Nanofils de silicium et stimulation optique pour les études de couplage électrique intra- et intercellulaire

Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation de nanofils de silicium pour la biomodulation optique intracellulaire des cellules dans une méthode simple et facile à exécuter. La technique est très adaptable à divers types de cellules et peut être utilisée pour des applications in vitro ainsi que in vivo.

Résumé

Les myofibroblastes peuvent intérioriser spontanément les nanofils de silicium (SiNWs), ce qui en fait une cible attrayante pour les applications bioélectroniques. Ces hybrides cellule-silicium offrent des capacités de modulation optique sans plomb avec une perturbation minimale du comportement cellulaire normal. Les capacités optiques sont obtenues par les propriétés photothermales et photoélectriques des SiNWs. Ces hybrides peuvent être récoltés à l’aide de techniques standard de culture tissulaire, puis appliqués à différents scénarios biologiques. Nous démontrons ici comment ces hybrides peuvent être utilisés pour étudier le couplage électrique des cellules cardiaques et comparer la façon dont les myofibroblastes se couplent les uns aux autres ou aux cardiomyocytes. Ce processus peut être accompli sans équipement spécial au-delà d’un microscope fluorescent avec ligne laser couplée. L’utilisation d’une routine MATLAB sur mesure qui permet la quantification de la propagation du calcium à l’intérieur et entre les différentes cellules de la culture est également démontrée. Les myofibroblastes ont une réponse électrique plus lente que celle des cardiomyocytes. En outre, la propagation intercellulaire myofibroblaste montre des vitesses légèrement plus lentes, bien que comparables à leurs vitesses intracellulaires, suggérant la propagation passive par des jonctions d’écart ou des nanotubes. Cette technique est très adaptable et peut être facilement appliquée à d’autres arènes cellulaires, pour les investigations in vitro ainsi que in vivo ou ex vivo.

Introduction

Tous les organismes biologiques utilisent l’électricité, sous forme d’ions, pour réguler le comportement cellulaire. Les membranes cellulaires contiennent divers types de canaux iions spécifiques permettant le transport passif et actif des ions. Ces ions régissent les fonctions des cellules excitables, telles que l’activité neuronale et la contractilité des muscles squelettiques et cardiaques. Cependant, la bioélectricité joue également un rôle important dans les cellules non excitables, régissant de nombreuses fonctions cellulaires telles que la prolifération^{cellulaire 1,}la neuroimmunité^2,3,4, et la différenciation des cellules souches⁵.

Au cours des dernières décennies, le domaine de la bioélectricité a suscité un intérêt croissant, ce qui a contribué au développement de nombreuses technologies pour les interfaces bioélectroniques. Pipettes patch microélecrode sont l’étalon-or de l’enregistrement intracellulaire et la stimulation⁶. Dans cette méthodologie, une pipette en verre est tirée dans des conditions spécifiques pour former un bord tranchant avec une taille de pore de quelques microns. Cette pipette est remplie d’un tampon et la pipette permet le contact direct du tampon avec le volume intracellulaire. Il en résulte une interface bioélectrique qui donne des rapports signal/bruit extrêmement élevés, un contrôle précis de l’activité électrique cellulaire et une résolution temporelle extrêmement élevée. Bien que cette méthodologie soit un outil extrêmement puissant, qui a récemment été mis à l’échelle à une configuration nano-pipette⁷, il est associé à plusieurs limitations techniques importantes. L’effet de dilution cytosol⁸, ainsi que les vibrations mécaniques, limite son utilité aux interrogatoires à court terme, et il nécessite un équipement spécialisé coûteux et un haut niveau de compétence technique. En outre, son encombrante limite le nombre de cellules qui peuvent être enregistrées ou stimulées simultanément, et en raison de son invasivité, il ne peut pas être reconfiguré tout au long d’une expérience. Pour surmonter ces limitations, des réseaux de microélecrodes ont été développés, mais la taille des électrodes limite la résolution spatiale ainsi que l’accès intracellulaire. Les tableaux nanoélecrodes permettent l’enregistrement et la stimulation intracellulaires mais nécessitent une électroporation abrasive pour accéder au cytosol^9,10. En outre, toutes ces méthodologies sont liées au substrat et sont donc limitées aux cultures cellulaires in vitro, ou aux cellules superficielles externes, sans accès aux cellules qui se trouvent à l’intérieur d’un tissu tridimensionnel (3D).

