牛卵巢皮质组织培养

摘要

本文介绍了牛卵巢皮层的体外培养以及营养阶梯式饮食对卵巢微环境的影响。将卵巢皮层切片培养七天，并评估类固醇，细胞因子和卵泡分期。阶梯式饮食治疗增加了类固醇生成，导致培养物中的卵泡进展。

摘要

从原始阶段到窦阶段的卵泡发育是卵巢皮层内的一个动态过程，其中包括来自体细胞和卵丘细胞 - 卵母细胞通讯的内分泌和旁分泌因子。人们对卵巢微环境以及周围环境中产生的细胞因子和类固醇如何影响卵泡进展或停滞知之甚少。卵巢皮层的体外培养使卵泡能够在正常化的环境中发育，该环境仍然由相邻基质支持。我们的目标是通过牛卵巢皮层的体外培养来确定营养阶梯式饮食对卵巢微环境（卵泡发育，类固醇和细胞因子产生）的影响。为了实现这一点，从小母牛身上取出卵巢皮质片，在青春期前经历两种不同的营养发育方案:控制（传统营养发育）和楼梯阶梯（发育过程中的喂养和限制），切成约0.5-1毫米³ 片。这些碎片随后经过一系列洗涤并放置在组织培养插入物上，该插入物被设置在含有Waymouth培养基的孔中。卵巢皮质培养7天，每日更换培养基。进行组织学切片以确定培养前后的卵泡阶段变化，以确定营养的影响和培养的影响，而无需额外的治疗。将皮质培养基在几天内汇集以测量类固醇，类固醇代谢物和细胞因子。卵巢微环境中类固醇激素增加的趋势允许在楼梯与对照卵巢皮层培养中发生卵泡进展。卵巢皮层培养技术可以更好地了解卵巢微环境，以及内分泌分泌的改变如何影响体内和体外治疗的卵泡进展和生长。这种培养方法也可能被证明有利于测试可能改善女性卵泡进展以促进生育能力的潜在治疗方法。

引言

卵巢皮层代表卵泡发育发生的卵巢外层¹。最初在发育中停滞的原始卵泡将被激活成为原发性，继发性，然后根据旁分泌和促性腺激素输入^{1，2，3，4}成为前囊或三级卵泡。为了更好地了解卵巢内的生理过程，组织培养可以用作体外模型，从而允许受控环境进行实验。许多研究利用卵巢组织培养物进行辅助生殖技术，生育力保存和卵巢癌^{的研究5，6，7。}卵巢组织培养也作为研究损害卵巢健康的生殖毒素和生殖障碍的病因的模型，如多囊卵巢综合征（PCOS）8，9，10，11。因此，该培养系统适用于各种专业。

在啮齿动物中，整个胎儿或围产期性腺已被用于生殖生物学实验12，13，14，15。然而，来自大型家畜的性腺由于其体型较大且可能变性而不能作为整个器官进行培养。因此，牛和非人灵长类动物的卵巢皮层被切成更小的碎片16、17、18。许多研究已经培养了小的卵巢皮层碎片，以研究家畜和非人类灵长类动物原始卵泡启动中的各种生长因子^{1，17，18，19。}卵巢皮质培养的使用也表明，在没有培养7天的牛和灵长类动物皮质片血清的情况下，原始卵泡启动²⁰。Yang和Fortune在2006年用一系列睾酮剂量在10天内治疗胎儿卵巢皮层培养基，并观察到^10-7M浓度的睾丸激素增加了卵泡的募集，存活率，并增加了早期卵泡的进展^19。2007年，使用来自牛胎儿（妊娠5-8个月）的卵巢皮层培养物，Yang和Fortune报告了血管内皮生长因子A（VEGFA）在原发性到继发性卵泡过渡中的作用^21。此外，我们的实验室已经利用卵巢皮质培养物来证明VEGFA亚型（血管生成，抗血管生成和组合）如何通过激酶结构域受体（KDR）调节不同的信号转导途径，激酶结构域受体是VEGFA结合¹⁶的主要信号转导受体。这些信息可以更好地了解不同的VEGFA同种型如何影响信号通路以引发卵泡进展或停滞。综上所述，用不同的类固醇或生长因子在体外培养卵巢皮层片段可能是一种有价值的测定方法，以确定对调节卵泡发生机制的影响。同样，在不同营养方案下发育的动物可能已经改变了卵巢微环境，这可能促进或抑制影响雌性生殖成熟的卵泡发生。因此，我们在当前手稿中的目标是报告牛皮层培养技术，并确定在13个月大时收集的对照或阶梯饮食的小母牛体外培养牛皮质后卵巢微环境是否存在差异^{，如前所述16。}

