哮喘鼠模型中的针灸

摘要

高平台可以不受限制地修复大鼠，并在针灸操作期间完全暴露背部的穴位。本文描述了制造高平台的方法，建立了哮喘的老鼠模型，并使用非侵入性和实时全身全息摄影（WBP）系统测量呼吸功能的变化。

摘要

高平台可以不受限制地修复大鼠，并在针灸操作期间完全暴露背部的穴位。本文描述了制造高平台的方法，建立了哮喘的老鼠模型，并使用非侵入性和实时全身全息摄影（WBP）系统测量呼吸功能的变化。

引言

哮喘是一种慢性疾病，其特征是支气管收缩和气道反应^过度。全世界约有3.394亿人被诊断患有哮喘^2。全球哮喘患病率正在上升，预计未来十年将新增1亿例^。吸入皮质类固醇和长效β 2-agonists不能有效地控制所有患者的症状⁴。因此，使用针灸等替代疗法治疗哮喘已受到^{越来越多的关注。}治疗哮喘的有效方法是针GV14（大泽），双边BL12（丰门）和双边BL13（飞舒^）6。针灸显著降低过敏性哮喘患者唾液和鼻分泌物中分泌免疫球蛋白A（SIgA）的水平，减少周围血液中嗜血球菌的计数，总有效率为85%⁶。慢性哮喘小鼠的BL13和ST36（Zusanli）针灸可降低IL-17水平40%，与椭圆形布明（OVA）组相比，平滑肌肉厚度降低33%，从而缓解炎症症状^7、8。然而，哮喘针灸治疗的机制并不完全清楚。

动物模型是哮喘研究的重要工具^9，因为动物模型可用于持续测量呼吸功能，以评估哮喘治疗¹⁰的有效性。同时，哮喘病理生理学的研究需要测试样本，包括气管、肺和支气管厕所的样本，以验证关键因素¹¹水平的变化。哮喘的老鼠模型通常用于评估哮喘病理生理学，因为它们产生持久的气道反应，并显示即时和后期气道反应^12。然而，由于反复的实验刺激，大鼠往往变得易怒。因此，需要一种合适的方法来修复老鼠。常用的老鼠固定方法包括麻醉和结合^13。虽然麻醉方法提供了更好的暴露穴位，它可能会影响神经传导，并最终影响实验结果^14。结合方法不会诱导与麻醉相同的生理效果，但受约束的老鼠会经历骨骼肌肉紧张。此外，针头不能轻易到达指定位置^15。在这里，我们引入了一个高平台，可用于修复大鼠，而无需限制它们，并充分暴露背面的穴位。在针灸管理期间，大鼠可以放在高平台上。高平台只能容纳老鼠，因为它被放置在离地面一定距离的地方，老鼠不会移动，因为害怕高度^16。

本文详细描述了高平台的制造、哮喘鼠模型的建立、高平台上需要大鼠的操作以及使用全身全息摄影（WBP）系统测量呼吸功能。

研究方案

所有动物实验均经上海中医药大学动物实验伦理委员会审核通过（伦理许可号PZSHUTCM190308020）。

1. 高平台的制造

1. 将支撑装置的长度和宽度设置为 86 厘米 x 17 厘米（图 1）。
2. 垂直修复连接设备以连接到支持设备。连接装置应长约30厘米，以防止大鼠跑到高平台的顶部表面，宽度为14厘米。
3. 将水平踏板（5 厘米 x 5 厘米）固定到连接设备上。水平踏板底部的悬浮高度应大于或等于 50 厘米。
   注:根据实验鼠的数量，可以使用多个水平踏板，每个踏板上放置一只大鼠。

2. 建立哮喘的老鼠模型

1. 用 OVA 使大鼠敏感
   1. 在第 0 天准备感化解决方案。用1毫克OVA和10毫克氢氧化铝准备每1毫升的感化溶液，以普通盐水作为溶剂。
   2. 在第0天给每只大鼠注射1mL的敏感溶液。使用合适的注射器绘制感性解决方案，供以后使用。
   3. 抓住尾巴，抬起老鼠，放在粗糙的表面上，轻轻地把尾巴拉回来。用左拇指和食指抓住耳朵和脖子的皮肤，同时用剩下的三根手指和手掌紧紧握住背部皮肤（小心不要施加会窒息老鼠的过度力）。
   4. 用右手，用1mL的感官溶液准备注射器，在大鼠中进行腹膜内注射。
2. 挑战大鼠与OVA
   1. 选择带盖子的盒子（长度、宽度和高度为 39 厘米 x 28 厘米 x 23 厘米），并在侧面钻一个小孔。用橡胶管连接密封的盒子、雾化杯和压缩雾化器（补充图1）。
      注:压缩雾化器的星云粒子大小为1-5微米，雾化率大于0.2 mL/min，最终压力为205 kPa。
   2. 在敏感后的第14天，打开自制密封盒的盖子，将老鼠放在盒子里（盒子可以容纳5只老鼠），然后把密封的盒子放在一个生物安全柜里。
   3. 准备挑战解决方案。将300毫克OVA与30毫升普通盐水彻底混合。
   4. 打开超声波雾化器，将 30 mL 的挑战解决方案添加到雾化杯中。根据自制密封盒的体积调整挑战溶液的剂量和大鼠数量。
   5. 重复数次（每天一次）或根据哮喘症状的严重程度调整程序。

