JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

תרבות מבינטית של קליפת המוח השחלות שור ואת ההשפעה של דיאטה תזונתית מדרגות צעד על microenvironment השחלות מוצג. חתיכות קליפת המוח השחלתית היו מתורבתים במשך שבעה ימים, סטרואידים, ציטוקינים, ושלבי זקיק הוערכו. טיפול דיאטה מדרגות-צעד היה סטרואידוגנזה מוגברת וכתוצאה מכך התקדמות זקיק בתרבות.

Abstract

התפתחות זקיק משלב קדמוני עד antral הוא תהליך דינמי בתוך קליפת המוח השחלתית, הכולל גורמים אנדוקריניים paracrine מתאים סומטיים ותקשורת תא קומולוס-ביציות. מעט מאוד ידוע על microenvironment השחלות וכיצד ציטוקינים וסטרואידים המיוצרים בסביבה milieu להשפיע על התקדמות זקיק או מעצר. תרבות במבחנה של קליפת המוח השחלתית מאפשרת לזקיקים להתפתח בסביבה מנורמלת שנותרה נתמכת על ידי סטרומה סמוכה. המטרה שלנו הייתה לקבוע את ההשפעה של דיאטה התזונתית מדרגות-צעד על microenvironment השחלות (התפתחות זקיק, סטרואידים, וייצור ציטוקינים) באמצעות תרבות במבחנה של קליפת המוח השחלות שור. כדי להשיג זאת, חתיכות קליפת המוח השחלות הוסרו מן heifers עובר שתי תוכניות שונות שפותחו מבחינה תזונתית לפני גיל ההתבגרות: שליטה (התפתחות תזונה מסורתית) ו מדרגות-צעד (האכלה והגבלה במהלך הפיתוח) שנחתכו לכ 0.5-1 מ"מ3 חתיכות. חלקים אלה הועברו לאחר מכן דרך סדרה של שטיפות ומוצבים על תוספת תרבית רקמות שנקבעה לתוך מדיום התרבות של Waymouth המכיל היטב. קליפת המוח השחלתית הייתה בתרבית במשך 7 ימים עם שינויים מדיניים בתרבות היומית. ניתוח היסתולוגי בוצע כדי לקבוע שינויים בשלב הזקיק לפני ואחרי התרבות כדי לקבוע את ההשפעות של תזונה והשפעת התרבות ללא טיפול נוסף. מדיום תרבות קליפת המוח היה איחד במשך ימים כדי למדוד סטרואידים, מטבוליטים סטרואידים, וציטוקינים. היו נטיות להורמונים סטרואידיים מוגברים במיקרו-סביבה בשחלות שאפשרו התקדמות זקיק בתרביות קליפת המוח השחלתית של מדרגות לעומת שליטה. טכניקת תרבות קליפת המוח השחלתית מאפשרת הבנה טובה יותר של מיקרו-סביבה השחלות, וכיצד שינויים בהפרשה האנדוקרינית עשויים להשפיע על התקדמות הזקיק והצמיחה הן מטיפולי vivo והן מטיפולי מביה. שיטת תרבות זו עשויה גם להוכיח מועיל לבדיקת טיפולים פוטנציאליים שעשויים לשפר את התקדמות הזקיק אצל נשים כדי לקדם את הפוריות.

Introduction

קליפת המוח השחלות מייצגת את השכבה החיצונית של השחלה שבה מתרחשת התפתחות זקיק1. זקיקים ראשוניים, שנעצרו בתחילה בפיתוח, יופעלו כדי להפוך לזקיקים ראשוניים, משניים, ולאחר מכן אנטרליים או שלוחוניים המבוססים על כניסות paracrine ו gonadotropin1,2,3,4. כדי להבין טוב יותר תהליכים פיזיולוגיים בתוך השחלה, תרבית הרקמות יכולה לשמש כמודל במבחנה, ובכך לאפשר לסביבה מבוקרת לערוך ניסויים. מחקרים רבים השתמשו בתרבית רקמת השחלות למחקר בטכנולוגיית הרבייה בסיוע, שימור פוריות וסרטן השחלות5,6,7. תרבית רקמת השחלות שימשה גם כמודל לחקירת רעלני הרבייה הפוגעים בבריאות השחלות ובאטיולוגיה של הפרעות פוריות כגון תסמונת השחלות הפוליטיות (PCOS)8,9,10,11. לכן, מערכת תרבות זו חלה על מגוון רחב של התמחויות.