因此，我们的下一步是确定这些小母牛的卵巢微环境，这些小母牛是用不同的营养饮食开发的。我们评估了用阶梯或对照饮食喂养的小母牛的卵巢皮层。对照小母牛的维持日粮为97.9克/千克^0.75， 持续84天。阶梯式饮食在8个月时开始，包括67.4 g / kg^0.75 的限制性喂养饮食，持续84天。在前84天之后，虽然对照小母牛继续接受97.9克/千克^0.75，但阶梯式牛小母牛被给予118.9克/千克^0.75， 再过68天，之后它们在¹⁶ 个月大时被卵巢切除，以研究培养前后卵泡期和形态的变化。我们还测定了分泌到皮质培养基中的类固醇，类固醇代谢物，趋化因子和细胞因子的差异。测量类固醇和其他代谢物以确定体内和/或体外进行的治疗是否对组织活力和生产力有任何直接影响。培养前后卵巢微环境的变化提供了培养前内分泌环境和卵泡发生的快照，以及培养期间培养或治疗如何影响卵泡进展或停滞。

在美国肉类动物研究中心（USMARC）根据¹⁶个月大的对照和阶梯式小母牛的IACUC程序进行卵巢切除术后收集卵巢，用0.1%抗生素洗涤无菌磷酸盐水（PBS）清洗以去除血液和其他污染物，修剪多余的组织，并运送到内布拉斯加大学林肯分校（UNL）生殖生理学实验室UNL，温度为37°C²³.在UNL，卵巢皮层块被切成小的方块（〜0.5-1mm³;图 1）并培养7天（图2）。在培养前后对皮层培养载玻片进行组织学，以确定卵泡^{阶段16，24（}图3和图4）和可能表明纤维化的细胞外基质蛋白（Picro-Sirus Red，PSR;图 5）。这允许确定体内营养方案对卵泡阶段的影响，并允许比较卵泡阶段和卵泡进展的7天卵巢皮层。在整个培养过程中，每天收集和更换培养基（每天收集约70%的培养基;250μL/孔），以便可以评估每日激素/细胞因子/趋化因子或在几天内汇集以获得平均浓度。类固醇如雄烯二酮（A4）和雌激素（E2）可以在3天内汇集，并通过放射免疫测定（RIA;图 6）每只动物汇集4天，并通过高效液相色谱 - 质谱法（HPLC-MS）24，25（表1）进行测定。使用细胞因子阵列来评估卵巢皮质培养基²⁶中的细胞因子和趋化因子浓度（表2）。进行实时聚合酶链反应（RT-PCR）测定板以确定特定信号转导途径的基因表达，如前所述^16。所有类固醇，细胞因子，卵泡阶段和组织学标志物都提供了卵巢微环境的快照以及有关该微环境促进"正常"或"异常"卵泡发生的能力的线索。

研究方案

卵巢是从美国肉类动物研究中心¹⁶获得的。如前所述^，所有程序均由美国肉类动物研究中心（USMARC）动物护理和使用委员会根据农业研究和教学中农业动物的护理和使用指南批准。卵巢被带到内布拉斯加大学林肯生殖实验室，在那里它们被加工和培养。