Optogenetics^{11 est} largement utilisé pour répondre à ces limitations 3D et in vivo. Cependant, les méthodes optogénétiques sont basées sur les perturbations des canaux iion de membrane plasmatique activés par la lumière qui sont distribués à la membrane plasmatique, limitant la résolution spatiale 3D^{12 et} les capacités intracellulaires.

Nous avons récemment montré que les nanofils de silicium (SiNWs) peuvent être utilisés pour effectuer un interrogatoire bioélectrique intracellulaire avec résolution spatiale submicron avec différentes cellules non excitables, à savoir les myofibroblastes cardiaques et les oligodendrocytes¹³. En outre, nous avons employé ces SiNWs pour exécuter l’interrogation spécifique de cellules ex vivo dans un tissu cardiaque 3D, pour étudier comment les cellules cardiaques couplent électriquement in vivo^14. Un avantage majeur de cette méthodologie est sa simplicité; il ne nécessite aucune modification génétique ou instrumentation volumineux. De nombreuses cellules intériorisent spontanément les SiNWs photo-sensibles sans avoir besoin de sonication ou d’électroporation¹⁵. En outre, ils échapperont spontanément à l’encapsulation endosomale et formeront une intégration transparente avec le cytosol et les organites intracellulaires^13,15. Ces composites cell-SiNWs, appelés hybrides cellule-silicium, possèdent la nature dynamique, douce et polyvalente de la cellule d’origine, ainsi que les capacités optoélectriques des SiNWs. Après hybridation, l’hybride cellule-SiNW peut être récolté à l’aide de techniques standard de culture tissulaire et utilisé pour diverses applications telles que la stimulation bioélectrique intracellulaire; étudier le couplage bioélectrique intercellulaire in vitro; et pour un interrogatoire spécifique à la cellule in vivo. Comme une stimulation efficace nécessite la co-localisation de densités de puissance optique élevée et sinws, on peut atteindre une haute résolution spatiale à la fois en 2D et 3D. Dans ce protocole, nous décrivons en détail la méthodologie, ainsi que la façon dont les résultats peuvent être analysés. L’accent est mis sur l’enquête intra- et intercellulaire in vitro, mais la mise en œuvre in vivo de cette méthodologie peut être directement utilisée pour de nombreux autres scénarios biologiques.

Protocole

Afin d’assurer le respect des normes éthiques, toutes les procédures animales liées à l’isolement des cardiomyocytes provenant du cœur des rongeurs ont d’abord été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Chicago (IACUC). En outre, toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux conseils de l’IACUC de l’Université de Chicago.