במכרסמים, נעשה שימוש בעובר שלם או בעוברים ניסויים בביולוגיה של הרבייה12,13,14,15. עם זאת, gonads מן בעלי חיים ביתיים גדולים יותר לא ניתן לתרבות כמו איברים שלמים בשל גודלם הגדול ניוון פוטנציאלי. לכן, קליפת המוח השחלות הפרימטים הלא אנושית נחתכת לחתיכות קטנות יותר16,17,18. מחקרים רבים תרבויות חתיכות קליפת המוח השחלתית הקטנה כדי לחקור גורמי גדילה שונים בייזום זקיק קדמוני בבעלי חיים מקומיים ופרימטים לא אנושיים1,17,18,19. השימוש בתרבות קליפת המוח השחלתית הוכיח גם חניכה קדמונית של זקיק בהיעדר סרום לחתיכות קליפת המוח של בקר ופרימטים בתרבית במשך 7 ימים20. יאנג ו פורצ'ן בשנת 2006 טיפלו במדיום תרבית קליפת המוח השחלתית העוברית עם מגוון של מינונים טסטוסטרון במשך 10 ימים וציין כי ריכוז10-7 M של טסטוסטרון גדל גיוס זקיק, הישרדות, והתקדמות מוגברת של זקיקים בשלב מוקדם19. בשנת 2007, באמצעות תרביות קליפת המוח השחלתית מעוברי בקר (5-8 חודשים של הריון), יאנג ועושר דיווחו על תפקיד עבור גורם גדילה אנדותל וסקולרי A (VEGFA) במעבר זקיק ראשוני למשני21. יתר על כן, המעבדה שלנו השתמשה בתרביות קליפת המוח השחלתית כדי להדגים כיצד איזופורמים של VEGFA (אנגיוגני, אנטי-אנגיוגניים ושילוב) עשויים לווסת מסלולי העברת אותות שונים דרך קולטן תחום קינאז (KDR), שהוא קולטן העברת האות העיקרי ש- VEGFA קושר16. מידע זה אפשר הבנה טובה יותר של האופן שבו isoforms VEGFA שונים משפיעים על נתיבי איתות כדי לעורר התקדמות זקיק או מעצר. נלקח יחד, culturing של חתיכות קליפת המוח השחלתי במבחנה עם סטרואידים שונים או גורמי גדילה יכול להיות מטען יקר כדי לקבוע השפעות על מנגנונים המסדירים folliculogenesis. באופן דומה, בעלי חיים המפותחים על משטרים תזונתיים שונים עשויים לשנות מיקרו-סביבה בשחלות, אשר עשוי לקדם או לעכב folliculogenesis המשפיע על בגרות הרבייה הנשית. לכן, המטרה שלנו בכתב היד הנוכחי היא לדווח על טכניקת תרבית קליפת המוח בקר ולקבוע אם יש הבדלים מיקרו-וירוסים השחלות לאחר תרבית במבחנה של קליפת המוח בקר מן heifers האכילו או דיאטות בקרה או מדרגות-צעד שנאספו בגיל 13 חודשים כפי שתואר קודם לכן16.

לכן, הצעד הבא שלנו היה לקבוע את microenvironment השחלות אלה תרנגולות שפותחו עם דיאטות תזונתיים שונים. הערכנו קליפת המוח השחלות מעוגות המוזנות בדיאטת מדרגות או שליטה. עריסות בקרה הוצעו דיאטה תחזוקה של 97.9 גרם / קילוגרם0.75 במשך 84 ימים. דיאטה מדרגות-צעד החלה ב 8 חודשים המכיל דיאטה מוגבלת של 67.4 גרם / קילוגרם0.75 במשך 84 ימים. לאחר 84 הימים הראשונים, בעוד עגילות בקרה המשיכו לקבל 97.9 גרם / קילוגרם0.75, עגילות בקר מדרגות-צעד הוצעו 118.9 גרם / קילוגרם0.75 במשך 68 ימים נוספים, ולאחר מכן הם היו ovariectomized ב 13 חודשים של גיל16 לחקר שינויים בשלבי זקיקים ומורפולוגיה לפני ואחרי התרבות. אנחנו גם eded להבדלים בסטרואידים, מטבוליטים סטרואידים, כימותרפיה, וציטוקינים מופרש לתוך מדיה קליפת המוח. סטרואידים ומטבוליטים אחרים נמדדו כדי לקבוע אם היו השפעות ישירות מטיפולים שנערכו ב- vivo ו/או במבחנה על כדאיות רקמות ופרודוקטיביות. שינויים במיקרו-סביבה השחלות לפני ואחרי התרבות סיפקו תמונת מצב של המילייה האנדוקרינית והפוליקולוגנזה לפני התרבות וכיצד תרבות או טיפול במהלך התרבות משפיעים על התקדמות זקיק או מעצר.