1. 所需培养基的制备

1. 韦茅斯 MB 752/1 中型
   1. 在1L组织培养瓶中加入900 mL无菌水。当水在搅拌板上轻轻搅拌时，逐渐加入粉末状介质。一旦粉末状培养基溶解，加入2.24g碳酸氢钠，然后加入1.25g牛血清白蛋白（BSA）。使用pH计并将pH值调节至7.25-7.35。加入额外的无菌水，使最终体积达到1升。
   2. 移入生物安全柜，加入浓度为0.1%v/v的青霉素硫酸链霉素。用0.22μm孔径33.2 cm² 500 mL瓶顶过滤器过滤培养基。
   3. 将过滤后的培养基倒入几个50 mL锥形管中。每50毫升等分的培养基加入0.5毫升胰岛素转铁蛋白硒。
   4. 将锥形管和培养基的库存瓶包裹在铝箔中，并储存在4°C。 这种介质对光敏感。
      注意:Waymouth培养基可以储存长达1个月。
2. 莱博维茨的L-15（LB-15）中型坦克
   注意:LB-15培养基用于清洁组织以准备培养。
   1. 在1L组织培养瓶中加入900 mL无菌水。当无菌水在搅拌盘上轻轻搅拌时，逐渐加入制备的粉末状培养基。使用pH计并将pH值调节至7.25-7.35。加入额外的无菌水，使最终体积达到1升。
   2. 移至生物安全柜。用0.1%抗生素制作1LLB-15（见材料表）。使用0.22μm孔径33.2 cm 2 500 mL瓶顶过滤器将培养基过滤到两个500 mL组织培养瓶中。用铝箔包裹瓶子，因为LB-15介质对光敏感，并储存在4°C。
      注意:LB-15 培养基最多可储存 1 个月。
3. 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）
   1. 在实验室中制作PBS或购买不含钙或镁的无菌PBS（材料表）。要在实验室中制作PBS，首先使用800毫升蒸馏水，然后加入8克氯化钠（NaCl）。然后，加入0.2克氯化钾（KCl），1.44克磷酸钠（Na₂HPO_4）和0.24克磷酸氢钾（KH₂PO_4）。将pH值调节至~7.4，并将总体积调节至1 L.通过高压灭菌对溶液进行灭菌。
   2. 在生物安全柜中用0.1%抗生素制作1升PBS（ 见材料表）。

2. 卵巢皮质培养方案

注意:卵巢是从13个月大的春季出生的USMARC小母牛获得的。彻底冲洗卵巢，并用含有抗生素的PBS（0.1%）除去所有血液和其他液体，并在 37°C下²³ 转运到内布拉斯加大学林肯生殖实验室UNL（1.5小时远）。（有关运输过程中卵巢温度的评论，请参阅 讨论）

1. 在干净的工作台上准备卵巢组织（图1）。
   1. 用70%乙醇消毒清洁工作台。在工作台上放置一个新鲜的吸水垫。确保在解剖前半小时打开清洁工作台鼓风机以及紫外线，以对清洁工作台上的任何物品（包括吸收垫）进行消毒，并确保使用适当的PPE。
   2. 将培养皿（60 x 15 mm）放在纸巾清洗液中。PBS洗涤需要三个培养皿，带抗生素的PBS需要三个培养皿，LB-15洗涤需要三个培养皿。另外一个含有LB-15的培养皿和随附的盖子将用于洗涤后最终放置部件。
   3. 在每个培养皿中加入约 10 mL 的适当液体（PBS 或 LB-15）。

图1:用于在清洁工作台上清洗卵巢和皮层片的板的布局（A）用于清洗卵巢的PBS，因为皮层的各个部分被移除。（B） PBS用抗生素清洗，使皮层碎片移动。（C） 卵巢皮层碎片在LB-15中洗涤四次，然后移动到生物安全柜中进行LB-15的最终洗涤。请点击此处查看此图的放大版本。 