1. Préparation d’hybrides cell-SiNWs

1. Isoler les cardiomyocytes primaires (MC) à l’aide d’un kit commercial suivant les directives du fabricant.
2. Préparer le DMEM complet pour l’isolement des cellules primaires complété par 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur, 1 % de pénicilline-streptomycine et 1 % de L-glutamine.
3. Pour isoler le myofibroblaste (MF) de la suspension MFs-CMs, pré plaquez les cellules isolées sur un plat de culture tissulaire (cellules isolées de 2 cœurs à partir de l’étape 1.1. par plat de 100 mm) pendant 1 h. Comme les MC ont besoin d’une surface traitée à la fibronectine ou au collagène pour adhérer, seules les MF s’attacheront à la surface de la culture tissulaire.
4. Aspirez la suspension cellulaire enrichie des MC. Ces MC peuvent être utilisés pour des expériences hétérocellulaires de couplage décrites dans la section 3. Rincez les MF avec DMEM pour éliminer les MC restants du plat MFs.
5. Ajouter du milieu de culture frais aux MF et leur permettre de proliférer jusqu’à ce qu’ils soient ~80% confluents (2-4 jours). Changez le médium tous les deux jours.
6. Lorsque les cellules sont prêtes (80% de confluent), préparez les SiNW à l’étape d’hybridation ci-dessous (étape 1.7).
   REMARQUE : De nombreux types de SiNWs peuvent être utilisés pour cela. Dans cette expérience, les SiNWs qui ont été cultivés par dépôt chimique de vapeur (CVD) avec une configuration de jonction p-i-n de coquille centrale ont été utilisés comme décrit^{précédemment 16.} Pendant la croissance des MCV, les SiNWs sont cultivés sur un substrat de gaufrettes de silicium, et sont finalement conservés sous forme de copeaux de silicium recouverts de SiNWs.
7. Couper une puce de 3 mm x 3 mm à partir d’une gaufrette avec des SiNWs cultivés en MCV à l’aide d’un scribe de diamants. Utilisez des forceps tranchants pour manipuler la gaufrette et minimiser la surface touchée par les forceps, car cela peut briser les SiNWs.
8. Stériliser la puce en la rinçant avec 70% d’éthanol et en permettant à l’éthanol de sécher pendant 30 min sous la lumière UV dans un capot d’écoulement laminaire de biosécurité.
9. Transférer la puce dans un tube de microcentrifugeuse stérile et rincer l’excès d’éthanol à l’aide d’un média de culture complet.
10. Ajouter 1 mL de médias culturels et sonifier la puce dans le bain de sonication pendant 1-10 min. Les médias devraient devenir nuageux à mesure que les SiNWs sont diffusés dans les médias.
    REMARQUE : Le temps et la puissance de sonication doivent être optimisés pour différents sonicateurs ou cellules différentes, car des durées plus courtes et des puissances inférieures donneront plus de SiNWs.
11. Ajouter la suspension SiNWs dans 5 mL de culture et l’ensemencer sur le plat de culture tissulaire de 100 mm avec des MFs. Permettre aux SiNWs d’internaliser pendant 4 h et rincer l’excès de SiNWs de 5 x avec des supports. Permettre aux SiNWs partiellement intériorisés de compléter l’internalisation en leur permettant de s’asseoir encore 1 h avant l’utilisation.
    REMARQUE : Différents types de cellules peuvent avoir besoin de différents temps de concentration et/ou d’internalisation des SiNWs.
12. Préparer la solution de revêtement de collagène en diluant la solution de stock de collagène (3 mg/mL) avec l’acide acétique stérile de 20 mM à un rapport de 1:50. Ajouter une solution de revêtement de 0,5 mL à un plat de fond en verre de 35 mm et laisser reposer pendant 1 h dans 37 °C. Retirer la solution et rincer le plat avec du PBS stérile.
13. Récoltez les hybrides cell-SiNWs en traitant les cellules avec 3 mL de trypsine pendant 2 min à 37 °C. Ajouter 10 mL de culture et rincer vigoureusement les hybrides par pipetting. Centrifugez doucement les cellules à 200 x g pendant 5 min pour éviter d’endommager les cellules avec les SiNWs intériorisés. Retirer l’excès de nourriture, suspendre les cellules avec 1 mL de médias et les ensemencer sur le plat de fond en verre traité au collagène.
    REMARQUE : Les hybrides peuvent être ensemencés seuls, pour étudier le couplage intracellulaire ou intercellulaire ou avec des MC pour étudier le couplage hétérocellulaire in vitro.
14. Effectuer une vérification finale de l’internalisation du SiNW en étiquetant le cytosol des cellules (calcéine-AM, 4 μM) et la membrane (marqueur membranaire, 2 μM) pendant 30 min à 37 °C, et en imagerie de la cellule à l’aide d’une microscopie confocale. Comme les SiNWs sont très réfléchissants, la lumière réfléchie peut être utilisée au lieu de la fluorescence pour les visualiser.

