Иглоукалывание в крысиной модели астмы

Резюме

Высокая платформа может исправить крыс без ограничений и полностью подвергать acupoints на спине во время манипуляции иглоукалыванием. В этой статье описаны методы изготовления высокой платформы, устанавливается крысиная модель астмы и измеряется изменение дыхательной функции с помощью неинвазивной и в режиме реального времени системы плетисмографии всего тела (WBP).

Аннотация

Высокая платформа может исправить крыс без ограничений и полностью подвергать acupoints на спине во время манипуляции иглоукалыванием. В этой статье описаны методы изготовления высокой платформы, устанавливается крысиная модель астмы и измеряется изменение дыхательной функции с помощью неинвазивной и в режиме реального времени системы плетисмографии всего тела (WBP).

Введение

Астма является хроническим заболеванием, характеризующимся бронхоконструкцией и гипер-реакцией дыхательных путей¹. Приблизительно 339,4 миллиона человек во всем мире с диагнозом астма². Распространенность астмы растет во всем мире, с 100 миллионов новых случаев ожидается в следующем^{десятилетии 3}. Вдыхание кортикостероидов и длительного действия β_{2-агонисты}не эффективно контролировать симптомы всех пациентов⁴. Таким образом, использование альтернативных методов лечения, таких как иглоукалывание для лечения астмы получает повышенное внимание^5. Эффективным методом лечения астмы является игла GV14 (Дашуй), двусторонний BL12 (фэнмен) и двусторонний BL13 (Фейшу)^6. Иглоукалывание значительно снижает уровень секреторного иммуноглобулина А (SIgA) в слюне и носовых выделениях пациентов с аллергической астмой и уменьшает количество эозинофилов периферической крови с общей эффективной скоростью 85%^6. Иглоукалывание в BL13 и ST36 (Зусанли) у мышей с хронической астмой снижает уровень IL-17 на 40% и уменьшает гладкую толщину мышц на 33% по сравнению с группой овалбумина (OVA), и, таким образом, снятия^{симптомов воспаления 7,8}. Однако механизм лечения астмы иглоукалыванием не совсем ясен.

Модели животных являются важным инструментом для исследования^{астмы 9,} потому что модель животного может быть использована для непрерывного измерения дыхательной функции для оценки эффективности^{лечения астмы 10}. Между тем, исследования патофизиологии астмы требуют тестовых образцов, в том числе образцов из трахеи, легких и бронхоалвеолярной лаваж для проверки изменений в уровнях ключевых^{факторов 11}. Крысы модели астмы обычно используются для оценки астмы патофизиологии, потому что они производят долгосрочные реакции дыхательных путей и показать немедленной и поздней фазы дыхательных^{путей ответы 12}. Однако, из-за повторной экспериментальной стимуляции, крысы часто становятся раздражительными. Поэтому необходим подходящий метод фиксации крыс. Обычно используемые методы фиксации крыс включают анестезию и связывание¹³. Хотя метод анестезии обеспечивает лучшее воздействие акупойнтов, он может повлиять на проведение нерва и в конечном итоге повлиять на экспериментальные^{результаты 14}. Обязательный метод не вызывает те же физиологические эффекты, как анестезия, но сдержанные крысы будут испытывать напряжение скелетных мышц. Кроме того, игла не может легко достичь назначенного^{положения 15}. Здесь мы вводим высокую платформу, которая может быть использована для фиксации крыс, не ограничивая их и полностью подвергать acupoints на спине. Крысы могут быть размещены на высокой платформе во время введения иглоукалывания. Высокая платформа способна вместить крысу только в то время как она стоит, и, как она находится на определенном расстоянии от земли, крысы не будут двигаться из-за страха^{высоты 16}.

В этой статье подробно описывается изготовление высокой платформы, создание крысиной модели астмы, работа иголки крысы на высокой платформе и измерение дыхательной функции с помощью системы плетисмографии всего тела (WBP).

протокол

Все эксперименты на животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Шанхайского университета традиционной китайской медицины (этический номер разрешения P'SHUTCM190308020).