2. 从冰箱中取出准备好的Waymouth和LB-15培养基，并加热至室温。
3. 高压灭菌所有工具，以确保在使用前进行灭菌。
4. 将卵巢保持在 37°C，直到卵巢皮层准备好被收集。
5. 使用带有锯齿状颌骨的镊子，拿起卵巢并在第一个充满PBS的培养皿中彻底清洗。将卵巢转移到第二个PBS洗涤器中，并再次彻底清洁。
   注意:卵巢将停留在第二次PBS洗涤中，同时去除卵巢皮质条。
6. 使用锯齿状颌钳，固定卵巢并切成两半。此时，卵巢皮层将从髓质中切除。使用尺子，确保从延髓16中移除的卵巢表面深度不超过^1-2毫米。从延髓中取出卵巢皮层的横截面，用手术刀（#11手术刀刀片;#3手柄）切下3-4条薄的卵巢皮层（图2），然后将条带放入第三个充满PBS的培养皿中。
   注意:此时，可以收集额外的卵巢皮质组织进行RNA提取或固定并收集以进行初始非培养皮层片段的组织学检查。去除卵巢皮层条时，避免有可见的窦卵泡或黄体的区域。此外，避免收集髓质组织。延髓的组织学非常不同，如前面所示¹⁶。如果卵巢皮层没有被切成超过1-2毫米的深度，那么不应该获得髓质。独特的组织学允许皮层和延髓之间的标志性特征。
7. 在第三个PBS洗涤中将卵巢皮层条切成小的方形碎片（〜0.5-1 mm^3），用#21手术刀刀片。在培养皿下方使用尺子，以确保这些碎片具有相似的尺寸和厚度，以形成一致的卵巢皮层碎片。使用镊子固定条带，同时用手术刀切割碎片。
   注意:切除的组织件数量取决于实验。四片卵巢皮层是培养所需的最小组织量。确保适当长度和深度的其他方法包括使用特殊的切片机²⁶或预切塑料件作为模板^27。
8. 用充满抗生素的培养皿冲洗所有三个PBS中的卵巢皮质碎片。使用弯曲的尖端镊子在洗涤之间移动部件。
9. 通过一系列LB-15洗涤器移动皮层碎片，并放入最终的LB-15填充培养皿中。在盖子上贴上动物 ID 和卵巢侧（左侧或右侧）的标签。
   注意:将卵巢皮层完全浸入每次洗涤中，以进行彻底清洁。
10. 每个卵巢收集四个卵巢皮层碎片，并修复第零天组织学。其他片段也可以快速冷冻用于RNA。剩余的组织块将用于培养。每次组织收集后用70%乙醇擦拭解剖工具。
11. 准备生物安全柜，用于最终的组织洗涤和培养制备。在放入生物安全柜之前，先用70%乙醇消毒用品。在生物安全柜中工作时使用无菌技术。
12. 将所有用于培养的卵巢皮层移至生物安全柜，并在充满LB-15的培养皿中再次洗涤。
13. 在24孔组织培养板中，每孔移取350μLWaymouth培养基。
14. 使用镊子将未涂覆的培养孔插入每个孔中。确保在插入物的底部下不会形成气泡，因为这会导致组织变干。培养基必须接触插入物，以使培养基被吸收并包围卵巢皮层。
15. 小心地将四个卵巢皮层片放置在每个插入物的网格上（图2）。如果组织块未被精细放置，镊子可以刺穿网状物。纸巾不应相互接触或接触插入物的侧面。
16. 将组织在37°C下孵育，其中5%CO₂^16。
    注:其他均采用38.8°C^28。 然而，在组织的完整性方面没有观察到差异，也没有观察到卵泡在37°C组织中进展的能力的差异，也没有观察到其他^39，30。因此，在这一点上，这些温度中的任何一个都应该有利于实验的成功。其他人使用了400μL培养基。只要一个是一致的，并且组织部分浸没，允许足够的表面张力以允许组织（卵巢皮层片周围的介质）的水合作用，任何一个量都是好的。用500μL无菌水填充空孔，以帮助减少其他孔的蒸发。

图2:卵巢皮层片和培养板（A）从卵巢皮层切开的卵巢条。（B） 标尺和皮层部分并排显示。（C）四个皮层片（~0.5-1毫米^3）放在板中培养基的插入物上。（D）提起插入物以从井中收集培养基。每天收集并更换所有培养基（250μL）以保持适当的pH值，每天从每个孔中获得约250μL（约初始培养基的70%）。请点击此处查看此图的放大版本。