2. Préparation des cellules aux investigations intra- et intercellulaires

1. Préparer la solution de revêtement de collagène comme dans 1.12
2. Pour la stimulation électrique intracellulaire, les hybrides de culture avec de faibles densités d’ensemencement. Utilisez un hémocytomètre standard pour compter les cellules de la section 1.11. et ensemencer 50 000 cellules sur un plat de fond en verre de 35 mm dans des supports de culture. Pour les investigations intercellulaires, utiliser des densités cellulaires plus élevées (500 000 cellules par plat). Pour le couplage intercellulaire entre les MC et les MF, co-culture des hybrides avec des MC fraîchement isolés.
3. Laissez les cellules se fixer pendant la nuit avant d’effectuer des expériences de stimulation optique. Pour les investigations intercellulaires, prévoyez 48 h à 37 °C pour que les cellules expriment des jonctions intercellulaires avant que l’expérience ne soit menée.
4. Préparer la solution de bouillon de colorant sensible au calcium (peut être conservé en -20 °C) en ajoutant 50 μL de DMSO à 50 μg Fluo-4 AM. Préparer la solution de coloration en diluant 1 μL de colorant dans 1 mL de DMEM.
5. Aspirer le milieu de culture à partir de cellules et ajouter 1 mL de solution de coloration. Laisser le colorant s’intérioriser en cellules pendant 20-30 min à 37 °C. Aspirer le colorant et rincer deux fois avec du PBS stérile.
6. Enfin, ajoutez 1 mL de DMEM Media sans phénol préchauffé et laissez le Fluo-4 intracellulaire subir une désestérification de 30 min en 37 °C.
7. Transférer les cellules au microscope pour l’imagerie et la stimulation.

3. Imagerie optique et stimulation

1. Préchauffer un microincubateur humidifié à 37 °C et un mélange air-CO₂ à bulles (95:5).
2. Utilisez un microscope avec une ligne laser collimée couplée dans le chemin lumineux pour l’imagerie calcique et la stimulation optique.
   REMARQUE : Un microscope confocal à balayage est l’option la plus simple en raison de ses capacités de stimulation de points. Toutefois, cette procédure peut être effectuée à l’aide de n’importe quel microscope à florescence standard en couplant un faisceau laser collimé dans l’espace infini de la trajectoire de la lumière à l’aide d’un séparant de faisceau. N’importe quel objectif de microscope est conçu de sorte qu’un laser collimated passé par lui sera concentré à une tache limitée de laser de diffraction au plan focal. La longueur d’onde laser doit être proche de la lumière d’excitation, de sorte qu’elle sera réfléchie par le miroir dichroïque et passée par le filtre d’excitation.
3. Visualisez les SiNWs et déterminez le site de stimulation à l’aide d’une microscopie à champ lumineux, d’une lumière transmise ou d’une lumière réfléchissante. Ensuite, reconfigurez le chemin lumineux vers le mode fluorescence, tout en maintenant le point de stimulation à l’emplacement prédéfini du SiNW.
4. Valider la puissance de stimulation optimale et la longueur du pouls pour chaque taille et type de cellule SiNW, afin de minimiser les dommages photothermaux aux cellules stimulées. Pour un protocole de stimulation typique, effectuez un enregistrement de base de 2-10 s de l’activité intracellulaire de calcium. Ensuite, appliquez une impulsion laser unique de 1-10 mW de puissance et une durée de 1-10 ms (correspondant à 30-300 kW/mm²⁾pour stimuler le SiNW, et enregistrer l’onde de calcium résultante pour un autre 2-10 s.
   REMARQUE : Il est essentiel d’optimiser la puissance optique et la longueur des impulsions pour chaque taille et cellule SiNW. Ceci est nécessaire pour minimiser les dommages photothermaux aux cellules stimulées.
5. Transférez les films enregistrés de la stimulation optique, si nécessaire, pour une analyse plus approfondie.