השחלות נאספו לאחר כריתת השחלות במרכז לחקר בעלי חיים בשר בארה"ב (USMARC) על פי נהלי IACUC שלהם מפרסות בקרה ומדרגות בגיל13 חודשים 16, ניקה עם תמיסת מלח חוצץ פוספט סטרילית (PBS) שוטף עם 0.1% אנטיביוטיקה כדי להסיר דם ומזהמים אחרים, רקמה עודפת גזוז, והועבר לאוניברסיטת נברסקה-(לינקולן UNL) מעבדת פיזיולוגיה פוריות UNL ב 37 ° C23 . ב UNL, חתיכות קליפת המוח השחלתית נחתכו לחתיכות מרובעות קטנות (~ 0.5-1 מ"מ3; איור 1) ומתורבת במשך 7 ימים(איור 2). ההיסתולוגיה נערכה על שקופיות תרבות קליפת המוח לפני ואחרי התרבות כדי לקבוע זקיקים שלבים16,24 (איור 3 ואיור 4), וחלבוני מטריצה חוץ תאיים שעשויים להצביע על פיברוזיס (פיקרו-סירוס אדום, PSR; איור 5). זה איפשר קביעת השפעה של משטרים תזונתיים in vivo על שלבי זקיק ואפשר השוואה של 7 ימים של קליפת המוח השחלות על שלבי זקיק והתקדמות זקיק. לאורך כל התרבות, המדיום נאסף ושתנה מדי יום (כ -70% מהמדיה נאספה מדי יום; 250 μL / well) כך או הורמונים יומיים / ציטוקינים / כימותרפיה ניתן להעריך או לאגד במשך ימים כדי להשיג ריכוזים ממוצעים. סטרואידים כגון אנדרוסטנדיון (A4) ואסטרוגן (E2) ניתן לאגד מעל 3 ימים ולהעריך באמצעות radioimmunoassay (RIA; איור 6) ומאוחסנים במשך 4 ימים לכל חיה וניידדו באמצעות ספקטרומטריה כרומטוגרפיה-מסה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC-MS)24,25 (טבלה 1). מערכי ציטוקינים נוצלו להערכת ריכוזי ציטוקינים וכימוקין בתרבות קליפת המוח השחלתיתבינונית 26 (טבלה 2). צלחות בדיקת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR) נערכו כדי לקבוע ביטוי גנים עבור מסלולי העברת אותות ספציפיים כפי שהודגם בעבר16. כל הסטרואידים, ציטוקינים, שלב הזקיק והסמנים היסטולוגיים מספקים תמונת מצב של מיקרו-סביבה השחלות ורמזים לגבי היכולת של מיקרו-סביבה לקדם פוליקולוגנזה "נורמלית" או "לא נורמלית".

Protocol

השחלות התקבלו מהמרכז לחקר בעלי חיים בשר בארה"ב16. כאמור16, כל ההליכים אושרו על ידי המרכז האמריקאי לחקר בעלי חיים (USMARC) טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים חקלאיים במחקר חקלאי והוראה. השחלות הובאו למעבדת הרבייה של אוניברסיטת נברסקה-לינקולן, שם הן עובדו והתרבותבו.

1. הכנת מדיה נדרשת

  1. וויימות' MB 752/1 בינוני
    1. מלא בקבוק תרבית רקמות 1 L עם 900 מ"ל של מים סטריליים. בזמן שהמים מערבבים בעדינות על צלחת ערבוב, מוסיפים בהדרגה את האבקה המדיום. לאחר המדיום אבקת מומס, להוסיף 2.24 גרם של סודיום ביקרבונט ואחריו 1.25 גרם של אלבומין סרום בקר (BSA). השתמש במד pH ולהתאים את ה- pH ל 7.25-7.35. מוסיפים מים סטריליים נוספים כדי להביא את הנפח הסופי ל-1 ליטר.
    2. עבור לארון בטיחות ביולוגי ולהוסיף פניצילין-סטרפטומיצין סולפט בריכוז של 0.1% v/v של המדיום. סנן את המדיום עם 0.22 מיקרומטר נקבובית 33.2 ס"מ2 500 מ"ל בקבוק העליון מסנן.
    3. יוצקים את המדיום המסונן לכמה צינורות חרוט 50 מ"ל. יש להוסיף 0.5 מ"ל אינסולין-טרנספרין-סלניום לכל 50 מ"ל של מדיום עלי-
    4. עוטפים את הצינורות החרוטים ואת בקבוק המלאי של המדיום בנייר אלומיניום ומאחסנים ב 4 °C (70 °F). המדיום הזה רגיש לאור.
      הערה: ניתן לאחסן מדיום Waymouth למשך עד חודש אחד.
  2. בינוני L-15 (LB-15) של ליבוביץ
    הערה: מדיום LB-15 משמש לניקוי רקמות כהכנה לתרבות.
    1. מלא בקבוק תרבית רקמות 1 L עם 900 מ"ל של מים סטריליים. בעוד המים הסטריליים מערבבים בעדינות על צלחת ערבוב, מוסיפים בהדרגה את המדיום המוכן. השתמש במד pH ולהתאים את ה- pH ל 7.25-7.35. מוסיפים מים סטריליים נוספים כדי להביא את הנפח הסופי ל-1 ליטר.
    2. עבור לארון בטיחות ביולוגי. הפוך 1 L של LB-15 עם 0.1% אנטיביוטיקה (ראה טבלה של חומרים). לסנן את המדיום לשני בקבוקי תרבית רקמות 500 מ"ל באמצעות 0.22 מיקרומטר נקבובית 33.2 ס"מ2 500 מ"ל בקבוק העליון מסנן. לעטוף בקבוקים בנייר אלומיניום כמו LB-15 בינוני הוא רגיש לאור ולאחסן ב 4 °C (70 °F).
      הערה: ניתן לאחסן מדיום LB-15 למשך עד חודש אחד.
  3. תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS)
    1. הפוך PBS במעבדה או לרכוש PBS סטרילי ללא סידן או מגנזיום (שולחן החומרים). כדי להפוך PBS במעבדה, להתחיל עם 800 מ"ל של מים מזוקקים ולהוסיף 8 גרם של נתרן כלורי (NaCl) אליו. לאחר מכן, להוסיף 0.2 גרם של אשלגן כלורי (KCl), 1.44 גרם של נתרן פוספט דיבסיק (Na2HPO4), ו 0.24 גרם של אשלגן פוספט דיבסי (KH2PO4). כוונן את ה- pH ל- ~ 7.4 והתאם את הנפח הכולל ל- 1 ליטר. עקר את הפתרון על-ידי הפעלה אוטומטית.
    2. הפוך PBS 1 L עם 0.1% אנטיביוטיקה (ראה טבלה של חומרים) בעוד בארון בטיחות ביולוגי.