3. 媒体收集

1. 每天更换卵巢皮层培养基，持续 7 天。培养基变化应尽可能接近24小时，以防止培养基中pH值和颜色发生较大变化。温热的韦茅斯介质在介质更换前至37°C。每天从每个孔中获得约250μL（约初始培养基的70%）。
2. 在更换介质时，使用镊子轻轻地将插入物从孔中提起。将培养的Waymouth培养基收集在0.5mL管（约250μL/天）中。将插入物放回孔中，并通过在插入物侧面和孔之间分配培养基来加入350μL新鲜培养基。
   注意:每天更换大部分培养基，以获得足够的培养基来测量确定卵巢微环境所需的所有类固醇，细胞因子和趋化因子。此外，每日培养基变化对于防止培养基中pH值发生较大变化（由颜色变化表示）也很重要。在卵巢皮层块周围保留一滴培养基，以确保这些块保持湿润。由于70%的培养基发生变化，培养的组织没有观察到任何问题。
3. 将组织培养物中收集的培养基储存在-20°C。

4. 成像和下游处理

1. 在 37°C下用5%CO₂培养7天后，使用带有相机的解剖显微镜和计算机成像软件程序对卵巢皮层碎片进行成像。
   注:暗室通常最适合获得最佳成像图像质量。
2. 成像后，在Bouins中每孔固定两个卵巢皮层片以进行组织学检查，并在液氮中快速冷冻两个卵巢皮层片段以获得用于cDNA的RNA。对所有有组织的孔重复此步骤。从第7天开始收集培养基并储存在-20°C
3. 让卵巢皮层块浸入Bouins（苦味酸750mL，冰醋酸50mL和37%-40%福尔马林250mL）中约1.5小时，然后用70%乙醇洗涤三次。组织将保持在70%乙醇中，并每天清除，直到溶液不再变黄。
   注意:可以使用布恩以外的固定剂以及多聚甲醛。在这种体验中，Bouins被用作实现最佳形态的固定剂。如果需要更多的组织进行其他分析，可以从每只动物身上获得额外的培养基孔和卵巢皮层。

结果

这种牛皮质培养程序可用于从卵巢的小块中确定各种激素，细胞因子和组织学数据。染色，如苏木精和曙红（H&E），可用于通过卵泡分期^16，23，31确定卵巢^形态（图3）。简而言之，卵泡被归类为原始卵泡，这是一种卵母细胞，周围有一层鳞状的前粒细胞（0）;过渡卵泡或早期原发卵泡，这是一种卵母细胞...

讨论

如本手稿所述，体外卵巢皮层培养的好处是卵泡在正常化环境中发育，卵泡周围有相邻的基质。体细胞和卵母细胞保持完整，并且作为体内模型存在适当的细胞间通讯。我们的实验室发现，7天的培养系统为卵巢皮层的治疗提供了具有代表性的卵泡发生和类固醇生成数据。其他卵巢组织培养方案的培养期相对较短，为1-6天^7、32或较长的培养期为10-15天

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#11 Scapel Blade	Swann-Morton	303	Scaple Blade
#21 Scapel Blade	Swann-Morton	307	Scaple Blade
500mL Bottle Top Filter	Corning	430514	Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium
AbsoluteIDQ Sterol17 Assay	Biocrates	Sterol17 Kit	Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned
Androstenedione Double Antibody RIA Kit	MPBio	7109202	RIA to determine androstenedione from culture medium
Belgium A4 Assay Kit	DIA Source	KIP0451	RIA to determine androstenedione from culture medium
Bovine Cytokine Array Q3	RayBiotech	QAB-CYT-3-1	Cytokine kit to determine cytokines from culture medium
cellSens Software Standard 1.3	Olympus	7790	Imaging Software
Insulin-Transferrin-Selenium-X	Gibco ThermoFisher Scientific	5150056	Addative to the culture medium
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco ThermoFisher Scientific	4130039	Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet
Microscope	Olympus	SZX16	Disection microscope used for imaging tissue culture pieces
Microscope Camera	Olympus	DP71	Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces
Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter	Millipore Sigma	PICM01250	Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it
Multiwell 24 well plate	Falcon	353047	Plate used to hold meduim, inserts, and tissues
Petri dish 60 x 15 mm	Falcon	351007	Petri dish used for washing steps prior to culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X)	Corning	21-040-CV	Used for tissue washing
SAS Version 9.3	SAS Institute	9.3 TS1M2	Statistical analysis software
Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer	Thomas Scientific	6727C10	Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue
Waymouth MB 752/1 Medium	Sigma-Aldrich	W1625	Medium used for tissue cultures