1. Изготовление высокой платформы

1. Установите длину и ширину вспомогательного устройства до 86 см x 17 см(рисунок 1).
2. Зафиксите соединивающее устройство вертикально к поддерживающее устройство. Соединительной устройства должно быть около 30 см в длину, чтобы предотвратить крысы от запуска на верхнюю поверхность высокой платформы и имеют ширину 14 см.
3. Зафиксите горизонтальную педаль (5 см х 5 см) к соединительной устройству. Подвесная высота в нижней части горизонтальной педали должна быть больше или равна 50 см.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества экспериментальных крыс, несколько горизонтальных педалей могут быть использованы, с одной крысы размещены на каждой педали.

2. Создание крысиной модели астмы

1. Сенсибилизация крыс с OVA
   1. Подготовь решение для сенсибилизации на 0-й день. Приготовьте каждый 1 мл раствора сенсибилизации с 1 мг OVA и 10 мг гидроксида алюминия, с нормальным солевым растворителем.
   2. Intraperitoneally вводить каждую крысу с 1 мл раствора сенсибилизации на день 0. Нарисуйте сенсибилизирующий раствор подходящим шприцем для более длительного использования.
   3. Возьмите хвост и поднимите крысу, поместите ее на шероховатую поверхность и аккуратно потяните хвост назад. Возьмите кожу обоих ушей и шеи с большим пальцем левой руки и указательным пальцем, плотно удерживая заднюю кожу с оставшимися тремя пальцами и ладонями (будьте осторожны, чтобы воздержаться от применения избыточной силы, которая задушит крысу).
   4. Правой рукой выполнить внутриперитонеавную инъекцию крысы с помощью подготовленного шприца с 1 мл раствора сенсибилизации.
2. Сложные крысы с OVA
   1. Выберите коробку с крышкой (длина, ширина и высота 39 см х 28 см х 23 см), и просверлите небольшое отверстие в стороне. Соедините запечатанную коробку, небуляривную чашку и компрессионную небулайзер с резиновойтрубкой (дополнительная цифра 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер небулированных частиц сжатого небулайзера составляет 1 - 5 мкм, скорость небулизации превышает 0,2 мл/мин, а конечное давление составляет 205 кПа.
   2. На 14-й день после сенсибилизации откройте крышку самодельного запечатанного ящика и поместите крысу в коробку (коробка может вместить 5 крыс), а затем положите запечатанную коробку в шкаф для биобезопасности.
   3. Подготовь решение проблемы. Тщательно смешайте 300 мг OVA с 30 мл нормального солевого раствора.
   4. Включите ультразвуковой небулайзер и добавьте 30 мл раствора вызова в небулирующую чашку. Отрегулируйте дозировку раствора вызова и количество крыс в зависимости от объема самодельной герметичной коробки.
   5. Повторите небулизацию несколько раз (один раз в день) или отрегулируйте процедуру в зависимости от тяжести симптомов астмы.

3. Лечение иглоукалыванием

1. Выберите acupoints, в том числе GV14, двусторонний BL12 и двусторонний BL13, в соответствии с теорией традиционной китайской медицины для лечения астмы(Дополнительный рисунок 2). Администрирование ручной иглоукалывание на второй день и выполнять один раз в день в общей сложности 7 сессий (Рисунок 2).
   1. Иглоукалывание GV14 расположен между седьмым шейным позвонком и первым грудным позвонком (полость лопатки), на средней линииспины (рисунок 3).
   2. Иглоукалывание BL13 расположен ниже третьего грудного позвонка, по обе стороны межреберных пространств (нижний край лопатки).
   3. Иглоукалывание BL12 расположен ниже второго грудного позвонка, по обе стороны межреберных пространств (ниже лопатки, положение, идентифицировано в соответствии с BL13).
2. Возьмитесь за крыс и поместите их на высокую платформу.
3. Держите одноразовую иглу из нержавеющей стали (0,3 мм х 13,0 мм, дополнительный рисунок 3) ручку большим и указательным пальцем правой руки, и нажмите на заднюю часть крысы ладонью правой руки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Одноразовые иглы должны быть только одноразового использования. Потому что повторное использование будет притупить иглу, что приводит к увеличению боли у крыс.
4. Коснитесь депрессии в середине верхнего края (GV14) или нижнего края лопатки (BL12 и BL13), а затем осторожно колоть кожу крысы кончиком иглы, чтобы найти acupoints.
5. Быстро вставьте иглу после определения конкретного местоположения акупойнт и быстро удалите правую руку.
6. Равномерно скрученные иглы примерно 360 "со скоростью 60 раз/мин в течение 10 - 20 с, манипулировать ими каждые 5 минут, а затем снять их после 20 - 30 мин (Дополнительный рисунок 4).