2. פרוטוקול תרבות קליפת המוח השחלות

הערה: השחלות התקבלו מענפי USMARC שנולדו באביב בגיל 13 חודשים. השחלות נשטפו ביסודיות, וכל הדם ונוזלים אחרים הוסרו עם PBS המכיל אנטיביוטיקה (0.1%) והועברו ב 37 מעלות צלזיוס23 לאוניברסיטת נברסקה-לינקולן רבייה המעבדה UNL (1.5 שעות משם). (להערות על טמפרטורת השחלות במהלך התחבורה אנא ראו דיון)

  1. הכינו את רקמת השחלות על ספסל נקי(איור 1).
    1. לחטא את הספסל הנקי עם 70% אתנול. מניחים כרית ספיגה טרייה על הספסל. ודא כי מפוח הספסל הנקי מופעל חצי שעה לפני הניתוח יחד עם אור UV כדי לעקר כל דבר בספסל הנקי, כולל כרית סופג ולוודא PPE מתאים משמש.
    2. מסדרים את מנות הפטרי (60 x 15 מ"מ) לשטיפת רקמות. שלוש מנות פטרי נדרשות לשטיפת PBS, שלוש ל-PBS עם אנטיביוטיקה, ושלוש לשטיפה של LB-15. מנת פטרי נוספת המכילה LB-15 עם מכסה נלווה תשמש למיקום סופי של חתיכות לאחר הכביסה.
    3. מלאו כל צלחת פטרי בכ-10 מ"ל של נוזלים מתאימים, PBS או LB-15.

