Akupunktur in einem Rattenmodell von Asthma

Zusammenfassung

Eine hohe Plattform kann Ratten ohne Einschränkung fixieren und die Akupunkte auf dem Rücken während der Akupunkturmanipulation vollständig freilegen. Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Herstellung der hohen Plattform, legt ein Rattenmodell von Asthma fest und misst Veränderungen der Atemfunktion mit einem nichtinvasiven und Echtzeit-Ganzkörper-Plethysmographie(WBP)-System.

Zusammenfassung

Eine hohe Plattform kann Ratten ohne Einschränkung fixieren und die Akupunkte auf dem Rücken während der Akupunkturmanipulation vollständig freilegen. Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Herstellung der hohen Plattform, legt ein Rattenmodell von Asthma fest und misst Veränderungen der Atemfunktion mit einem nichtinvasiven und Echtzeit-Ganzkörper-Plethysmographie(WBP)-System.

Einleitung

Asthma ist eine chronische Krankheit, die durch Bronchokonstriktion und Atemwegs-Hyper-Responsiveness¹gekennzeichnet ist. Weltweit werden bei rund 339,4 Millionen Menschen Asthma diagnostiziert². Die Prävalenz von Asthma nimmt weltweit zu, wobei 100 Millionen neue Fälle in den nächsten zehn Jahren erwartet werden³. Eingeatmete Kortikosteroide und lang wirkende β 2-Agonisten kontrollieren nicht effektiv die Symptome aller Patienten⁴. Daher hat die Verwendung von alternativen Therapien wie Akupunktur zur Behandlung von Asthma erhöhte Aufmerksamkeit erhalten⁵. Eine wirksame Methode zur Behandlung von Asthma ist die Nadel VON GV14 (Dazhui), bilateralBL12 (Fengmen) und bilateralBL13 (Feishu)⁶. Akupunktur reduziert signifikant den Gehalt an sekretorischem Immunglobulin A (SIgA) im Speichel und Nasensekreten von Patienten mit allergischem Asthma und reduziert periphere Eosinophile im Blut mit einer Gesamtwirksamkeit von 85%⁶. Akupunktur bei BL13 und ST36 (Zusanli) bei Mäusen mit chronischem Asthma verringert das Il-17-Niveau um 40% und verringert die glatte Muskeldicke um 33% im Vergleich zur Ovalbumin-Gruppe (OVA) und damit Linderung der Entzündungssymptome^7,8. Der Mechanismus der Akupunkturbehandlung bei Asthma ist jedoch nicht ganz klar.

Tiermodelle sind ein wichtiges Werkzeug für die Asthmaforschung^9, da das Tiermodell für die kontinuierliche Messung der Atemfunktion verwendet werden kann, um die Wirksamkeit der Asthmabehandlung zu bewerten¹⁰. In der Zwischenzeit erfordern Studien der Pathophysiologie von Asthma Testproben, einschließlich Proben aus der Luftröhre, Lunge und Bronchoalveolar-Lavage, um Veränderungen in den Konzentrationen der Schlüsselfaktoren zu überprüfen¹¹. Rattenmodelle von Asthma werden häufig verwendet, um Asthmapathophysiologie zu bewerten, weil sie langanhaltende Atemwegsreaktionen erzeugen und sofortige und spätphasenige Atemwegsreaktionen zeigen¹². Aufgrund der wiederholten experimentellen Stimulation werden die Ratten jedoch oft reizbar. Daher ist eine geeignete Methode zur Behebung von Ratten erforderlich. Häufig verwendete Methoden zur Rattenfixierung umfassen Anästhesie und Bindung¹³. Obwohl die Anästhesiemethode eine bessere Exposition der Akupunkte bietet, kann sie die Nervenleitung beeinflussen und letztlich die experimentellen Ergebnisse beeinflussen¹⁴. Die Bindungsmethode induziert nicht die gleichen physiologischen Wirkungen wie Anästhesie, aber zurückhaltende Ratten werden Skelettmuskelverspannungen erleben. Auch kann die Nadel nicht leicht die vorgesehene Position¹⁵erreichen. Hier führen wir eine hohe Plattform ein, die verwendet werden kann, um Ratten zu reparieren, ohne sie einzuschränken und die Akupunkte auf der Rückseite vollständig freizulegen. Die Ratten können während der Verabreichung der Akupunktur auf die hohe Plattform gestellt werden. Die hohe Plattform ist in der Lage, die Ratte nur zu beherbergen, während sie steht, und da sie einen gewissen Abstand vom Boden platziert wird, werden sich die Ratten aus Angst vor Höhen¹⁶nicht bewegen.

Dieser Artikel beschreibt detailliert die Herstellung der hohen Plattform, die Etablierung eines Rattenmodells von Asthma, den Betrieb der Notwendigkeit einer Ratte auf der hohen Plattform und die Messung der Atemfunktion mit einem Ganzkörper-Plethysmographie-System (WBP).

Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Committee on the Ethics of Animal Experiments der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (Ethical clearance number PZSHUTCM190308020) überprüft und genehmigt.