4. Измерение Пена

1. Подготовка метахолина: Поместите 100 мг метахолина в 5 мл центрифуги трубки и добавить PBS к объему 2 мл (50 мг/мл метахолина). Затем разбавьте раствор метахолина 50 мг/мл до 25 мг/мл, 12,5 мг/мл, 6,25 мг/мл и 3,125 мг/мл.
2. Инспекция приборов
   1. Включите усилитель сигнала (система распределения аэрозолей и система подачи потока грызунов отключены, а разъем небулизации закрыт).
   2. Проверьте каналы: Нажмите Калибруйте,верните базовую линию грубой регулировки до 0 и переключитесь на положение прямого тока (DC). Отладить базовый уровень до 0 и впрыснуть 5 мл газа шприцем. Затем переключитесь на положение переменного тока (AC).
   3. После проверки каналов убедитесь, что значение ошибки составляет менее 0,5%.
3. Установка параметров
   1. Включите систему распределения аэрозолей и систему подачи потока грызунов. Отрегулируйте скорость потока до 4,5 мл в зависимости от уровня жидкости на ртутном шаре.
   2. Нажмите Создать Варианты исследования и выберите Доза Ответ Исследование, выберите Крыса видов и нажмите Далее.
   3. Выберите простой списокдоз, установите количество доз до 6 и нажмите Далее.
   4. Выберите параметры Penh и Area: Установите время адаптации животных до 5 минут, время небулизации до 2 минут, время отклика до 3 минут, и время восстановления до 2 минут.
   5. Последовательно добавляйте в небулайзер следующие растворы (200 л на крысу): метахолин (0 мг/мл, 3,125 мг/мл, 6,25 мг/мл, 12,5 мг/мл, 25 мг/мл и 50 мг/мл). Изменения в режиме реального времени в Пен можно наблюдать(рисунок 4).
   6. После того, как все 6 решений с различными концентрациями были прореагированы, нажмите Файл и Конец сессии для завершения эксперимента.

Результаты

С иглоукалыванием на GV14, двусторонних BL12 и двусторонних bl13 точек, крыса сохраняет склонную позицию. Крыса может крутить головой только снаружи, а не изнутри, потому что одно направление блокируется деревянной доской(рисунок 5).

По мере увеличения концентр?...

Обсуждение

GV14, двусторонний BL12 и двусторонние acu3 Acupoints BL13, используемые в этом исследовании, расположены на задней стороне, и, таким образом, высокая платформа подходит для фиксации крыс. В других исследованиях, адекватный метод фиксации должны быть выбраны в зависимости от положения acupoints

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mm x 13.0 mm acupuncture needle	China Suzhou Medical Device Factory
Al(OH)3	American Thermo	77161
Compression nebulizer	Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd.	NB-212C
Fine Pointe V2.0	American Buxco
Laboratory gas drying unit	American Drierite	26800
Methacholine	American Sigma	MKCF6054
Ovalbumin	American Sigma	A5503-25G
Phosphate Buffer solution (1x)	Gelifesciences	SH30256.01
Seal box	IRIS Corporation of Japan
Whole-body plethysmography respiratory function measurement system	American Buxco