figure-protocol-3824
איור 1: פריסת צלחות לשטיפת חתיכות השחלה וקליפת המוח בספסל הנקי. (A)PBS המשמש לשטיפת השחלה כאשר חלקים מקליפת המוח מוסרים. (B)PBS עם שטיפות אנטיביוטיות שחתיכות קליפת המוח מועברות דרכן. (C)חתיכות קליפת המוח השחלתית נשטפות ארבע פעמים ב- LB-15 לפני המעבר לארון הבטיחות הביולוגית לשטיפה סופית ב- LB-15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. מוציאים מהמקרר את ה-Waymouth וה-LB-15 המוכנים.
  2. יש לאסוף את כל הכלים כדי להבטיח עיקור לפני השימוש.
  3. לשמור על השחלות ב 37 מעלות צלזיוסעד קליפת המוח השחלות מוכן לאיסוף.
  4. בעזרת מלקחיים עם לסתות משוננות, הרימו את השחלה ושטפו ביסודיות את צלחת הפטרי הראשונה במילוי PBS. מעבירים את השחלה לכביסת ה-PBS השנייה ומנקים ביסודיות פעם נוספת.
    הערה: השחלה תישאר בשטיפת PBS השנייה בזמן שפסות קליפת המוח השחלתיות מוסרות.
  5. בעזרת מלקחיים לסת משוננת, מאבטחים את השחלה ופורסים לשניים. בשלב זה, קליפת המוח השחלות תנתק מהמדולה. באמצעות סרגל, ודא כי לא יותר מ 1-2 מ"מ של עומק פני השטח של השחלה מוסר מן medulla16. הסר חלקים רוחביים של קליפת המוח השחלתית ממדולה, חתוך 3-4 רצועות דקות של קליפת המוח השחלות (איור 2) עם אזמל (להב אזמל מס '11; ידית #3), והנח את הרצועות בצלחת הפטרי השלישית המלאה PBS.
    הערה: בשלב זה, רקמת קליפת המוח השחלות נוספת ניתן לאסוף עבור מיצוי RNA או קבוע ונאסף עבור היסטולוגיה של חתיכות קליפת המוח הראשונית שאינן בתרבית. בעת הסרת רצועות של קליפת המוח השחלתית, הימנע אזורים עם זקיקי antral גלויים או corpora lutea. בנוסף, להימנע מאיסוף רקמה medullary. ההסתדרות של המדולה שונה מאוד כפי שמוצג בעבר16. אם קליפת המוח השחלות אינה חתוכה ליותר מעומק של 1-2 מ"מ, אז אין להשיג את המדולה. היסתולוגיה ברורה מאפשרת ציוני דרך בין קליפת המוח לבין המדולה.
  6. חותכים את רצועות קליפת המוח השחלתית בשטיפת PBS השלישית לחתיכות קטנות ומרובעות (~ 0.5-1 מ"מ3) עם להב אזמל #21. השתמש בסרגל מתחת לצלחות פטרי כדי להבטיח את החלקים הם בגודל ועובי דומים כדי להפוך חתיכות קליפת המוח השחלות עקבי. השתמש במלקחיים כדי לאבטח את הרצועות תוך חיתוך החלקים עם אזמל.
    הערה: מספר חלקי הרקמה שנחתכים תלוי בניסוי. ארבע חתיכות של קליפת המוח השחלתית היא הכמות המינימלית של רקמה הדרושה לתרבות. שיטות אחרות להבטחת אורך ועומק מתאימים כוללות שימוש בכלי פריסה מיוחדים26 או חתיכות פלסטיק חתוכות מראש כתבניות27.
  7. לשטוף חתיכות קליפת המוח השחלות דרך כל שלוש PBS עם צלחות פטרי מלאות באנטיביוטיקה. השתמש במלקחיים מעוקלים כדי להזיז חתיכות בין כביסות.
  8. העבר חתיכות קליפת המוח דרך הסדרה של LB-15 שטיפות ומניחים בצלחת פטרי סופית LB-15 מלא. סמן את המכסה עם מזהה בעלי חיים וצד השחלות (שמאל או ימין).
    הערה: שקועים באופן מלא בקליפת המוח השחלתית בכל שטיפה לניקוי יסודי.
  9. לאסוף ארבע חתיכות קליפת המוח השחלתית לכל שחלה ולתקן ליום אפס היסתולוגיה. חלקים נוספים יכולים גם להיות קפואים פלאש עבור RNA. שאר חלקי הרקמה ישמשו לתרבות. נגב כלי ניתוח עם 70% אתנול לאחר כל אוסף רקמות.
  10. הכן ארון בטיחות ביולוגי לשטיפת רקמות סופית והכנת תרבות. לחטא אספקה עם 70% אתנול לפני הצבה בארון הבטיחות הביולוגי. השתמש בטכניקה האספטית בעת עבודה בארון הבטיחות הביולוגי.
  11. העבירו את כל קליפת המוח השחלתית המיועדת לתרבות לארון הבטיחות הביולוגי ושטפו פעם נוספת בצלחת פטרי מלאה LB-15.
  12. בצלחת תרבית רקמות 24-well, פיפטה 350 μL של מדיום Waymouth לבאר.
  13. מניחים היטב את התרבות הלא מכווצת לכל באר באמצעות מלקחיים. ודא כי אין בועות נוצרות תחת הבסיס של הכנס כמו זה יגרום הרקמה להתייבש. המדיום חייב לגעת בתוספות כדי לאפשר למדיום להיספג ולהקיף את חתיכות קליפת המוח השחלתית.
  14. מקם בזהירות ארבע חתיכות קליפת המוח השחלתית על הרשת של כל תוספת(איור 2). המלקחיים יכולים לנקב את הרשת אם חתיכות הרקמה אינן ממוקמות בעדינות. חתיכות הרקמה לא אמורות לגעת זו בזו או בצד של ההוספה.
  15. לדגור את הרקמה ב 37 מעלות צלזיוסעם 5% CO216.
    הערה: אחרים השתמשו 38.8 מעלות צלזיוס28. עם זאת, לא נצפתה הבדל בשלמות הרקמה ולא ביכולתם של זקיקים להתקדם ברקמת 37 מעלות צלזיוסוגם לא אחרים39,30. לכן, בשלב זה כל הטמפרטורות האלה צריך להיות תורם להצלחה ניסוי. אחרים השתמשו 400 μL של בינוני. כל כמות היא בסדר כל עוד אחד עקבי, ואת הרקמה הוא שקוע חלקית המאפשר מתח פני השטח נאותה כדי לאפשר הידרציה של רקמות (מדיה סביב חתיכות קליפת המוח השחלתית). מלא בארות ריקות עם 500 μL של מים סטריליים כדי לעזור להפחית את האידוי מבארות אחרות.