1. Herstellung der hohen Plattform

1. Längen und Breite des Trägers auf 86 cm x 17 cm einstellen (Abbildung 1).
2. Befestigen Sie das Verbindungsgerät vertikal am unterstützenden Gerät. Die Verbindungsvorrichtung sollte ca. 30 cm lang sein, um zu verhindern, dass die Ratte auf die Oberseite der hohen Plattform läuft und eine Breite von 14 cm hat.
3. Befestigen Sie das horizontale Pedal (5 cm x 5 cm) am Anschlussgerät. Die aufgehängte Höhe an der Unterseite des horizontalen Pedals sollte größer oder gleich 50 cm sein.
   HINWEIS: Je nach Anzahl der experimentellen Ratten können mehrere horizontale Pedale verwendet werden, wobei eine Ratte auf jedem Pedal platziert wird.

2. Erstellung eines Rattenmodells von Asthma

1. Sensibilisierung der Ratten mit OVA
   1. Bereiten Sie die Sensibilisierungslösung am 0. Tag vor. Bereiten Sie jede 1 ml der Sensibilisierungslösung mit 1 mg OVA und 10 mg Aluminiumhydroxid, mit normaler Saline als Lösungsmittel vor.
   2. Intraperitoneal injizieren jede Ratte mit 1 ml der Sensibilisierungslösung am Tag 0. Zeichnen Sie die Sensibilisierungslösung mit einer geeigneten Spritze für die spätere Anwendung.
   3. Schnappen Sie sich den Schwanz und heben Sie die Ratte, legen Sie sie auf eine raue Oberfläche, und ziehen Sie den Schwanz sanft zurück. Greifen Sie die Haut von beiden Ohren und Hals mit dem linken Daumen und Zeigefinger, während fest halten die hintere Haut mit den verbleibenden drei Fingern und Handflächen (achten Sie darauf, auf übermäßige Kraft, die die Ratte ersticken wird verzichten).
   4. Mit der rechten Hand eine intraperitoneale Injektion in die Ratte mit der vorbereiteten Spritze mit 1 ml der Sensibilisierungslösung durchführen.
2. Herausfordernde Ratten mit OVA
   1. Wählen Sie eine Box mit Deckel (Länge, Breite und Höhe sind 39 cm x 28 cm x 23 cm), und bohren Sie ein kleines Loch in die Seite. Verbinden Sie die versiegelte Box, den Verneblerbecher und den Kompressionsvernebler mit einem Gummirohr (Zusatzabbildung 1).
      ANMERKUNG: Die vernebelte Partikelgröße des komprimierten Verneblers beträgt 1 - 5 m, die Vernebelungsrate ist größer als 0,2 ml/min und der Enddruck beträgt 205 kPa.
   2. Am 14. Tag nach der Sensibilisierung öffnen Sie den Deckel der selbstgebastelten versiegelten Box und legen Sie die Ratte in die Box (die Box kann 5 Ratten aufnehmen), und legen Sie dann die versiegelte Box in einen Biosicherheitsschrank.
   3. Bereiten Sie die Herausforderungslösung vor. 300 mg OVA mit 30 ml normaler Saline gründlich mischen.
   4. Schalten Sie den Ultraschallvernebler ein und fügen Sie 30 ml der Challenge-Lösung in den Vernebelbecher ein. Passen Sie die Dosierung der Challenge-Lösung und die Anzahl der Ratten nach dem Volumen der hausgemachten versiegelten Box.
   5. Wiederholen Sie die Vernebelung mehrmals (einmal täglich) oder passen Sie das Verfahren an die Schwere der Asthmasymptome an.

3. Akupunkturbehandlung

1. Wählen Sie Akupoints, einschließlich GV14, bilateral BL12 und bilateral BL13, nach der Theorie der traditionellen chinesischen Medizin zur Behandlung von Asthma (Ergänzende Abbildung 2). Manuelle Akupunktur am 2. Tag verabreichen und einmal jeden zweiten Tag für insgesamt 7 Sitzungen durchführen (Abbildung 2).
   1. Akupunktur der GV14 befindet sich zwischen dem siebten Halswirbel und dem ersten Brustwirbel (die Mulde des Schulterblattes), auf der Mittellinie des Rückens (Abbildung 3).
   2. Akupunktur der BL13 befindet sich unterhalb des dritten Brustwirbels, auf beiden Seiten der interkostalen Räume (untere Kante des Schulterblattes).
   3. Akupunktur der BL12 befindet sich unterhalb des zweiten Brustwirbels, auf beiden Seiten der interkostalen Räume (unter dem Schulterblatt, Position nach BL13 identifiziert).
2. Greifen Sie die Ratten und legen Sie sie auf die hohe Plattform.
3. Halten Sie den Einweg-Edelstahlnadel (0,3 mm x 13,0 mm, Zusatzabbildung 3) mit dem Daumen und Zeigefinger der rechten Hand, und drücken Sie die Rückseite der Ratte mit der Handfläche der rechten Hand.
   HINWEIS: Einwegnadeln dürfen nur einmalverwendet werden. Denn die wiederholte Anwendung stumpft die Nadel ab, was zu erhöhten Schmerzen bei Ratten führt.
4. Berühren Sie die Depression in der Mitte der oberen Kante (GV14) oder der unteren Kante des Schulterblattes (BL12 und BL13), und stechen Sie dann sanft die Haut der Ratte mit der Nadelspitze, um die Akupunkte zu lokalisieren.
5. Setzen Sie die Nadel schnell ein, nachdem Sie die spezifische Position des Acupoint bestimmt haben, und entfernen Sie schnell die rechte Hand.
6. Gleichmäßig die Nadeln ca. 360° bei einer Rate von 60 mal/min für 10 - 20 s drehen, alle 5 min manipulieren und dann nach 20 - 30 min zurückziehen(Zusatzabbildung 4).