4. Traitement vidéo

1. Visualisez les changements dans la fluorescence Fluo-4 à l’aide de la macro¹⁷ « dF over F » disponible pour ImageJ¹⁸, qui calcule le changement dans les comptes de fluorescence pour chaque pixel, et se normalise par la valeur moyenne de la base de repos. Convertir la sortie (format point flottant) en 8 bits pour un traitement ultérieur.
2. Traiter davantage le film dF/F à l’aide du filtre médian sélectif «Supprimer lesvaleurs aberrantes » disponible dans ImageJ. Définissez des paramètres pour supprimer les pixels dont la valeur est supérieure de plus de 10 à la valeur médiane dans un rayon de 2 pixels et remplacez cette valeur pixel par la médiane.
3. Calculez le flux optique dans chaque image via l’algorithme Lucas-Kanade, tel qu’implémenté dans la boîte à outils Matlab Computer Vision. La sortie de cette fonction était un champ vectoriel contenant les composants x et y du flux optique à chaque point de chaque image (le code est disponible dans le fichier supplémentaire 1).
   REMARQUE: Le flux optique moyen au sein d’une cellule, <ι>, correspond au développement du flux calcique au sein d’une cellule. Le différentiel du flux optique, Δ<ι> fournit le moment où la signalisation de calcium a été activée, en identifiant où le signal a été maximisé. En outre, l’ampleur de Δ<ι> à son maximum est corrélée à la vitesse à laquelle le front d’onde de calcium progresse à travers la cellule.
4. Calculer la vitesse intercellulaire de la transmission du calcium selon l’équation suivante.
   -_Ca²⁺ = r_ij / ( t_max,j − t_max,i ),
   où t_{max, j} et t _{max, je suis} les temps d’activation pour les cellules j et i, respectivement, et r_ij est la distance entre les centroïdes des cellules.

Résultats

La capacité de cette méthodologie à permettre un accès direct au cytosol intracellulaire dépend de l’internalisation spontanée du SiNW dans les cellules. Bien que les SiNWs subiront l’internalisation spontanée dans beaucoup de types^{de cellules 15,}quelques cellules, telles que des cardiomyocytes et des neurones, auront besoin des SiNWs pour être traitées pour permettre leur internalisation^19. Dans ce protocole, nous décrivons le processus d’internalisation de...

Discussion

Nous avons démontré ici un moyen simple d’effectuer la stimulation électrique intracellulaire des cellules. Dans cette démonstration, nous avons utilisé des MF qui ont été préhybridisés avec les SiNWs, puis co-cultivés avec des MC. En général, la plupart des cellules proliférantes ont tendance à intérioriser les SiNWs, ce qui permet l’utilisation de cette méthodologie avec de nombreux autres types de cellules. En outre, tandis que nous avons démontré la stimulation intracellulaire des cellules, les ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Glass bottom dishes	Cellvis	D35-10-0-N
3i Marianas Spinning Disk Confocal	3i
Calcein-AM	Invitrogen	C1430
CellMask Orange Plasma membrane Stain	Invitrogen	C10045
Collagen I, rat tail	Gibco	A1048301
Deluxe Diamond Scribing Pen	Ted Pella	54468
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine	Gibco	10313039
DMSO, Anhydrous	Invitrogen	D12345
Falcon Standard Tissue Culture Dishes	Falcon	08-772E
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,	Gibco	10082147
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner	Fisher Scientific	FB11201
Fluo-4, AM, cell permeant	Invitrogen	F14201
FluoroBrite DMEM Media	Gibco	A1896701
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)	OKO
PBS, pH 7.4	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit	Thermo Scientific	88281
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056