figure-protocol-8603
איור 2: חתיכות קליפת המוח השחלתית וצלחת התרבות. (A)רצועה שחלתית שנחתכת מקליפת המוח של השחלה. (B)פיסת הסרגל וקליפת המוח מוצגת זו לצד זו. (C)ארבעה חתיכות קליפת המוח (~ 0.5-1 מ"מ3) נח על ההוספה במדיום התרבות בצלחת. (ד)הרמת התוספת כדי לאסוף את מדיום התרבות מהבאר. לאסוף ולהחליף את כל מדיום התרבות מדי יום (250 μL) כדי לשמור על pH.כ 250 μL מתקבל מכל באר בכל יום (כ 70% של מדיום התרבות הראשונית). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

3. אוסף מדיה

  1. לשנות את תרבות קליפת המוח השחלות מדי יום במשך 7 ימים. שינויים בינוניים צריכים להיות קרובים ככל האפשר ל-24 שעות זה מזה כדי למנוע שינויי pH וצבע גדולים במדיום. חום Waymouth בינוני עד 37 °C (50 °F) לפני שינוי בינוני. כ 250 μL מתקבל מכל באר בכל יום (כ 70% של מדיום התרבות הראשונית).
  2. במהלך שינויים בינוניים, יש להשתמש במלקחיים כדי להרים בעדינות את ההוספה מהבאר. לאסוף את מדיום Waymouth תרבותי בצינורות 0.5 מ"ל (כ 250 μL ליום). הגדר את ההוספה בחזרה היטב ולהוסיף 350 μL של מדיום תרבות טרי על ידי חלוקת המדיום בין הצד של ההוספה היטב.
    הערה: לשנות את רוב התקשורת מדי יום כדי להשיג מספיק מדיה כדי למדוד את כל הסטרואידים, ציטוקינים, וכימותרפיה הדרושים כדי לקבוע microenvironment השחלות. כמו כן, שינויים בינוניים יומיים חשובים כדי למנוע שינויים גדולים pH (מסומן על ידי שינוי צבע) במדיום. טיפות של מדיום נשמרו סביב חתיכות קליפת המוח השחלתית כדי להבטיח את החלקים נשאר רטוב. לא נצפו בעיות עם רקמה בתרבית עקב שינוי 70% מהתקשורת.
  3. לאחסן את המדיום שנאסף מתרבית הרקמות ב -20 מעלות צלזיוס.

4. הדמיה ועיבוד במורד הזרם

  1. לאחר 7 ימים של תרבות ב 37 מעלות צלזיוסעם 5% CO2, תמונה חתיכות קליפת המוח השחלתית באמצעות מיקרוסקופ ביתוח עם מצלמה מחוברת ותוכנת הדמיה ממוחשבת.
    הערה: חדר חשוך הוא בדרך כלל הטוב ביותר להשגת איכות התמונה הטובה ביותר להדמיה.
  2. לאחר ההדמיה, לתקן שתי חתיכות קליפת המוח השחלתית לבאר ב Bouins עבור היסתולוגיה ולהקפיא פלאש שתי חתיכות קליפת המוח השחלתית בחנקן נוזלי כדי להשיג RNA עבור cDNA. חזור על שלב זה עבור כל בארות עם רקמה. לאסוף את המדיום מיום 7 ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
  3. תן חתיכות קליפת המוח השחלות להישאר שקוע בוינס (חומצה פיקרית 750 מ"ל, חומצה אצטית קרחונית 50 מ"ל, ו 37%-40% פורמלין 250 מ"ל) במשך כ 1.5 שעות לפני שטוף עם 70% אתנול שלוש פעמים. הרקמה תישאר ב 70% אתנול ותנוקה מדי יום עד שהתמיסה כבר לא צהובה.
    הערה: ניתן להשתמש בתיקונים שאינם בוינס כמו גם paraformaldehyde. ב experiement זה Bouins משמש כפי שהוא הקיבוטיב כדי להשיג מורפולוגיה אופטימלית. אם דרושה רקמה נוספת לניתוח אחר, ניתן להשיג בארות נוספות של מדיה וחתיכות של קליפת המוח השחלתית מכל בעל חיים.

