^2),чтобы стимулировать SiNW, и записывают полученную волну кальция еще на 2-10 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно оптимизировать оптическую мощность и длину импульса для каждого размера SiNW и клеток. Это необходимо, чтобы свести к минимуму фототермальное повреждение стимулируемых клеток.
5. Передача записанных фильмов оптической стимуляции, при необходимости, для дальнейшего анализа.

4. Обработка видео

1. Визуализуйте изменения флуо-4 флуоресценции с помощью^{макроса 17} dF over F, доступного для ImageJ^18,который вычисляет изменение флуоресценции для каждого пикселя и нормализуется средним значением базового уровня покоя. Преобразование вывода (формат плавающей точки) в 8 бит для дальнейшей обработки.
2. Обработать фильм dF/F с помощьюселективного медианного фильтра, доступного в ImageJ. Определите параметры для удаления пикселей, где их значение более чем на 10 выше медианного значения в радиусе 2 пикселей, и замените это значение пикселя медианой.
3. Рассчитайте оптический поток в каждом кадре с помощью алгоритма Лукаса-Канада, реализованного в арсенале инструментов Matlab Computer Vision. Выходом этой функции было векторное поле, содержащее x- и y-компоненты оптического потока в каждой точке каждого изображения (код доступен в дополнительном файле 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Средний оптический поток внутри клетки, lt;'gt;, соответствует развитию потока кальция внутри клетки. Дифференциал оптического потока, «Lt;»gt; обеспечивает точку времени, в которой была активирована сигнализация кальция, путем определения того, где сигнал был максимизироват. Кроме того, величина йлт; на самом максимуме коррелирует со скоростью, с которой фронт волны кальция прогрессирует через клетку.
4. Рассчитайте межклеточную скорость передачи кальция в соответствии со следующим уравнением.
   v_{Ca^{2 "r} ij} / ( t_max,j t_max,i ),
   где t_max,j и t_{max, i} - это время активации ячеек j и i, соответственно, и r_ij - это расстояние между центроидами клеток.

Результаты

Способность этой методологии обеспечить прямой доступ к внутриклеточному цитозолу зависит от спонтанной интернализации SiNW в клетки. Хотя SiNWs будет проходить спонтанную интернализации во^{многих типах клеток 15}, некоторые клетки, такие как кардиомиоциты и нейроны, потребует...

Обсуждение

Мы продемонстрировали здесь простой способ выполнения внутриклеточной электрической стимуляции клеток. В этой демонстрации, мы использовали MFs, которые были prehybridized с SiNWs, а затем совместно с CMs. В целом, большинство размножающихся клеток имеют тенденцию к интернализации SiNWs, что позвол?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Glass bottom dishes	Cellvis	D35-10-0-N
3i Marianas Spinning Disk Confocal	3i
Calcein-AM	Invitrogen	C1430
CellMask Orange Plasma membrane Stain	Invitrogen	C10045
Collagen I, rat tail	Gibco	A1048301
Deluxe Diamond Scribing Pen	Ted Pella	54468
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine	Gibco	10313039
DMSO, Anhydrous	Invitrogen	D12345
Falcon Standard Tissue Culture Dishes	Falcon	08-772E
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,	Gibco	10082147
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner	Fisher Scientific	FB11201
Fluo-4, AM, cell permeant	Invitrogen	F14201
FluoroBrite DMEM Media	Gibco	A1896701
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)	OKO
PBS, pH 7.4	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit	Thermo Scientific	88281
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056