3. 针灸治疗

1. 根据治疗哮喘的中医理论，选择包括GV14、双边BL12和双边BL13在内的穴位（补充图2）。在第2天进行手动针灸，每隔一天进行一次，共7次（图2）。
   1. 针灸GV14位于第七颈椎和第一胸椎（肩骨的空心）之间，在背部中线（图3）。
   2. 针灸 BL13 位于第三个胸椎以下，位于腹腔间空间的两侧（肩骨的下边缘）。
   3. 针灸 BL12 位于第二个胸椎以下，位于间歇空间的两侧（在肩骨下方，根据 BL13 确定的位置）。
2. 抓住老鼠，把它们放在高高的平台上。
3. 用右手拇指和食指握住一次性不锈钢针（0.3毫米 x 13.0 毫米， 辅助图 3）手柄，用右手手掌按鼠背。
   注:一次性针头必须仅一次性使用。因为反复使用会使针头钝化，从而增加大鼠的疼痛。
4. 触摸上边缘 （GV14） 或肩骨下边缘 （BL12 和 BL13） 中间的凹陷，然后用针尖轻轻刺破大鼠的皮肤以定位穴位。
5. 确定穴位的具体位置后，快速插入针头，并迅速移除右手。
6. 均匀地扭动针头约360°，速度为60次/分钟，10-20秒，每5分钟操纵一次，然后在20-30分钟后取出（补充图4）。

4. 笔测量

1. 准备甲基苯甲基苯甲酰:将100毫克甲基胆碱放入5mL离心管中，并将PBS添加到2mL（50毫克/mL甲基苯甲酰胆碱）的体积中。然后，将 50 毫克/mL 甲基胆碱溶液稀释到 25 毫克/mL、12.5 毫克/mL、6.25 毫克/mL 和 3.125 毫克/mL。
2. 仪器检查
   1. 打开信号放大器（气溶胶分布系统和啮齿动物偏置流供应系统全部关闭，星云连接器关闭）。
   2. 检查通道:单击 校准，将粗调整基线返回到 0，然后切换到直流 （DC） 位置。将基线微调到 0，用注射器注入 5 mL 气体。然后，切换到交替电流 （AC） 位置。
   3. 检查通道后，确保误差值小于 0.5%。
3. 设置参数
   1. 打开气溶胶分布系统和啮齿动物偏置流供应系统。根据汞球上的液体水平将流速调整到 4.5 mL。
   2. 点击 创建研究选项 ，并选择 剂量响应研究，选择 老鼠 的物种，并点击 下一步。
   3. 选择 简单的剂量列表，将 剂量数 设置为 6， 然后单击 下一个。
   4. 选择 Penh 和 区域 参数:将动物适应时间设置为 5 分钟，雾化时间设置为 2 分钟，响应时间设置为 3 分钟，恢复时间设置为 2 分钟。
   5. 依次向雾化器添加以下解决方案（每只大鼠 200 μL）:甲基胆碱（0 毫克/mL、3.125 毫克/mL、6.25 毫克/mL、12.5 毫克/mL、25 毫克/mL 和 50 毫克/mL）。可以观察到 Penh 的实时变化 （图 4）。
   6. 在响应所有 6 种不同浓度的解决方案后，单击 "文件 "和 "结束会话 "以完成实验。

结果

在GV14、双边BL12和双边BL13点进行针灸时，大鼠保持一个容易的位置。老鼠只能把头扭到外面，不能扭到里面，因为一个方向被木板挡住了（图5）。

随着甲基苯甲酰浓度的增加，Penh 呈现出上升趋势，增长率逐渐增加。浓度为3.125毫克/千升、6.25毫克/千升、12.5毫克/mL、25毫克/mL和50毫克/千升， Penh 增长 18.40% ± 10.70%， 27.55% ± 26.30%， 88.10% ± 45.63 %，427.60%±17...

讨论

本研究中使用的GV14、双边BL12和双边BL13穴位位于背面，因此高平台适合固定大鼠。在其他研究中，应根据穴位¹⁵的位置选择适当的固定方法。对于腹部的穴位，大鼠可以向下放置在一个黑色的圆锥体（类似于面包师使用的糕点袋^）17。链条连接到约束锥固定，大鼠的后腿也固定。这样，动物身体的前部被牢牢地固定在圆锥体中，而腹部和背部则暴露在外。对于腿...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mm x 13.0 mm acupuncture needle	China Suzhou Medical Device Factory
Al(OH)3	American Thermo	77161
Compression nebulizer	Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd.	NB-212C
Fine Pointe V2.0	American Buxco
Laboratory gas drying unit	American Drierite	26800
Methacholine	American Sigma	MKCF6054
Ovalbumin	American Sigma	A5503-25G
Phosphate Buffer solution (1x)	Gelifesciences	SH30256.01
Seal box	IRIS Corporation of Japan
Whole-body plethysmography respiratory function measurement system	American Buxco