תוצאות

הליך זה של תרבית קליפת המוח בקר יכול לשמש כדי לקבוע מגוון רחב של הורמונים, ציטוקינים, ונתונים היסטולוגיים מחתיכות קטנות של השחלה. כתמים, כגון המטוקסילין ואוסין (H&E), יכולים לשמש לקביעת מורפולוגיה של השחלות באמצעות בימוי זקיק16,23,31

Discussion

היתרון של תרבות קליפת המוח השחלתית במבחנה, כפי שמתואר בכתב יד זה, הוא שהזקיקים מתפתחים בסביבה מנורמלת עם סטרומה סמוכה המקיפה את הזקיקים. התאים הסומטיים והבוציטים נשארים שלמים, ויש תקשורת מתאימה בין תא לתא כמודל in vivo. המעבדה שלנו מצאה כי מערכת תרבית 7 ימים מספקת folliculogenesis נציג ונתונים steroidogenes...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי למזון וחקלאות 2013-67015-20965 ל- ASC, אוניברסיטת נברסקה מזון לבריאות מענקים תחרותיים ASC. ארצות הברית מחלקת החקלאות האץ' להעניק NEB26-202/W3112 גישה #1011127 ASC, האץ'-NEB גישה ANHL #1002234 ASC. תמיכה בפוסט דוקטורט של יוזמת מדעי החיים הכמותית – פרס COVID-19 למימון הקיץ עבור CMS.

המחברים רוצים להרחיב את הערכתם לד"ר רוברט קושמן, המרכז לחקר בעלי חיים בשר בארה"ב, קליי סנטר, NE כדי להודות לו על מתן השחלות בפרסום קודם, אשר שימשו אז במאמר הנוכחי כהוכחת מושג באימות טכניקה זו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
#11 Scapel BladeSwann-Morton 303Scaple Blade
#21 Scapel BladeSwann-Morton 307Scaple Blade
500mL Bottle Top FilterCorning430514Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium
AbsoluteIDQ Sterol17 AssayBiocratesSterol17 KitSamples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned 
Androstenedione Double Antibody RIA KitMPBio7109202RIA to determine androstenedione from culture medium
Belgium A4 Assay Kit DIA Source KIP0451RIA to determine androstenedione from culture medium
Bovine Cytokine Array Q3RayBiotechQAB-CYT-3-1Cytokine kit to determine cytokines from culture medium
cellSens Software Standard 1.3Olympus7790Imaging Software
Insulin-Transferrin-Selenium-XGibco ThermoFisher Scientific5150056Addative to the culture medium
Leibovitz's L-15 MediumGibco ThermoFisher Scientific4130039Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet 
Microscope OlympusSZX16Disection microscope used for imaging tissue culture pieces 
Microscope Camera OlympusDP71Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces 
Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm DiameterMillipore SigmaPICM01250Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it
Multiwell 24 well plateFalcon353047Plate used to hold meduim, inserts, and tissues
Petri dish 60 x 15 mmFalcon351007Petri dish used for washing steps prior to culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X)Corning21-040-CVUsed for tissue washing
SAS Version 9.3SAS Institute 9.3 TS1M2Statistical analysis software 
Thomas Stadie-Riggs Tissue SlicerThomas Scientific6727C10Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue
Waymouth MB 752/1 MediumSigma-AldrichW1625Medium used for tissue cultures