4. Die Penh-Messung

1. Bereiten Methacholin: Platz 100 mg Methacholin in eine 5 ml Zentrifugenröhre und fügen Sie PBS zu einem Volumen von 2 ml (50 mg/ml Methacholin). Anschließend die 50 mg/ml Methacholinlösung auf 25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 6,25 mg/ml und 3,125 mg/ml verdünnen.
2. Instrumenteninspektion
   1. Schalten Sie den Signalverstärker ein (das Aerosolverteilungssystem und das Nagetier-Bias-Flow-Versorgungssystem sind alle ausgeschaltet, und der Vernebelungsanschluss ist geschlossen).
   2. Kanal überprüfen: Klicken Sie auf Kalibrieren, geben Sie die grobe Einstellungsbasislinie auf 0 zurück und wechseln Sie zur Gleichstromposition (DC). Feinabstimmung der Ausgangsbasis auf 0 und Injizieren Sie 5 ml Gas mit einer Spritze. Wechseln Sie dann in die Wechselstromposition (AC).
   3. Stellen Sie nach der Überprüfung der Kanäle sicher, dass der Fehlerwert kleiner als 0,5 % ist.
3. Einstellen von Parametern
   1. Schalten Sie das Aerosolverteilungssystem und das Nagetier-Bias-Flow-Versorgungssystem ein. Stellen Sie den Durchfluss auf 4,5 ml entsprechend dem Flüssigkeitsstand auf der Quecksilberkugel ein.
   2. Klicken Sie auf Studienoptionen erstellen und wählen Sie Dosisreaktionsstudieaus , wählen Sie Ratte der Art aus, und klicken Sie auf Weiter.
   3. Wählen Sie Einfache Dosisliste, legen Sie die Anzahl der Dosen auf 6 fest und klicken Sie auf Weiter.
   4. Wählen Sie die Penh- und Area-Parameter: Stellen Sie die Anpassungszeit des Tieres auf 5 min, die Vernebelungszeit auf 2 min, die Reaktionszeit auf 3 min und die Erholungszeit auf 2 min.
   5. Fügen Sie dem Vernebler sequenziell folgende Lösungen hinzu (200 l pro Ratte): Methacholin (0 mg/ml, 3,125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml und 50 mg/ml). Echtzeit-Änderungen in Penh sind zu beobachten (Abbildung 4).
   6. Nachdem alle 6 Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen reagiert wurden, klicken Sie auf Datei und Endsitzung, um das Experiment abzuschließen.

Ergebnisse

Mit Akupunktur am GV14, bilateralen BL12 und bilateralen BL13 Punkten behält die Ratte eine anfällige Position. Die Ratte kann ihren Kopf nur nach außen und nicht nach innen drehen, weil eine Richtung mit einem Holzbrett blockiert ist (Abbildung 5).

Als die Methacholin-Konzentration zugenommen, Penh zeigt einen steigenden Trend und die Wachstumsrate allmählich erhöht. Bei Konzentrationen von 3,125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml und 50 mg/ml, Penh sti...

Diskussion

Die in dieser Studie verwendeten GV14, bilateralen BL12- und bilateralen BL13-Akupoints befinden sich auf der Rückseite und somit eignet sich die hohe Plattform für die Fixierung von Ratten. In anderen Studien sollte eine angemessene Fixierungsmethode entsprechend der Position der Acupoints¹⁵ausgewählt werden. Für Akupunkte am Bauch kann die Ratte nach unten in einen schwarzen Kegel gelegt werden (ähnlich einem Teigbeutel, der von Bäckern verwendet wird)¹⁷. Zur Fixier...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mm x 13.0 mm acupuncture needle	China Suzhou Medical Device Factory
Al(OH)3	American Thermo	77161
Compression nebulizer	Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd.	NB-212C
Fine Pointe V2.0	American Buxco
Laboratory gas drying unit	American Drierite	26800
Methacholine	American Sigma	MKCF6054
Ovalbumin	American Sigma	A5503-25G
Phosphate Buffer solution (1x)	Gelifesciences	SH30256.01
Seal box	IRIS Corporation of Japan
Whole-body plethysmography respiratory function measurement system	American Buxco