References

  1. Braw-Tal, R., Yossefi, S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary. Journal of Reproduction and Fertility. 109, 165-171 (1997).
  2. Nilsson anEdson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
  3. Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. 163, 53-60 (2000).
  4. Ireland, J. J. Control of follicular growth and development. Journal of Reproduction and Fertility. 34, 39-54 (1987).
  5. Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
  6. Ramezani, M., Salehnia, M., Jafarabadi, M. Short term culture of vitrified human ovarian cortical tissue to assess the cryopreservation outcome: molecular and morphological analysis. Journal of Reproduction & Infertility. 18 (1), 162-171 (2017).
  7. McLaughlin, M., Telfer, E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
  8. Stefansdottir, A., Fowler, P. A., Powles-Glover, N., Anderson, R. A., Spears, N. Use of ovary culture techniques in reproductive toxicology. Reproductive Toxicology. 49, 117-135 (2014).
  9. Bromfield, J. J., Sheldon, I. M. Lipopolysaccharide reduces the primordial follicle pool in the bovine ovarian cortex ex vivo and in the murine ovary in vivo. Biology of Reproduction. 88 (4), 1-9 (2013).
  10. Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Humane Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
  11. Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicological Sciences. 90 (2), 500-509 (2006).
  12. Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biology of Reproduction. 75, 56-67 (2006).
  13. Baltes-Breitwisch, M. M., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms or administration of proangiogenic isoforms stimulates vascular development in the rat testis. Reproduction. 140 (2), 319-329 (2010).
  14. McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biology of Reproduction. 81, 966-977 (2009).
  15. Artac, R. A., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms is more effective than treatment with proangiogenic isoforms in stimulating vascular development and follicle progression in the perinatal rat ovary. Biology of Reproduction. 81, 978-988 (2009).
  16. Abedal-Majed, M. A., et al. Vascular endothelial growth factor A isoforms modulate follicle development in peripbertal heifers independent of diet through diverse signal transduction pathways. Biology of Reproduction. 102 (3), 680-692 (2020).
  17. Wandji, S. A., Srsen, V., Voss, A. K., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation in vitro of bovine primordial follicles. Biology of Reproduction. 55, 942-948 (1996).
  18. Wandji, S. A., Srsen, V., Nathanielsz, P. W., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation of growth of baboon primordial follicles in vitro. Human Reproduction. 12 (9), 1993-2001 (1993).
  19. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Testosterone stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Biology of Reproduction. 75, 924-932 (2006).
  20. Fortune, J. E., Kito, S., Wandji, S. A., Srsen, V. Activation of bovine and baboon primordial follicles in vitro. Theriogenology. 49, 441-449 (1998).
  21. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Vascular endothelial growth factor stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Molecular Reproduction and Development. 74, 1095-1104 (2007).
  22. Barberino, R. S., Silva, J. R. V., Figueiredo, J. R., Matos, M. H. T. Transport of domestic and wild animal ovaries: a review of the effects of medium, temperature, and periods of storage on follicular viability. Biopreservation and Biobanking. 17 (1), 84-90 (2019).
  23. Summers, A. F., et al. Altered theca and cumulus oocyte complex gene expression, follicular arrest and reduced fertility in cows with dominant follicle follicular fluid androgen excess. PLoS One. 9 (10), e110683 (2014).
  24. Koal, T., Schmiederer, D., Pham-Tuan, H., Rohring, C., Rauh, M. Standardized LC-MS/MS based steroid hormone profile analysis. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 129, 129-138 (2012).
  25. Poole, R. K., Brown, A. R., Pore, M. H., Pickworth, C. L., Poole, D. H. Effects of endophyte-infected tall fescue seed and protein supplementation on stocker steers: II. Adaptive and innate immune function. Journal of Animal Science. 97 (10), 4160-4170 (2019).
  26. Laronda, M., et al. Alginate encapsulation supports the growth and differentiation of human primordial follicles within ovarian cortical tissue. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (8), 1013-1028 (2014).
  27. Silber, S. J., et al. A series of monozygotic twins discordant for ovarian failure: ovary transplantation (cortical versus microvascular) and cryopreservation. Human Reproduction. 23 (7), 1531-1537 (2008).
  28. Wiedemann, C., Zahmel, J., Jewgenow, K. Short-term culture of ovarian cortex pieces to assess the cryopreservation outcome in wild fields for genome conservation. BMC Veterinary Research. 9 (37), (2013).
  29. Baufeld, A., Vanselow, J. Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells. Cell and Tissue Research. 354 (3), 869-880 (2013).
  30. Shimizu, T., Miyamoto, A. Progesterone induces the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) 120 and Flk-1, its receptor, in bovine granulosa cells. Animal Reproduction Science. 102 (3-4), 228-237 (2007).
  31. Tepekoy, F., Akkoyunlu, G. The effect of FSH and activin A on Akt and MAPK1/3 phosphorylation in cultured bovine ovarian cortical strips. Journal of Ovarian Research. 9 (13), 1-9 (2016).
  32. Beck, K., Singh, J., Arshud Dar, M., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
  33. Eppig, J. J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals. Reproduction. 122 (6), 829-838 (2001).
  34. Paczkowski, M., Silva, E., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Comparative importance of fatty acid beta-oxidation to nuclear maturation, gene expression, and glucose metabolism in mouse, bovine, and porcine cumulus oocyte complexes. Biology of Reproduction. 88 (5), 1-11 (2013).
  35. Raffel, N., et al. Is ovarian tissue transport at supra-zero temperatures compared to body temperature optimal for follicle survival?. In Vivo. 34 (2), 533-541 (2020).
  36. Duncan, F., et al. Ovarian tissue transport to expand access to fertility preservation: from animals to clinical practice. Reproduction (Cambridge, England). 152 (6), R201-R210 (2016).
  37. Liebenthron, J., et al. Overnight ovarian tissue transportation for centralized cryobanking: a feasible option. Reproductive BioMedicine Online. 38 (5), 740-749 (2019).
  38. Mohammed, B. T., Donadeu, F. X. Bovine granulosa cell culture. Epithelial Cell Culture: Methods and Protocols. , 79-87 (2018).
  39. Langbeen, A., et al. Effects of neutral red assisted viability assessment on the cryotolerance of isolated bovine preantral follicles. Journal of Assisted Reproduction Genetics. 31, 1727-1736 (2014).
  40. Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
  41. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Changes in the transcriptome of bovine ovarian cortex during follicle activation in vitro. Physiological Genomics. 47, 600-611 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

167

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved